馬林峰，武朝霞，陳麗琴，冀霞，張慧琴，韓克光，古少鵬，霍乃蕊

（山西農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學學院，山西 太谷030801）

畜禽養(yǎng)殖過程中，微生物飼料添加劑具有增強免疫力、抑制病原菌、無殘留、無抗藥性、促生長、安全無副作用等諸多優(yōu)點，逐漸成為抗生素的理想替代［1，2］。利用益生菌是一種經(jīng)濟有效的消炎療法［2～4］，近年來主要用于結(jié)腸炎［3，4］、炎性腸?。?，5］等炎性疾病以及過敏性疾?。?～8］的治療。

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，L. a）是最常見的一種益生菌［9］，自然存在于哺乳動物口腔、腸道和生殖道黏膜表面［10］，是我國可用于嬰幼兒食品以及保健食品的菌種，也是農(nóng)業(yè)部規(guī)定的可用于飼料添加的安全菌種。L. a在乳酸菌家族中極受重視，因其耐酸性強，能在其它乳酸菌不能生長的低pH、高膽鹽胃腸環(huán)境中存活而被譽為第三代酸奶發(fā)酵劑菌種［11］，通過合成乳酸、抗菌素等發(fā)揮多種益生功能，并在體內(nèi)通過調(diào)節(jié)Treg-Th17 細胞平衡而對T 細胞介導的炎性疾病具有免疫調(diào)節(jié)［8，12］、改善骨質(zhì)的作用［9］。

乳酸菌，即使是嗜酸乳桿菌，在定植腸道之前大部分菌體會失活，而芽孢是抗逆性最強的生命形式，所以產(chǎn)芽孢乳酸菌的分離篩選及育種始終是研究的熱點。細胞融合是一種安全的定向微生物育種方法，將嗜酸乳桿菌與產(chǎn)芽孢菌融合是獲得產(chǎn)芽孢乳桿菌的一條有效途徑，并且融合子將整合兩親本菌株的優(yōu)良性狀。地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis，B. lich）也是農(nóng)業(yè)部《飼料添加劑品種目錄》規(guī)定的安全菌種，其抗逆性強，并且產(chǎn)消化酶的能力也強，是重要的整腸生菌種，可替代抗生素用于養(yǎng)殖動物腸道疾病的治療。

本研究將探討嗜酸乳桿菌和地衣芽孢桿菌融合形成的芽孢乳桿菌Lsp-1 的耐酸耐膽鹽能力、產(chǎn)酸能力、產(chǎn)丁二酮能力、產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶能力以及膽固醇清除能力，探討細胞融合對上述能力的影響，為Lsp-1 在畜牧養(yǎng)殖、疾病治療、微生態(tài)制劑生產(chǎn)、飼料青貯、飼料添加劑、環(huán)境治污、生物有機肥等領域的應用提供理論依據(jù)，也為芽孢乳酸菌育種提供新的可行方法。

1 材料和方法

1.1 菌株

芽孢乳桿菌Lsp-1 為遺傳穩(wěn)定的地衣芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌的融合子，由山西農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院衛(wèi)檢實驗室專利方法育種而成［13］；嗜酸乳桿菌CICC 20248 購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；地衣芽孢桿菌BL20386 無毒菌株從整腸生膠囊中分離純化。

1.2 耐酸耐膽鹽能力測定

取對數(shù)生長期L. a、B. lich和Lsp-1 的菌液各1 mL，離心并洗滌菌體（3 000 r·min-1，5 min），生理鹽水重懸，分成4 等份，每份加入1 mL pH 2.0 的MRS 培養(yǎng)基混勻，第1 份直接活菌計數(shù)，其余3 份分別37 ℃靜置培養(yǎng)1.5、2.0、2.5 h 后計數(shù)。計數(shù)時取10-6，10-7，10-8共3 個稀釋度，每個稀釋度3 皿，培養(yǎng)基為pH 6.5 的MRS 固體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)2 d 后進行菌落計數(shù)。耐膽鹽能力測定操作同上，只是將pH 2.0 的MRS 培養(yǎng)基換成牛膽鹽濃度為0.3%的MRS 培養(yǎng)基。存活率按式（1）計算。

