段春燕，井明博，宋 曦

(1.隴東學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，甘肅 慶陽 745000；2.甘肅省高校隴東生物資源保護(hù)與利用省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 慶陽 745000；3.隴東學(xué)院 農(nóng)林科技學(xué)院，甘肅 慶陽 745000)

大腸桿菌是目前掌握最為成熟的基因克隆表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)常被用作蛋白質(zhì)分泌和表達(dá)的宿主菌，它遺傳背景清晰、轉(zhuǎn)化效率高、表達(dá)周期短、操作簡單，因此使用范圍很廣。但是大腸桿菌也有一些不足之處：大腸桿菌表達(dá)的蛋白質(zhì)形成包涵體，給下游的純化處理帶來不便，同時有些表達(dá)蛋白無法分泌至胞外，不利于測定酶的活性和直接使用[1]。枯草芽孢桿菌是基因工程中又一個被廣泛使用的表達(dá)系統(tǒng)，常作為表達(dá)酶和外源蛋白的宿主菌使用。對于枯草芽孢桿菌的研究可以追溯到100年前，初期側(cè)重于形態(tài)觀察等方面的研究，1958年Spizizen在實(shí)驗(yàn)中采用了化學(xué)試劑，進(jìn)而制備了枯草芽孢桿菌的感受態(tài)細(xì)胞，極大地促進(jìn)了其在基因工程研究方面的進(jìn)展[2]。1997年，枯草芽孢桿菌模式菌株168的基因組完成測序，全基因組共4.2Mb，含有4214810個堿基，200個調(diào)控蛋白參與1500個操縱子的調(diào)控，蛋白編碼序列占87%的基因組。在4106個蛋白質(zhì)編碼基因中，已經(jīng)可以明確或預(yù)測約58%的蛋白質(zhì)編碼基因功能[3]和約30%的產(chǎn)物功能[4]，為研究枯草芽孢桿菌蛋白質(zhì)的分泌機(jī)理提供了重要理論依據(jù)，推動了相關(guān)研究的進(jìn)行[5]?，F(xiàn)在枯草芽孢桿菌已經(jīng)成為一種成熟的基因工程表達(dá)系統(tǒng)，飼料、食品等行業(yè)大多利用枯草芽孢桿菌高效表達(dá)系統(tǒng)來生產(chǎn)內(nèi)源生化產(chǎn)物，其應(yīng)用之廣僅次于大腸桿菌[6]。

1 枯草芽孢桿菌基因表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢

1.1 容易獲得

枯草芽孢桿菌廣泛分布在土壤、腐敗的有機(jī)物以及水環(huán)境中，容易在枯草浸汁中繁殖。

1.2 遺傳操作簡單

枯草芽孢桿菌的基因組測序已于1997年完成，DNA遺傳背景清晰，便于操作[7]。質(zhì)粒載體如pUB110、pC194、HCMC和大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒如pHT43、pSP10等的研究應(yīng)用，為枯草芽孢桿菌在基因工程中的發(fā)展應(yīng)用提供了便利[8]。

1.3 蛋白分泌系統(tǒng)功能完善

枯草芽孢桿菌蛋白質(zhì)分泌能力強(qiáng)，可以實(shí)現(xiàn)對多種蛋白質(zhì)的有效分泌，分泌的時候，并不存在包涵體的形成,可以直接透過細(xì)胞膜向培養(yǎng)基釋放，回收純化目的蛋白質(zhì)方法簡單，

1.4 發(fā)酵工藝成熟

枯草芽孢桿菌嗜溫好氧，培養(yǎng)基配方簡單，代謝產(chǎn)物中含有蛋白酶、淀粉酶等酶類，在工業(yè)上應(yīng)用成熟。

1.5 非致病性

生理生化背景清晰，細(xì)胞壁組成簡單，只含有肽聚糖和磷壁酸，不含內(nèi)毒素，可以在動物腸道中繁殖，為正常的腸道微生物，被美國食品藥品管理局認(rèn)為是生物安全級別的微生物，在飼用酶和益生菌的生產(chǎn)上具有極大的優(yōu)勢[9]。

