王欣雅，吉木色，甘秋蘭，黎千榕，張尚文，胡 婕，文治杰，胡 燕

(1．中南民族大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430074； 2．中南民族大學(xué)民族藥學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，湖北 武漢 430074)

1 引 言

水凝膠(hydrogels)是一種能在水中溶脹，并能保持三維立體結(jié)構(gòu)的聚合物材料[1-2]。其具有良好的溶脹性能和物理機(jī)械性能，在組織工程骨架材料、藥物載體材料、3D打印材料等多方面均有重要的應(yīng)用[3-4]。

海藻酸鈉(sodium alginate, SA)，由M單元(β-D-甘露糖醛酸)和G單元(α-L-古羅糖醛酸)殘基按1,4鍵連接而組成[5]，如圖1所示。易與二價陽離子如Ca2+發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，形成的水凝膠具有良好的生物相容性、生物活性和可降解性[6-7]。但在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，單一的SA水凝膠在腸道弱堿性環(huán)境中結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易瓦解，限制了其在口服藥物輸送方面的應(yīng)用。

殼聚糖(chitosan, CS)廣泛存在于甲殼類動物的外殼中，是大自然中除纖維素外豐度最大的一種堿性多糖[8-9]，如圖2所示。CS分子中存在很強的氫鍵作用，使其存在溶解性差、透光度低等缺點，一定程度上限制了其應(yīng)用范圍[10-11]。羧化殼聚糖(carboxylated chitosan, CMCS)是由CS羧甲基化得到，是CS最重要的衍生物之一，具有優(yōu)良的乳化性、成膜性、保濕性等特點[12]，在醫(yī)藥領(lǐng)域常被用為藥物載體材料[13]，也是制備水凝膠的常用材料。

圖1 SA的分子結(jié)構(gòu)Fig. 1 Molecular structure of SA

圖2 CS的分子結(jié)構(gòu)Fig. 2 Molecular structure of CS

本實驗以價廉易得的SA和CS為原料，利用高碘酸鈉氧化SA引入醛基與CS的水溶性衍生物CMCS形成共價鍵進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，同時將SA和鈣離子進(jìn)行物理交聯(lián)形成互穿網(wǎng)絡(luò)，外層再以復(fù)凝聚法形成聚電解質(zhì)緩釋膜，通過整合SA和CS及其衍生物的性能優(yōu)點，以克服單一SA水凝膠突釋漏釋及網(wǎng)絡(luò)易瓦解的缺陷，從而得到一種新型的穩(wěn)定性佳、修飾性良好的緩釋載藥體系。由于制備原料都具有環(huán)境敏感基團(tuán)，決定了形成的復(fù)合水凝膠具有良好的pH敏感性[14-15]。根據(jù)其特點，擬通過模擬胃腸道口服給藥的方式，依據(jù)其對pH值的敏感度調(diào)節(jié)該水凝膠對各藥物的釋放速率，從而達(dá)到定位緩控釋的目的。

2 實 驗

2.1 原料

試驗原料為化學(xué)純的海藻酸鈉(SA)；食用級殼聚糖(CS)(MW=1×105)；分析純的羧化殼聚糖(CMCS)、無水氯化鈣、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、氫氧化鈉(NaOH)、冰醋酸、牛血清白蛋白(BSA)、考馬斯亮藍(lán)G-250、吲哚美辛和鹽酸二甲雙胍；85%濃鹽酸(HCl)和磷酸(H3PO4)。

2.2 復(fù)合水凝膠的制備

稱取10 g SA加入到100 mL 50%乙醇溶液中，待完全分散均勻后加入3 g高碘酸鈉，室溫避光攪拌6 h，加入5 mL乙二醇后反應(yīng)0.5 h終止氧化反應(yīng)。將反應(yīng)后的溶液裝入透析袋(Cut off Mw=8000～14000)中，用蒸餾水透析72 h。高碘酸鈉氧化SA的反應(yīng)機(jī)制如圖3所示。抽濾后將濾液進(jìn)行濃縮，將濃縮液放入-80 ℃冰箱中預(yù)凍12 h，冷凍干燥，即得氧化海藻酸鈉(OSA)。

圖3 SA的氧化反應(yīng)Fig. 3 Oxidation of SA

稱取一定量的OSA、SA、CMCS溶于裝有蒸餾水的圓底燒瓶中，攪拌至溶解。用滴制法將混合溶液滴加到0.2 mol/L CaCl2溶液中，攪拌30～50 min，得到球形凝膠珠。將凝膠珠轉(zhuǎn)移至CS溶液中交聯(lián)，用去離子水洗滌3次后，吸水紙拭去凝膠珠表面殘留的水分，置于塑料板上室溫風(fēng)干即得復(fù)合水凝膠，其制備原理如圖4所示。