1.3 產(chǎn)乳酸能力分析

取活化好的L. a及Lsp-1 培養(yǎng)液，以5%（V∶V）的接種量接種于10 mL MRS 液體培養(yǎng)基（pH 6.5）的試管中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，10 h 時各取一支試管滴加溴甲酚紫指示劑，根據(jù)指示劑變色情況進行定性分析；另每隔12 h 取3 支試管，以NaOH 滴定法測定并按式（2）計算產(chǎn)乳酸量，式中V 表示消耗的氫氧化鈉的體積（mL）；90.08 代表乳酸的摩爾質(zhì)量［14］。

1.4 產(chǎn)蛋白酶能力分析

制備粗酶液：將活化的對數(shù)生長期菌液以體積 比3% 接 種 至MRS 改 良 酪 蛋 白 培 養(yǎng) 基 中［14］，37 ℃培養(yǎng)16 h 后，離心（4 200 r·min-1，15 min），上清液即胞外粗酶液。制備胞內(nèi)粗酶液時，離心收集菌體并用與原培養(yǎng)液等體積的乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 3.6，測酸性蛋白酶）或磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH 7.2，測中性蛋白酶）重懸菌體并超聲破碎處理（功率200 W，200 次，每次3 s，間隔3 s），離心收集上清液。

制作酪氨酸標準曲線：配置濃度分別為0、20、40、60、80、100 μg·mL-1的酪氨酸溶液，各取1 mL于6 支試管，每管加入0.4 mol·L-1碳酸鈉5 mL 和2 倍稀釋的福林試劑1 mL，40 ℃發(fā)色20 min 后測OD660值。以各管OD660減去1 號管OD660所得的凈OD660為橫坐標，酪氨酸濃度為縱坐標，制作標準曲線。

酶活測定：取試管2 支，各加粗酶液1 mL，40 ℃預熱2 min，加入預熱的2% 酪蛋白溶液1 mL，40 ℃10 min，立即 加入0.4 mol·L-1三氯乙酸2 mL 終止反應，水浴中保溫20 min，離心取上清，吸取1 mL 分別加入3 支試管，再加入碳酸鈉溶液和福林試劑，操作同標準曲線制作。空白管在加酪蛋白之前先加0.4 mol·L-1三氯乙酸2 mL 酶滅活，其余操作同粗酶液。

在40 ℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg 酪氨酸所需的酶量，定義為1 個蛋白酶活力單位，按式（3）計算，式中A 為樣品凈OD660值對應標準曲線的酪氨酸微克數(shù)；N 為粗酶液稀釋倍數(shù)；4 表示4 mL 反應液取出1 mL 測定；10 表示反應10 min。

1.5 產(chǎn)淀粉酶能力分析

各菌株活化后以牙簽點種法接種于淀粉瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，用碘熏蒸顯色，測定水解透明圈直徑（H）與菌落直徑（C），計算H·C-1值。

1.6 產(chǎn)丁二酮能力分析

15 μL 丁二酮標準液用蒸餾水定容至500 mL，分別吸取0、2、4、6、8、10 mL 于6 支試管，蒸餾水補足至10 mL，各管吸取5 mL 加入8%三氯乙酸溶液，配置成濃度分別為0、3、6、9、12、15 μL·mL-1的丁二酮溶液。另取6 支試管做空白管，操作同上。每管再加入1%鄰苯二胺溶液0.5 mL，空白管不加，搖勻后黑暗處反應30 min 后，反應管和空白管分別加2.0、2.5、4.0 mol·L-1鹽酸終止反應，以相應的空白管作參比，在波長335 nm 處測吸光度值。以丁二酮濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標制作標準曲線。

各菌株以0.5%接種量接種于MRS 培養(yǎng)12 h后，用三氯乙酸沉淀蛋白，離心取上清，加1%鄰苯二胺避光反應30 min，加4.0 mol·L-1鹽酸終止，紫外分光光度計測定OD335，根據(jù)標準曲線求得丁二酮含量。

