王永剛，阮建平，周 靜，田劍剛，黃瑞哲，高江紅

(1. 陜西省牙頜面疾病臨床研究中心，西安交通大學口腔醫(yī)院口腔預防保健科，陜西西安 710004；2. 山東省東營市人民醫(yī)院口腔科，山東東營 257091)

鈣是人體必需元素之一，牙釉質中的鈣含量高達95%～96%。鈣離子(Ca2+)參與釉質礦化，是釉質發(fā)育礦化過程中的重要元素[1]。

釉質發(fā)育不全是釉質發(fā)育中受到某些全身性或局部性因素的影響而出現的釉質結構及礦化不全，機體鈣攝入不足是釉質發(fā)育不全的原因之一。有研究顯示，低鈣飲食可導致大鼠牙釉質礦化程度顯著降低[2]，還可以促進氟斑牙的發(fā)生[3]。EKAMBARAM等[4]發(fā)現，血漿鈣與血漿氟濃度二者間存在負相關，高鈣減輕氟中毒癥狀，低鈣則加劇氟中毒。低鈣還可通過加重氟中毒時細胞內的鈣超載，從而加重氟骨癥[5]。

不同濃度Ca2+作用于細胞可引起細胞增殖、凋亡等生物學特性的改變。低濃度Ca2+可引起成骨細胞增殖活力增加，高濃度Ca2+可導致成骨細胞凋亡[6]。增加培養(yǎng)基中Ca2+濃度，人牙髓細胞的增殖活性降低[7]。牙釉質是在成釉細胞調控下形成、礦化，釉質的礦化伴隨著成釉細胞的分化及生物學特性的變化[8]。DENBESTEN等[9]研究發(fā)現，無鈣KGM-2培養(yǎng)基中加入20～100 mL/L血清時，體外培養(yǎng)的細胞主要是星形的成纖維樣細胞和卵圓形細胞，而當培養(yǎng)基中加入0.05 mmoL/L Ca2+，卵圓形的細胞選擇性生長。然而，低鈣對原代成釉細胞增殖、凋亡及分化的影響文獻報道較少，尚需進一步實驗驗證。

本研究擬對體外培養(yǎng)的原代大鼠成釉細胞加入不同濃度的低水平的鈣，觀察成釉細胞形態(tài)、增殖、凋亡及分化的變化，探討低鈣在釉質發(fā)育中的分子生物學作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑出生4 d的SD大鼠購自西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心，雌雄不限，經西安交通大學口腔醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準。標準DMEM培養(yǎng)基(美國，HycLone)；胎牛血清(浙江天杭生物科技公司)；胰酶、膠原酶、明膠(美國，Sigma)；無鈣DMEM培養(yǎng)基(美國，US Biology)；蘇木精，伊紅(成都格雷西亞化學技術有限公司)；CaCl2分析純，多聚甲醛(北京化工廠)；FAST200 RNA 提取試劑盒(上海先鋒生物)；反轉錄試劑盒(立陶宛，Fermentas)；釉原蛋白一抗(美國，Abcam)，DAB顯色試劑盒(武漢，博士德)；MTT(上海研生生化試劑有限公司)；SYBR Premix ExTaqTMⅡ PCR試劑盒(天津，TaKaRa公司)；酶標分析儀(上海益聯AT-858)；流式細胞儀(美國，B-D公司)；IQ5實時定量PCR儀(美國，Bio-RAD)。

1.2 含不同濃度Ca2+DMEM培養(yǎng)基的配制取無鈣DMEM干粉培養(yǎng)基，溶于雙蒸水，0.22 μm濾器過濾，加入CaCl2，用電解質分析儀對培養(yǎng)基中的Ca2+濃度進行測定，使Ca2+濃度分別為0、0.6、1.2 mmoL/L。

1.3 原代SD大鼠成釉細胞培養(yǎng)出生4 d SD大鼠4只，斷頸處死，取頭部，750 mL/L乙醇浸泡10 min。分離上、下頜磨牙牙胚，含10 mL/L雙抗的PBS清洗3遍，加入2.5 g/L的Ⅰ型膠原酶，剪碎后轉入離心管中，37 ℃下50 r/min搖床上消化1 h，轉入培養(yǎng)皿，37 ℃恒溫孵育箱繼續(xù)消化1 h后，小心吸取上層消化液并棄之。加入2.5 g/L胰酶分次消化，于37 ℃恒溫孵育箱內消化5 min，吸取上清置于預先加入含150 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液的離心管中，消化5次，200目濾網過濾，收集上清液，離心，棄上清，加入含100 mL/L胎牛血清的標準DMEM培養(yǎng)液，混懸，接種于明膠包被的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板，37 ℃、50 mL/L CO2恒溫孵育箱培養(yǎng)。