2 枯草芽孢桿菌信號肽依賴分泌胞外蛋白途徑

在外源基因的克隆表達(dá)過程中，重組蛋白一般以3種形式表達(dá)，包括細(xì)胞外的分泌表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)的可溶性表達(dá)和在細(xì)胞內(nèi)形成不溶性的胞涵體。枯草芽孢桿菌為格蘭氏陽性菌，只有一層細(xì)胞膜，蛋白可直接分泌至胞外而不形成胞涵體，其表達(dá)產(chǎn)物多數(shù)具有天然構(gòu)象和生物活性，產(chǎn)物較易純化，極大地方便了外源蛋白的下游加工和酶活測定，經(jīng)枯草芽孢桿菌分泌的很多外源蛋白質(zhì)已經(jīng)應(yīng)用于益生菌、酶制劑等工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域[10]，占有很大的市場份額。根據(jù)SubtiList數(shù)據(jù)庫提供的SignalP算法軟件，共294種蛋白質(zhì)被預(yù)測為分泌蛋白質(zhì)[11]。根據(jù)蛋白質(zhì)分泌是否涉及到信號肽，可以將分泌途徑分為兩種：信號肽依賴以及不依賴的分泌途徑[12]。其中枯草芽孢桿菌分泌的蛋白質(zhì)大部分是依托于信號肽依賴的分泌途徑分泌至胞外，因此這種途徑也稱為典型性途徑。

2.1 信號肽的研究進(jìn)展

20世紀(jì)70年代初，美國的細(xì)胞生物學(xué)教授Gunter Blobel提出信號肽假說。該假說理論認(rèn)為信號肽位于蛋白的N端，可以結(jié)合并引導(dǎo)核糖體附著在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的極性通道內(nèi)，肽鏈不斷延伸并穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，進(jìn)而延伸到腔內(nèi)，信號肽酶水解信號肽，正確折疊肽鏈，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)向胞外的轉(zhuǎn)運(yùn)[13]。信號肽是一段連續(xù)的氨基酸序列，用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)跨膜運(yùn)輸，它一般由10～40個左右的氨基酸殘基構(gòu)成，包括三個區(qū)域：氨基端區(qū)(N端)、疏水端區(qū)(H端)和羧基端區(qū)(C區(qū))。其中N端由賴氨酸和精氨酸等帶正電荷的氨基酸組成，氨基酸殘基與細(xì)胞膜帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)相互作用。H端的長度以及疏水性在蛋白分泌中起著重要的作用，主要由異亮氨酸等20個或超過20個的中性氨基酸構(gòu)成，疏水氨基酸殘基接觸到膜脂，形成α螺旋結(jié)構(gòu)，在蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)位起始階段發(fā)揮重要作用。C區(qū)又稱為加工區(qū)，存在絲氨酸等小分子氨基酸，在蛋白轉(zhuǎn)位中或轉(zhuǎn)位后，信號多肽在C區(qū)被信號多肽酶識別并切割，隨后信號多肽被降解，蛋白質(zhì)被釋放至胞外[14]。