1.7 膽固醇清除率測定

分別吸取4 mL 膽固醇濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g·L-1的冰乙酸溶液于6 支具塞試管中，加入2 mL 鐵礬顯色液，混勻后于560 nm處測OD 值，繪制膽固醇標準曲線。將各菌株等量接種于含1 g·L-1膽固醇的MRS 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)60 h，吸取0.2 mL 加入冰乙酸4.8 mL，室溫孵育10 min，離心取上清，加入2 mL 鐵礬顯色液，立即搖勻冷卻到室溫，測OD560值，根據(jù)標準曲線求得膽固醇含量，按式（4）計算膽固醇清除率，式中A 代表各試驗菌株培養(yǎng)液上清的OD560，B 代表空白對照（未接種培養(yǎng)液）的OD560。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0 軟件進行方差分析，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐酸耐膽鹽能力

由表1 可見，各菌株的存活率隨著處理時間的延長而降低，培養(yǎng)1.5 h 后，嗜酸乳桿菌、地衣芽孢桿菌和融合子Lsp-1 的存活率分別為6.62%、3.12%和6.15%，可見地衣芽孢桿菌的營養(yǎng)體形式最不耐酸，嗜酸乳桿菌的耐酸能力最強，營養(yǎng)體形式的Lsp-1 的存活率大大高于地衣芽孢桿菌，接近于嗜酸乳桿菌。在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)2.0 h和2.5 h 后，Lsp-1 的 存活數(shù)比L.a和B.lich多1 個數(shù)量級，綜合分析，Lsp-1 的耐酸能力比親本菌株的都強。

表1 各菌株在pH=2.0 選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)不同時間后的存活數(shù)Table 1 The viable count of bacteria cultured in selective medium（pH=2.0）at different intervals

由表2 可見，各菌株活菌數(shù)的起始數(shù)量級均為108，在含0.3%膽鹽的培養(yǎng)基中處理1.5 h 后，嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)降低的最快，數(shù)量級由108降低到106。處理2 h 后，Lsp-1 依然保持在數(shù)量級107，而嗜酸乳桿菌與地衣芽孢桿菌分別降低了3 個和2 個數(shù)量級，處理2.5 h 后，Lsp-1 的存活數(shù)高出兩親本菌株1 到2 個數(shù)量級，說明Lsp-1 的耐膽鹽能力均比兩親本菌株較高。

2.2 產(chǎn)乳酸能力

乳酸是常見的抑菌物質(zhì)，具有抑制腸道病原菌生長，促進有益菌增殖的益生作用［15］。由圖1A 可見，Lsp-1 遺傳了地衣芽孢桿菌的芽孢生成能力，可觀察到被孔雀綠綠染的位于菌體中央的芽孢囊和成熟游離的芽孢；圖1B 中，地衣芽孢桿菌（1、2 管）幾乎不變色，Lsp-1（3、4 管）與嗜酸乳桿菌（5、6 管）的培養(yǎng)液使溴甲酚紫明顯變黃。

進一步比較嗜酸乳桿菌和地衣芽孢桿菌的產(chǎn)酸能力，由圖2 可見，在培養(yǎng)前期，Lsp-1 的產(chǎn)酸速率稍低于嗜酸乳桿菌，隨著培養(yǎng)時間的延長，48 h 二者產(chǎn)酸量基本相同，且達到峰值（10.52 g·L-1），說明親本嗜酸乳桿菌的產(chǎn)酸能力經(jīng)過細胞融合后在LSP-1 中沒有丟失或下降。

表2 各菌株在膽鹽濃度0.3%的選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同時間后的存活數(shù)Table 2 The viable count of bacteria in selective medium containing 0.3 % bile salt at different intervals

圖1 Lsp-1 孔雀石綠染色鏡檢及三株菌的產(chǎn)酸鑒定Fig.1 Microscopy of Lsp-1 stained by malachite and the acid-producing identification of 3 strains

圖2 嗜酸乳桿菌及產(chǎn)芽孢乳桿菌Lsp-1 的產(chǎn)乳酸曲線Fig.2 Lactic acid-producing curve of L.acidophilus and Lsp-1