圖4 復(fù)合水凝膠制備原理圖Fig. 4 Preparation mechanism of the composite hydrogels

2.3 復(fù)合水凝膠的結(jié)構(gòu)表征

用數(shù)碼相機(jī)記錄新鮮制備、室溫干燥及溶脹后三種狀態(tài)下凝膠珠的外部形貌。

取冷凍干燥后水凝膠樣品，采用JEOL JSM-6700F型掃描電鏡(SEM)觀察水凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

取冷凍干燥后水凝膠樣品置于紅外燈下干燥，按1∶99與溴化鉀混合，研磨后壓片，制得透明試樣薄片，將此片放入Spectrum One, Perkin Elmer型紅外光譜儀(FTIR)的樣品池中，以4000～400 cm-1為范圍進(jìn)行波數(shù)掃描，得到紅外吸收光譜。

取冷凍干燥后水凝膠樣品通過TG 209F3型熱重分析儀(TG)進(jìn)行熱穩(wěn)定性分析，以10 ℃/min 的升溫速率，從40 ℃升溫至500 ℃得到熱重曲線。

取冷凍干燥后水凝膠樣品，采用X’Pert PRO 型X射線衍射儀(XRD)測定冷凍干燥后水凝膠樣各個樣品的晶型結(jié)構(gòu)。電壓為40 kV，掃描速度為1 °/min，衍射角2θ=4～40°。

2.4 復(fù)合水凝膠的溶脹度測試

稱取一定質(zhì)量室溫干燥后的水凝膠樣品，37 ℃水浴中，前2 h放于模擬胃液(SGF，pH=1.2)，后換為模擬腸液(SIF，pH=7.4)，每30 min記錄一次質(zhì)量，直至凝膠的質(zhì)量不再變化，按式(1)計算溶脹率(SR)。

SR=(mt-m0)/m0

(1)

式中：mt為各時間點凝膠珠的質(zhì)量，m0為干燥的凝膠珠的質(zhì)量。

2.5 復(fù)合水凝膠的載藥與釋藥測試

分別以大分子蛋白類藥物牛血清白蛋白(BSA)，小分子水溶性藥物鹽酸二甲雙胍(MH)，及小分子水不溶性藥物吲哚美辛(IDM)為模型藥物，探索了復(fù)合水凝膠的載藥與釋藥行為。載藥具體方法如下：稱取一定質(zhì)量的藥物溶于裝有去離子水(IDM為乙醇水溶液，無水乙醇：水的比例為1∶1)，待完全溶解后(藥物濃度為10 mg/mL)，加入OSA，SA與CMCS，攪拌均勻后按照2.2.2項同法制備載藥水凝膠。

在模擬胃腸液中研究復(fù)合水凝膠的釋藥行為。稱取一定質(zhì)量室溫干燥后的水凝膠置于錐形瓶中，加入50 mL SGF溶液，37 ℃，80 rpm的條件下進(jìn)行試驗，每隔0.5 h取樣1 mL，同時補充1 mL SGF溶液，2 h后換為SIF溶液，按相同的方法進(jìn)行取樣。

以BSA為模型藥物，利用Bradford法，將取出的樣品按一定比例用考馬斯亮藍(lán)染液進(jìn)行染色，于595 nm波長下進(jìn)行紫外檢測。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算BSA含量。用時間與累積釋藥率繪圖，即得到BSA的釋放曲線。

以MH和IDM為模型藥物時，分別在233和320 nm波長下進(jìn)行紫外檢測并計算釋藥量，同樣繪制釋藥曲線。

累積釋藥率(Qn)按下式進(jìn)行計算：

Qn(%)=[V0Cn+V∑C(n-1)]/W×100%

(2)

式中，Cn為第n次取樣時樣液中藥物濃度(μg/mL)，V為每次取樣體積，本實驗中為1 mL，V0為釋藥介質(zhì)體積，本實驗為50 mL，W為載藥量(μg)。

3 結(jié)果與討論

3.1 復(fù)合水凝膠的表征

新鮮制備的水凝膠為淺黃色球狀，直徑約為5 mm(圖5a)。凝膠室溫干燥后脫去大量水分，顏色變深，體積明顯縮小至2 mm左右(圖5b)。溶脹后的凝膠外部顏色逐漸變淺，直徑約8 mm，隨著溶脹時間的延長，凝膠外層結(jié)構(gòu)開始瓦解，但凝膠內(nèi)部并未完全溶脹，結(jié)構(gòu)保持完整，如圖5c所示。

圖5 復(fù)合水凝膠 (a.新鮮狀態(tài)；b.干燥狀態(tài)和c.溶脹狀態(tài))的外觀形貌照片F(xiàn)ig. 5 Morphologies of composite hydrogels in different state. (a. in fresh state; b. in dried state; c. in swollen state)