2 d后，差別消化：2.5 g/L胰酶消化2 min，胎牛血清終止消化，PBS洗2遍，去除成纖維樣細胞，繼續(xù)培養(yǎng)上皮樣細胞；培養(yǎng)第4天后，再次差別消化、換液；第5天，分別加入含Ca2+濃度為0、0.6、1.2 mmoL/L的DMEM培養(yǎng)基及100 mL/L胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 原代SD大鼠成釉細胞HE染色及細胞鑒定

1.4.1HE染色 細胞接種于24孔板玻片上培養(yǎng)5 d后，40 g/L多聚甲醛室溫固定15 min。PBS洗3次，蘇木素染色1 min，自來水沖洗，伊紅染色30 s， 800、900、950 mL/L、無水乙醇梯度脫水。二甲苯透明。中性樹膠封片、拍照。

1.4.2RT-PCR檢測釉原蛋白和KLK4 mRNA表達 細胞接種于培養(yǎng)瓶培養(yǎng)5 d后，加入裂解液，按FAST200 RNA 提取試劑盒說明書提取總RNA，檢測RNA樣品濃度和純度，進行反轉錄：94 ℃，3 min 95 ℃，30 s 60 ℃，30 s 72 ℃，1 min，30個循環(huán)；72 ℃，5 min。PCR擴增引物序列如下：Amelogenin-P1 5′-CTCTGCCTCCACTGTTCT-3′；Amelogenin-P2 5′-TCCACTTCGGTTCTCTCA-3′；KLK4-P1 5′-GACTCCTACACCGTGGGA-3′；KLK4-P2 5′-CGCCTGATGGTGTTAGAC-3′；β-actin-P1 5′-AGAGCAAGAGAGGCATCCT-3′；β-actin-P2 5′-GGTCATCTTTTCACGGTTG-3′。各取PCR產物5 μL，上樣于20 g/L的瓊脂糖凝膠中，電泳。紫外投射儀下拍照。

1.4.3釉原蛋白免疫組化染色 接種于24孔板玻片上培養(yǎng)5 d后，PBS洗3次，40 g/L多聚甲醛室溫固定15 min，PBS洗3次，1 mL/L Triton-X孵育20 min，PBS洗3次，室溫下50 mL/L BSA封閉15 min。釉原蛋白一抗4 ℃孵育，過夜，PBS洗3次，加二抗，37 ℃孵育20 min，棄二抗，PBS漂洗，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木素復染，自來水沖洗。800、900、950 mL/L、無水乙醇梯度脫水。二甲苯透明。中性樹膠封片、拍照。

1.5 倒置顯微鏡觀察低鈣環(huán)境下成釉細胞形態(tài)變化標準DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)成釉細胞5 d后，分別加入含Ca2+濃度為0、0.6、1.2 mmoL/L的DMEM培養(yǎng)基及100 mL/L胎牛血清，48 h后倒置顯微鏡觀察低鈣微環(huán)境下成釉細胞的形態(tài)變化。

1.6 MTT檢測低鈣環(huán)境下成釉細胞增殖情況標準DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)成釉細胞5 d后，分別加入含Ca2+濃度為0、0.6、1.2 mmoL/L的DMEM培養(yǎng)基及100 mL/L胎牛血清，每組6孔，并設置空白組。培養(yǎng)44 h后，加入MTT液，與原培養(yǎng)液共培養(yǎng)4 h后，吸出混合液，加入150 μL DMSO，酶聯免疫檢測儀上讀取吸光度值，記錄并分析結果。

1.7 流式細胞儀Annexin V-PI法檢測低鈣環(huán)境下成釉細胞凋亡情況標準DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)成釉細胞5 d后，分別加入含Ca2+濃度為0、0.6、1.2 mmoL/L的DMEM培養(yǎng)基及100 mL/L胎牛血清，48 h后對凋亡細胞進行測定。2.5 g/L胰酶消化細胞并離心收集細胞，Binding Buffer懸浮細胞，加5 μL Annexin V-FITC，混勻，室溫避光10 min，加入 Propidium Iodide，冰浴5 min，混勻。上流式細胞儀檢測并分析結果。

1.8 Real time-PCR檢測低鈣環(huán)境下成釉細胞釉原蛋白和KLK4 mRNA表達標準DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)成釉細胞5 d后，分別加入含Ca2+濃度為0、1.2 mmoL/L的DMEM培養(yǎng)基及100 mL/L胎牛血清，48 h后提取細胞總RNA并進行逆轉錄，具體步驟同實驗一。按表1體系在冰上配制反應液。上機，94 ℃×30 s預變性；PCR反應，循環(huán)40次，95 ℃×5 s→60 ℃×30 s。IQ5軟件分析溶解曲線，記錄數據。