2.3 產(chǎn)蛋白酶能力

胞內(nèi)蛋白酶與細胞的催化和調(diào)節(jié)作用有關；胞外蛋白酶則分泌至細胞外作用，降解胞外的氮源或能源物質(zhì)。酸性蛋白酶適合在酸性條件（pH值1.0～5.0）下水解蛋白質(zhì)，最適pH 為2.5～5.0；中性蛋白酶的最適作用pH 則介于6.0～7.5。酪氨酸標準曲線回歸方程為Y=94.91X+1.405 9，R2=0.999 3，線性關系良好。由表3 可見，產(chǎn)胞外蛋白酶和胞內(nèi)蛋白酶能力均是：地衣芽孢桿菌＞Lsp-1＞嗜酸乳桿菌，并且各菌株產(chǎn)胞外中性蛋白酶能力大于產(chǎn)酸性蛋白酶能力，胞內(nèi)酶則相反，各菌株產(chǎn)酸性蛋白酶能力高于產(chǎn)中性蛋白酶能力?？梢姡琇sp-1 的產(chǎn)蛋白酶能力介于兩親本菌株之間，各菌株所產(chǎn)胞外酶主要是中性蛋白酶，胞內(nèi)酶主要是酸性蛋白酶。

2.4 產(chǎn)淀粉酶能力

由表4 可見，3 菌株都產(chǎn)淀粉酶，其中地衣芽孢桿菌的透明圈直徑與菌落直徑比最大，嗜酸乳桿菌最小，Lsp-1 介于二者之間（圖3）。

2.5 產(chǎn)丁二酮能力

丁二酮在食品、化工等領域應用廣泛［16］，由糖降解產(chǎn)生［17］，具有濃郁的奶香風味，是發(fā)酵乳制品重要的特征性風味物質(zhì)。丁二酮質(zhì)量濃度與OD335的線性回歸方程為Y=0.069 5X+0.005 8，R2=0.999 9。在相同培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)液中的丁二酮濃度嗜酸乳桿菌為10.25 μg·mg-1，Lsp-1 為8.21 μg·mg-1，地衣芽孢桿菌則沒有檢測到。

2.6 膽固醇清除率

膽固醇標準曲線回歸方程為Y=1.368 8X+0.005 6，R2=0.999 7，線性關系良好，膽固醇含量與吸光度值OD560呈正相關。由圖4 可見，L. a（15.2%）和B. lich（8.9%）均有膽固醇清除能力，但由二者融合所得的Lsp-1，其膽固醇清除能力最高（19.7%），顯著高于兩親本菌株（P＜0.05）。

表3 各菌株的胞內(nèi)蛋白酶和胞外蛋白酶產(chǎn)量Table 3 Intracellular and extracellular protease produced by different strains 單位：U·mL-1

表4 融合子及親本菌株的產(chǎn)淀粉酶能力比較Table 4 Amylase-producing ability of parent strains and the fusant

圖3 地衣芽孢桿菌、嗜酸乳桿菌、Lsp-1 產(chǎn)淀粉酶能力比較Fig.3 Comparison of amylase production ability of B.lich，L.a and Lsp-1

圖4 各菌株的膽固醇清除率Fig.4 Cholesterol scavenging rate of each strain

3 討論

原生質(zhì)體融合技術與基因工程技術不同，發(fā)生重組的不是單個基因而是整個基因組，是全基因組水平的分子定向進化，類似于有性繁殖，實現(xiàn)雙親本之間的基因信息交流，是一種快速提高細胞表型的全基因組工程方法［18］。本研究通過原生質(zhì)體融合（細胞融合）賦予嗜酸乳桿菌芽孢生成能力的另一親本菌株——地衣芽孢桿菌，也具有增強機體免疫、維持腸道微生態(tài)環(huán)境、促進動物生長等多種益生功能［19］。地衣芽孢桿菌進入腸道后，通過三重機制抑制病原菌，恢復腸道功能：一是通過生物奪氧，創(chuàng)造對雙歧桿菌、乳酸桿菌等益生菌和正常生理厭氧菌有利的低氧環(huán)境而促進其生長繁殖，并產(chǎn)生乳酸等有機酸類，降低腸道pH，間接抑制其它致病菌生長；二是促進機體產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，拮抗白色念珠菌（Candida albicans）、葡萄球菌（Staphylococcus）等致病菌的活動；三是通過固本，增強機體的特異性和非特異性免疫，提高養(yǎng)殖動物的抗感染能力。用作飼料添加，對養(yǎng)殖動物腸道細菌感染具有特效，對急性腸炎和急性菌痢療效明顯，使地衣芽孢桿菌自然成為替代抗生素的一種理想選擇，有關Lsp-1 的體內(nèi)外抑菌和動物飼喂試驗將另文報道。