圖6為復(fù)合水凝膠在不同放大倍數(shù)下的SEM照片，從圖6a可以看出凝膠內(nèi)部的結(jié)構(gòu)很不規(guī)則，部分區(qū)域成片層狀；圖6b、c可以看出凝膠內(nèi)部的空間很大并且形成了孔洞結(jié)構(gòu)。但孔洞較大，對藥物的釋放會有一定的阻滯作用，特別是對于大分子藥物的釋放會有很好的緩釋作用。

圖6 不同放大倍數(shù)(a×30；b×45；c×100)下復(fù)合水凝膠的掃描電鏡照片F(xiàn)ig. 6 SEM images of composite hydrogels with different magnification (a×30；b×45；c×100)

從圖7可見，CMCS在3464 cm-1處是-NH和-OH的伸縮振動重疊，2946 cm-1處為-CH2的伸縮振動，1658 cm-1處是C=O的伸縮振動峰[16]。SA在3417 cm-1處的吸收峰屬于O-H的伸縮振動峰，2929 cm-1處為SA大分子六元環(huán)上C-H鍵的伸縮振動峰，1610和1417 cm-1處的吸收峰分別歸屬于海藻酸的COO-的對稱伸縮振動和不對稱伸縮振動，1032 cm-1處對應(yīng)于拉伸的糖醛酸G鏈和M鏈的-C-O振動吸收峰。復(fù)合水凝膠在接近1653 cm-1處的吸收峰可歸屬為-C=N-的伸縮振動，說明OSA與CMCS發(fā)生了化學(xué)交聯(lián)[17]。

圖7 復(fù)合水凝膠的紅外光譜圖Fig. 7 FTIR spectra of the composite hydrogels

圖8(a)為復(fù)合水凝膠質(zhì)量隨溫度的失重累積量，圖8(b)為熱重曲線對溫度的一階導(dǎo)數(shù)曲線，即試樣隨溫度的質(zhì)量變化率。凝膠樣品中含有自由水、中間水和結(jié)合水，升溫導(dǎo)致凝膠樣品的質(zhì)量逐漸下降。從圖可見，OSA在200～280 ℃之間出現(xiàn)明顯失重、CMCS在220～450 ℃范圍內(nèi)出現(xiàn)明顯失重，且失重速率較快；OSA-CMCS復(fù)合水凝膠在200～350 ℃之間出現(xiàn)明顯失重，且失重速率緩慢。這說明OSA-CMCS復(fù)合水凝膠的熱穩(wěn)定性較原料OSA、CMCS有所提高。

復(fù)合水凝膠的XRD圖譜見圖9。從圖可見，SA在14°處出現(xiàn)明顯的衍射峰，CS在20°處出現(xiàn)明顯的衍射峰，CMCS在20°處也出現(xiàn)明顯的衍射峰，說明制備復(fù)合水凝膠的三種原料SA、CMCS、CS均具有晶形結(jié)構(gòu)，而復(fù)合水凝膠的XRD曲線并未出現(xiàn)尖銳的衍射峰，說明制備的復(fù)合水凝膠由于物理和化學(xué)交聯(lián)作用的發(fā)生，無定型結(jié)構(gòu)增加。

3.2 復(fù)合水凝膠的溶脹性能探究

圖10(a)中溶脹率隨CMCS的濃度呈現(xiàn)線性變化。其中，1%CMCS的溶脹率最大，可達(dá)32，但其達(dá)到最大溶脹率后迅速下降，凝膠的穩(wěn)定性較同組其他樣品較差；綜合考慮溶脹率和溶脹時間等因素，得出3% CMCS凝膠溶脹行為最佳，其最大溶脹率可達(dá)30，溶脹時間達(dá)8 h。圖10(b)中前5 h凝膠的最大溶脹率隨OSA的濃度呈現(xiàn)規(guī)律性變化。其中，當(dāng)OSA濃度為2%時，復(fù)合水凝膠的平衡溶脹率最大，7 h時達(dá)到17后緩慢下降。圖10(c)中，當(dāng)OSA∶SA的比例為1∶1時，復(fù)合水凝膠在7 h時達(dá)到最大溶脹率32。

圖8 復(fù)合水凝膠的熱重分析圖 (a)熱重曲線；(b)微分熱重曲線Fig. 8 TG curve (a) and DTG curve (b) of OSA, CMCS, and the composite hydrogels

