屈相玲 韓云霞 熊成歡 晏英 代欣 高永躍 周訓(xùn)蓉△

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550003；2. 醫(yī)院制劑研發(fā)中心，貴州 貴陽(yáng) 550003；3. 醫(yī)院中藥制劑研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550003； 4. 貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550004)

復(fù)方五藤散是由大血藤、雞血藤、首烏藤、雷公藤、黑骨藤、麻黃、千里光、皂角刺、紅花等22味中藥研磨混合制成的散劑,具有通絡(luò)、止痛祛風(fēng)濕之功效，臨床用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎等[1]。為了在臨床基礎(chǔ)上對(duì)制劑質(zhì)量進(jìn)行控制，本研究建立復(fù)方五藤散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用薄層色譜法(TLC)對(duì)制劑中大血藤、雞血藤、首烏藤進(jìn)行定性鑒別，采用HPLC同時(shí)測(cè)定制劑中雷公藤甲素、杠柳毒苷的含量，為提高復(fù)方五藤散整體質(zhì)量控制方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 大血藤對(duì)照藥材(批號(hào)：121353～201704)、雞血藤對(duì)照藥材(批號(hào)：121173～201805)、首烏藤對(duì)照藥材(批號(hào)：120939～201507)、雷公藤甲素對(duì)照品 (20 mg，批號(hào)111567～201404)、杠柳毒苷對(duì)照品(20 mg，批號(hào)111793～200901)均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，硅膠G 薄層板(青島海洋化工廠)；乙腈、磷酸(色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)，水(純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán))。2010 型高效液相色譜儀(日本島津公司)；BSA124S電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，SG8200HE超聲波清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司)，SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工有限責(zé)任公司)， FA180S十萬(wàn)分之一天平(上海精密儀器儀表有限公司)。

1.2試藥 復(fù)方五藤散樣品由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院制備(批號(hào)：20181220、20181221、20181222)，處方飲片(貴州同濟(jì)堂中藥飲片有限公司提供)，陰性樣品自制。

1.3薄層色譜定性鑒別方法

1.3.1大血藤的薄層鑒別[2-3]取復(fù)方五藤散5 g，加甲醇50 mL超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)? % 氫氧化鈉溶液10 mL使溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2，用乙醚振搖提取3次，10 mL/次，合并乙醚液，揮干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取大血藤對(duì)照藥材2 g，缺大血藤陰性制劑同法制備，作為對(duì)照藥材溶液和陰性對(duì)照溶液。照《中國(guó)藥典》2015年版四部薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷—丙酮—甲酸(40∶1∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，立即噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。

1.3.2雞血藤的薄層鑒別[4]取復(fù)方五藤散2 g，加乙醇40 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用乙酸乙酯10 mL振搖提取，乙酸乙酯液揮干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取雞血藤對(duì)照藥材2 g，缺雞血藤陰性制劑同法制備，作為對(duì)照藥材溶液和陰性對(duì)照溶液。吸取上述溶液5～10 μL、分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷—甲醇—甲酸(40∶10∶1)為展開(kāi)劑，其余操作同“1.3.1”。

1.3.3首烏藤的薄層鑒別 取復(fù)方五藤散0.25 g，加乙醇50 mL，加熱回流1 h，濾過(guò)，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液。另取首烏藤對(duì)照藥材2 g，缺首烏藤陰性制劑同法制備，作為對(duì)照藥材溶液和陰性對(duì)照溶液。吸取上述溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60℃)—乙酸乙酯—甲酸(18∶6∶1)的上層溶液為展開(kāi)劑[5]，其余操作同“1.3.1”。

1.4含量測(cè)定 HPLC 同時(shí)測(cè)定雷公藤甲素、杠柳毒苷的含量。色譜條件[6-9]：色譜柱 Welch Ultimate X8-C18(250×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.05%磷酸溶液(B)，梯度洗脫，0～20 min，20%A，20～40 min，20%→80%A；40～45 min，80%→100%A；45～50 min，100%→20%A；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備：稱(chēng)取雷公藤甲素對(duì)照品2.8 mg、杠柳毒苷對(duì)照品3.4 mg，分別置50 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解并至刻度，搖勻，配成0.056 mg/mL的雷公藤甲素儲(chǔ)備液，0.068 mg/mL的杠柳毒苷儲(chǔ)備液。供試品溶液的制備：取復(fù)方五藤散14.5 g，精密稱(chēng)定，置圓底燒瓶中，加入70%甲醇加熱回流3次后定容至1 000 mL，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。陰性對(duì)照溶液的制備:按處方取除雷公藤及黑骨藤的各味藥材，按處方量配制雷公藤和黑骨藤陰性制劑，按“供試品溶液的制備”方法分別制得雷公藤和黑骨藤陰性對(duì)照溶液。分別對(duì)復(fù)方五藤散含量測(cè)定方法的系統(tǒng)適用性、線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率試驗(yàn)、樣品含量測(cè)定進(jìn)行分析，以驗(yàn)證分析方法的可靠性。