Lsp-1 遺傳了地衣芽孢桿菌的產(chǎn)芽孢能力，賦予其在復雜的胃腸道環(huán)境中可順利到達腸道的能力［15］，Lsp-1 芽孢能耐受人工模擬胃液和腸液，在胃液中部分萌發(fā)成營養(yǎng)體形式［20］，本研究表明Lsp-1 營養(yǎng)體的耐酸耐膽鹽能力通過細胞融合產(chǎn)生了疊加效應，均高于兩親本菌株，正好為其提供保護，提高過胃能力和存活率，這是任何益生菌或微生態(tài)制劑發(fā)揮作用的先決條件。同時本研究表明Lsp-1 遺傳了嗜酸乳桿菌的產(chǎn)乳酸能力，乳酸是無毒、低成本的多用途化學品，作為添加劑可以控制堆肥過程中的氨氣排放［21］。

產(chǎn)酶性能也是考察優(yōu)良微生態(tài)制劑菌種的一個重要方面，微生物胞外酶可補充動物源性酶的不足［19］，降解難以被吸收或利用的大分子物質(zhì)，利于提高腸道吸收能力和飼料轉(zhuǎn)化率，促進養(yǎng)殖動物生長，同時對益生菌生長形成正向反饋，建立良性循環(huán)。淀粉酶分解腸道中碳水化合物形成的寡糖，不僅易于吸收，同時也是乳酸菌的促生長因子（益生元）。蛋白酶將蛋白質(zhì)及一些抗營養(yǎng)物質(zhì)水解成肽、氨基酸等小分子物質(zhì)，提高了蛋白質(zhì)的可消化性和生物利用度，氨基酸等小分子水解產(chǎn)物又會被微生物吸收利用，促進微生物生長繁殖［22］。腸道環(huán)境適于中性蛋白酶作用，而Lsp-1 主要在腸道定植和發(fā)揮作用，并且Lsp-1 的產(chǎn)中性蛋白酶能力高于產(chǎn)酸性蛋白酶的能力。嗜酸乳桿菌產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶的能力較弱，而地衣芽孢桿菌則很強，經(jīng)過融合，Lsp-1 的產(chǎn)蛋白酶能力和產(chǎn)淀粉酶能力均不及親本地衣芽孢桿菌的水平，沒有產(chǎn)生疊加效應。

膽固醇清除能力也是益生菌的益生功能之一，本研究兩親本菌株的膽固醇清除能力在Lsp-1中產(chǎn)生了疊加效應。膽固醇對乳酸菌的生長具有抑制作用［23］，Lsp-1 可通過清除周圍環(huán)境中的膽固醇來促進其自身及其它乳酸菌的生長。

4 結(jié)論

嗜酸乳桿菌和地衣芽孢桿菌的融合子Lsp-1兼具了兩親本菌株的優(yōu)良特性，耐酸能力、耐膽鹽能力以及膽固醇清除能力產(chǎn)生了疊加效應而進一步增強，產(chǎn)蛋白酶能力和產(chǎn)淀粉酶能力則介于兩親本菌株之間，產(chǎn)酸能力則與親本菌株嗜酸乳桿菌持平。Lsp-1 用作飼料添加或微生態(tài)制劑制時的高胃腸存活率，為其益生功能的發(fā)揮提供了保障；產(chǎn)消化酶能力可提高飼料利用率，促進動物生長，形成的小分子物質(zhì)也可正反饋作用于益生菌的生長。