圖9 復(fù)合水凝膠的X射線衍射圖Fig. 9 X-ray diffraction patterns of the composite hydrogels

在SGF溶液中，由于溶液中H+的擴(kuò)散作用，CS中的氨基發(fā)生質(zhì)子化，水凝膠球表面帶正電荷，SA中以-COOH形式存在，所以水分子滲透作用不明顯，在SGF中普遍最大溶脹率僅有1.5左右。但置于SIF溶液后，環(huán)境成弱堿性，SA分子中的-COOH以-COO-形式存在，基團(tuán)之間的作用力增強，凝膠內(nèi)部空間變大，從而溶脹率大大增加。

從圖11(a)中可以看出隨著CS濃度的增加，復(fù)合水凝膠的最大溶脹率也隨之增加，這是因為CS濃度增加，凝膠表面與SA作用的CS分子增加，形成了更穩(wěn)固的CS膜，在溶脹過程中能有效保護(hù)水凝膠結(jié)構(gòu)的完整性，從而提高水凝膠的最大溶脹率，可達(dá)33左右。圖11(b)中，成膜時間為60 min時，水凝膠溶脹行為最佳，平衡溶脹率最大。所制得的水凝膠中，溶脹率最大可達(dá)33.59。

圖10 不同組成的復(fù)合水凝膠的溶脹曲線圖 (a) 不同的CMCS濃度； (b) 不同的OSA的濃度； (c) 不同的OSA和SA配比Fig. 10 Swelling profiles of composite hydrogels with different composition (a) different CMCS concentration; (b) different OSA concentration; (c) different feed ratio of OSA to SA

圖11 不同制備條件下的復(fù)合水凝膠的溶脹曲線圖 (a) 不同的成膜濃度; (b) 不同成膜時間Fig. 11 Swelling profiles of composite hydrogels in different preparation condition. (a) the membrane preparation by different CS concentrations; (b) the different membrane formation time

3.3 復(fù)合水凝膠的藥物釋放行為研究

3.3.1載不同藥物的復(fù)合水凝膠釋藥行為 圖12分別為以2%、3% OSA為原料制備的復(fù)合水凝膠對不同藥物的累積釋藥曲線。從圖12(a)可以看出當(dāng)OSA濃度為3%時，水凝膠在SGF中對BSA的累計釋放率極低，低于1%，當(dāng)改變OSA濃度為2%時，BSA在SGF中的累計釋放率達(dá)10%。從圖12(b)可以看出，OSA濃度的改變對MH的釋放行為影響不大。從圖12(c)可以看出，兩條釋放曲線在SGF中基本重合，并且釋藥緩慢。綜合上述情況，最終選擇當(dāng)OSA的濃度為3%時進(jìn)一步比較復(fù)合水凝膠對不同類型藥物的釋藥行為。

圖12 復(fù)合水凝膠的累積釋藥曲線圖(a) BSA; (b) MH; (c) IDMFig. 12 Cumulative drug release curve of the composite hydrogels (a) BSA; (b) MH; (c) IDM

圖13 復(fù)合水凝膠的釋藥曲線對比圖Fig. 13 Comparison of the drug release curve of the composite hydrogels

3.3.2載不同藥物復(fù)合水凝膠釋藥行為對比 圖13為載三種不同藥物的復(fù)合水凝膠的釋藥曲線。從圖可見，BSA從凝膠孔隙中緩慢釋放，此凝膠體系對BSA有明顯的緩釋作用，7 h左右釋藥率約為50%。MH從凝膠孔隙中釋放較快，0.5 h左右釋藥率已超過50%，說明此凝膠體系對MH的緩釋作用不太明顯。IDM從凝膠孔隙中釋放較緩慢，4 h左右釋藥率為50%，說明此凝膠體系對IDM有一定的緩釋作用。研究結(jié)果表明，該復(fù)合水凝膠對大分子蛋白質(zhì)類藥物及小分子疏水性藥物均有一定的緩釋效果。

4 結(jié) 論

本實驗通過物理交聯(lián)，化學(xué)交聯(lián)以及聚電解質(zhì)復(fù)合凝聚法制備了具有 pH 敏感性的膜控型IPN結(jié)構(gòu)復(fù)合水凝膠，并考察了該水凝膠在模擬胃腸道中的溶脹率與釋藥性能。所制得的水凝膠最大溶脹率可達(dá)33.59,且對大分子蛋白類藥物顯示出了較好的緩釋作用。由于本復(fù)合凝膠系統(tǒng)具有IPN結(jié)構(gòu)，同時外層具有聚電解質(zhì)膜的修飾，因此該復(fù)合凝膠系統(tǒng)有助于克服了單一結(jié)構(gòu)水凝膠在藥物輸送中的弊端，從而增強了水凝膠體系的穩(wěn)定性及藥物緩釋性能。該復(fù)合凝膠制備方法簡單溫和，在作為大分子藥物緩控釋輸送載體方面具有潛在的應(yīng)用前景。