表1 Q-PCR反應體系Tab.1 Q-PCR reaction system

1.9 統(tǒng)計學分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，各組數據均以均值±標準差表示，數據經檢驗符合正態(tài)分布，Levene’s 法檢驗數據方差齊性，MTT和Annexin V-PI實驗采用單因素方差分析對組間的均數進行比較，采用Tukey’s 檢驗進行組間兩兩比較，Real time-PCR 采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 成釉細胞形態(tài)及鑒定體外標準DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后，HE染色顯示細胞聚集成簇、呈鋪路樣排列，細胞呈圓形、卵圓形及不規(guī)則多邊形，細胞胞核藍染(圖1A)；RT-PCR結果顯示釉原蛋白、KLK4均有特異性條帶(圖1B)；釉原蛋白免疫組化可見較多的細胞胞質染色呈棕黃色(圖1C)。

圖1 標準DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后成釉細胞的形態(tài)及其鑒定Fig.1 Morphology and identification of ameloblasts cultured in standard DMEM medium for five daysA：HE染色(×40)；B：RT-PCR；C：釉原蛋白免疫組化染色(×40)。

2.2 低鈣對成釉細胞形態(tài)的影響低Ca2+DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，倒置顯微鏡下顯示各組細胞主要呈圓形、卵圓形及不規(guī)則多邊形(圖2)；1.2 mmoL/L Ca2+組較0 mmoL/L和0.6 mmoL/L Ca2+組有較多細胞胞核密度較高、透光性差(圖2A中黑色箭頭)及高柱狀細胞(圖2A中紅色箭頭)。

圖2 倒置顯微鏡下觀察低鈣對成釉細胞形態(tài)影響Fig.2 The effect of low-level calcium on the morphology of ameloblasts observed under inverted microscope (×40)A：1.2 mmoL/L Ca2+組；B：0.6 mmoL/L Ca2+組；C：0 mmoL/L Ca2+組。

2.3 低鈣對成釉細胞增殖活力的影響低Ca2+DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48h后，MTT顯示，與1.2 mmoL/L Ca2+組相比，0、0.6 mmoL/L Ca2+組細胞增殖活性增加，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖3)。兩兩比較，0、0.6 mmoL/L Ca2+組細胞增殖活性均高于1.2 mmoL/L Ca2+組(P<0.01，圖3)。

圖3 MTT 檢測低鈣對成釉細胞增殖活力的影響Fig.3 The effect of low-level calcium on the proliferation of ameloblasts detected by MTT assay與1.2 mmoL/L Ca2+組相比，*P<0.01。

2.4 低鈣對成釉細胞凋亡的影響低Ca2+DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，Annexin V-PI凋亡檢測發(fā)現，與1.2 mmoL/L Ca2+組相比，0、0.6 mmoL/L Ca2+組細胞凋亡百分率下降，組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖4)。兩兩比較，1.2 mmoL/L Ca2+組與0 mmoL/L Ca2+組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖4)。

圖4 Annexin V-PI檢測低鈣對成釉細胞凋亡的影響Fig.4 Effect of low-level calcium on ameloblast apoptosis detected by Annexin V-PI與1.2 mmoL/L Ca2+組相比，*P<0.05。

2.5 低鈣對成釉細胞釉原蛋白及KLK4 mRNA表達的影響低Ca2+DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，Real time-PCR結果顯示，與1.2 mmoL/L Ca2+組比較，0 mmoL/L Ca2+組細胞釉原蛋白及KLK4的mRNA表達均降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖5)。

圖5 Real-time PCR 檢測低鈣對成釉細胞釉原蛋白及KLK4 mRNA表達的影響Fig.5 Real-time PCR was used to detect the effect of low-level calcium on the expressions of amelogenin and KLK4 mRNA in ameloblasts與1.2 mmoL/L Ca2+組相比，*P<0.01，**P<0.001。

3 討 論

鈣缺乏可能參與釉質礦化不全及加重氟中毒，然而，低鈣環(huán)境下成釉細胞生物學特性的變化目前尚不完全清楚。本課題組研究發(fā)現，高濃度的鈣可能促進成釉細胞樣細胞LS8細胞的分化[10]；本研究進一步發(fā)現，低濃度的鈣促進原代大鼠成釉細胞增殖并降低釉原蛋白和KLK4 在mRNA水平的表達，提示鈣缺乏可能抑制原代成釉細胞的分化。