2 結(jié) 果

2.1薄層色譜方法考察 大血藤在供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯同顏色的斑點(diǎn)，且陰性供試品溶液無(wú)干擾。雞血藤在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性供試品溶液無(wú)干擾。首烏藤在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯同顏色的斑點(diǎn)，且陰性供試品溶液無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

注：1.大血藤對(duì)照藥材；2、3、4.三批次五藤散制劑樣品(批號(hào)：20181220、20181221、20181222)；5.缺大血藤制劑樣品；6.雞血藤對(duì)照藥材;7、8、9.三批次五藤散制劑樣品(批號(hào)：20181220、20181221、20181222);10.缺雞血藤制劑樣品；11.首烏藤對(duì)照藥材;12、13、14.三批次五藤散制劑樣品(批號(hào)：20181220、20181221、20181222)；15.缺首烏藤制劑樣品。圖1 薄層色譜圖

2.2含量測(cè)定方法考察

2.2.1系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照品溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，供試品溶液中2種成分分離較好，且陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾。見(jiàn)圖2。

注：A.混合對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.雷公藤和黑骨藤陰性供試品溶液；1.雷公藤甲素；2.杠柳毒苷。圖2 復(fù)方五藤散HPLC色譜圖

2.2.2線性關(guān)系考察 分別精密量取雷公藤甲素儲(chǔ)備液0.3、0.5、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，杠柳毒苷儲(chǔ)備液3、5、8、10、12、14 mL分別置20 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解并至刻度，搖勻，制得系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取上述混合對(duì)照品各10 μL，按色譜條件測(cè)定峰面積，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程分別為：Y雷公藤甲素=215 431 6X+394 70，R2=1；Y杠柳毒苷=149 367 5X+ 808 50，R2=0.999 6，結(jié)果表明，雷公藤甲素和杠柳毒苷在0.000 84～0.003 92 μg和 0.010 2～0.047 6 μg，范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.3儀器精密度試驗(yàn) 精密量取同一對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰面積計(jì)算雷公藤甲素、杠柳毒苷RSD值為0.12%和0.19%，儀器精密度良好。

2.2.4重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品，按供試品制備方法制備供試品溶液，在色譜條件下進(jìn)樣分析。計(jì)算雷公藤甲素和杠柳毒苷含量的RSD值分別為2.04%和2.24%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.5穩(wěn)定性試驗(yàn) 取室溫下放置的同一份供試品溶液分別于0、2、4、6、8和12 h 進(jìn)樣分析，計(jì)算雷公藤甲素和杠柳毒苷峰面積的RSD值分別為1.05%和1.44%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品(批號(hào)：20181220)，分別精密加入雷公藤甲素和杠柳毒苷對(duì)照品溶液，按供試品制備方法制備供試品溶液，在色譜條件下測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果雷公藤甲素平均回收率為100.2%，RSD=0.64%；杠柳毒苷平均回收率為100.63%，RSD=2.04%。 見(jiàn)表1。

表1 兩種化合物的加樣回收率結(jié)果(n=6)

2.2.7樣品含量測(cè)定 取3個(gè)不同批次的樣品(批號(hào)：20181220、20181221、20181222)，按供試品制備方法方法制備供試品溶液，在色譜條件測(cè)定峰面積計(jì)算樣品含量，雷公藤甲素和杠柳毒苷的平均含量分別為0.011 3 mg/g和0.18 mg/g。

3 討 論

血藤清熱解毒、活血祛風(fēng)、止痛；雞血藤祛風(fēng)活血、舒筋活絡(luò)；首烏藤養(yǎng)血安神、祛風(fēng)通絡(luò)；雷公藤祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)、消腫止痛；黑骨藤活血通經(jīng)，祛風(fēng)除濕；五者合為君藥，其中雷公藤甲素為雷公藤的指標(biāo)成分[10]，杠柳毒苷為黑骨藤的指標(biāo)成分[11]。本實(shí)驗(yàn)按照《中國(guó)藥典》(2015 年版一部)對(duì)大血藤、雞血藤、首烏藤進(jìn)行定性分析。在雷公藤甲素和杠柳毒苷的同時(shí)測(cè)定中，選擇了熱回流提取2 h。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，熱回流提取2 h效果最好。建立HPLC 同時(shí)測(cè)定雷公藤甲素和杠柳毒苷的含量，考察210 nm 及230 nm 下出峰情況，在兩種檢測(cè)波長(zhǎng)下2個(gè)色譜峰均達(dá)到較好分離，相比230 nm，210 nm 處檢測(cè)到的雷公藤甲素和杠柳毒苷峰面積值增大，因此本研究建立含量測(cè)定方法檢測(cè)波長(zhǎng)定為210 nm。