牙釉質的形成礦化是在成釉細胞調控下完成的。成釉細胞在分化中主要經歷分泌期、轉化期、成熟期3個階段。分泌期成釉細胞呈高柱狀，分泌釉原蛋白等釉基質蛋白和基質金屬蛋白酶20(MMP20)。釉基質蛋白作為有機模板誘導鈣等無機物礦化成核，使釉質晶體在長度方向生長完成[11]。此后，成釉細胞分化進入轉化期，細胞變矮，開始分泌絲氨酸蛋白酶(KLK4)，KLK4水解釉原蛋白。短暫的轉化期后，成釉細胞進入成熟期，細胞高度進一步變矮，并分泌KLK4，水解、吸收釉基質蛋白，轉運鈣、磷等礦物鹽在晶核周圍，促進釉質晶體在寬度和厚度方向增長，調控釉質礦化成熟[12]?？梢?，釉原蛋白由分泌期成釉細胞表達，KLK4由轉化期和成熟期成釉細胞合成分泌[12]。本研究通過RT-PCR在mRNA水平對體外培養(yǎng)成釉細胞進行鑒定發(fā)現，標準DMEM體外培養(yǎng)5 d的牙源性上皮細胞中釉原蛋白及KLK4 mRNA均顯示有特異性條帶。釉原蛋白免疫組化結果顯示，部分細胞釉原蛋白染色陽性。免疫組化及RT-PCR結果說明，本研究所培養(yǎng)的細胞包含分泌期、轉化期及成熟期成釉細胞。

標準DMEM培養(yǎng)基的總鈣量為1.8 mmoL/L，采用電解質分析儀對標準DMEM培養(yǎng)基中的Ca2+濃度測定發(fā)現其Ca2+濃度為1.2 mmoL/L，因此，本研究定制了無鈣DMEM培養(yǎng)基，并在此無鈣培養(yǎng)基中添加CaCl2，配置了含Ca2+濃度為0、0.6 mmoL/L的低鈣培養(yǎng)基及含Ca2+濃度為1.2 mmoL/L 的標準DMEM培養(yǎng)基。細胞在標準DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d后，低鈣干預后，隨著鈣濃度的降低，細胞體積較1.2 mmoL/L 的標準DMEM培養(yǎng)基小，且細胞中柱狀細胞較對照組少見，提示低Ca2+對體外培養(yǎng)成釉細胞形態(tài)可能有一定的影響。細胞活性檢測發(fā)現，與1.2 mmoL/L組相比，0 mmoL/L Ca2+組及0.6 mmoL/L Ca2+組細胞增殖活性增加，凋亡減少，提示降低培養(yǎng)基中Ca2+對成釉細胞增殖活性有明顯促進作用。這與國外的研究報道結果相似：隨著培養(yǎng)基中Ca2+濃度降低成釉細胞增殖增加[13]。因此，低鈣可促進原代成釉細胞的增殖活性。

本研究中，低鈣DMEM培養(yǎng)基干預后，與1.2 mmoL/L Ca2+組比較，0 mmoL/L鈣組成釉細胞釉原蛋白及KLK4的mRNA表達水平下調，提示低鈣可能影響成釉細胞中釉原蛋白和KLK4 基因的表達。本研究中釉原蛋白mRNA表達水平下調與CHEN等[13]研究結果相似，增加培養(yǎng)基中Ca2+濃度釉原蛋白mRNA及蛋白水平均上調。然而，低鈣導致釉原蛋白、KLK4 mRNA表達水平下調的具體調節(jié)機制仍待研究。有研究推測，Ca2+對釉原蛋白表達的影響可能通過Ca2+直接作用于釉原蛋白啟動子，或者Ca2+通過某一信號通路直接參與釉原蛋白的表達導致[13]。成釉蛋白由分泌期成釉細胞表達，KLK4主要由成熟期成釉細胞表達，成釉細胞在分泌前期及分泌期增殖活力較強，有約1/4成釉細胞在轉化期凋亡，又有1/4細胞在成熟期凋亡，即隨著成釉細胞的分化，細胞增殖活力減弱[14]。結合本研究中低鈣促進細胞增殖，低鈣下調成釉細胞釉原蛋白和KLK4 mRNA表達，推測鈣缺乏環(huán)境可能抑制成釉細胞的分化：相對于正常鈣水平組，部分成釉細胞未能從分泌前期分化進入分泌期，且部分分泌期成釉細胞未能分化進入轉化期和成熟期。

綜上,本研究通過體外細胞實驗證實了低鈣影響原代大鼠成釉細胞細胞形態(tài)、增殖活力、凋亡及特異性基因表達，提示低鈣可能造成的成釉細胞分化延遲，進而影響釉質礦化成熟。本研究結果為補鈣拮抗氟牙癥、釉質礦化不全增加了理論基礎。然而，尚需動物實驗進一步驗證上述研究結果。