細(xì)胞外分泌表達(dá)是外源基因克隆表達(dá)中最為理想的表達(dá)形式，但是大部分外源蛋白都會在細(xì)胞內(nèi)形成包涵體，只有少數(shù)外源蛋白可以在細(xì)胞外分泌表達(dá)。為了讓許多原本不能分泌至胞外的外源蛋白進(jìn)行細(xì)胞外分泌表達(dá)，目前解決方法多為直接利用表達(dá)宿主的信號肽序列或?qū)d體的啟動子進(jìn)行表達(dá)后插入編碼信號肽序列來引導(dǎo)外源蛋白胞外分泌[15]。有研究表明，信號肽連接后，在大腸桿菌、芽孢桿菌和乳酸桿菌等原核表達(dá)系統(tǒng)中分泌和表達(dá)了多種外源基因。同時信號肽在畢赤酵母等真核表達(dá)系統(tǒng)中也得到了廣泛的應(yīng)用。如魏薔等將信號肽插入豬瘟病毒E2蛋白基因，實(shí)現(xiàn)了該基因在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的分泌表達(dá)，其中g(shù)p67信號肽可使E2基因分泌表達(dá)量、純度、產(chǎn)率都得到較大提高[16]。祝發(fā)明等構(gòu)建了枯草芽孢桿菌Tat信號肽，實(shí)現(xiàn)了青霉素G?；?PGA)在枯草芽孢桿菌中的分泌表達(dá)，其中最佳信號肽可引導(dǎo)PGA的表達(dá)酶活高達(dá)0.83U/mL[17]。但是信號肽與目的蛋白質(zhì)之間具有適配性，如Brockmeier等人以角質(zhì)酶和脂解酶為例，通過高通量篩選的方法建立了信號肽文庫，以期有效篩選枯草芽孢桿菌sec途徑中的148個信號肽。結(jié)果顯示，兩者間并不存在對應(yīng)關(guān)系，148個信號肽能引導(dǎo)角質(zhì)酶基因在枯草芽孢桿菌中表達(dá)，但最有效促進(jìn)角質(zhì)酶分泌的信號肽引導(dǎo)脂解酶分泌的水平很低，僅為最高分泌量的5%[18]，即使是同一種蛋白，用類型不同的信號肽進(jìn)行引導(dǎo)，多數(shù)均可以表達(dá)，但分泌效率顯著不同。因此選擇合適的信號肽是影響蛋白質(zhì)產(chǎn)量的重要因素。

2.2 枯草芽孢桿菌分泌胞外蛋白途徑

枯草芽孢桿菌中至少存在4種信號肽依賴分泌途徑，具體為Sec途徑、Tat途徑、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子途徑和假菌絲蛋白輸出途徑[19]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子途徑和假菌絲蛋白輸出途徑只輸出特定蛋白質(zhì)，且分子量相對較小，目前研究較為清楚的是Sec途徑和Tat途徑，其中Sec途徑廣泛應(yīng)用于枯草桿菌分泌蛋白質(zhì)，信號肽分為兩類：I型普通型信號肽、C區(qū)含有脂蛋白盒子的Ⅱ型信號肽。Tat途徑通常情況下僅對組裝成熟的蛋白質(zhì)進(jìn)行分泌，信號肽中一般包括兩個相鄰氨酸殘基[20]。

Sec(general secretory pathway)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑。Sec途徑是主要的蛋白分泌途徑，很多文獻(xiàn)中外源表達(dá)蛋白的分泌主要依托于Sec途徑來實(shí)現(xiàn)[8]，對于枯草芽孢桿菌來講，大約存在著三百種分泌蛋白[21]，很多分泌蛋白向胞外的轉(zhuǎn)移主要依托于Sec途徑來實(shí)現(xiàn)，Sec轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，發(fā)揮著重要作用的編碼蛋白為SecA、SecD、SecE、SecF、SecY、ffh、ftsY。SecA本質(zhì)上屬于一種ATP酶，依托于ATP的水解驅(qū)動分泌蛋白前體穿膜，而SecYEG的構(gòu)成主要包括了SecE、SecY和SecG，從蛋白轉(zhuǎn)移酶的角度來說，SecD7和SecF作為其重要的輔助成分[22]。在Sec途徑中，核糖體會先合成有著信號肽的分泌蛋白前體，此時蛋白為未折疊狀態(tài)。Sec蛋白的ATP酶對ATP進(jìn)行水解，信號肽在這種情況下將會引導(dǎo)分泌蛋白前體，向細(xì)胞膜外的轉(zhuǎn)移主要依托于極性通道來實(shí)現(xiàn)，通道蛋白的構(gòu)成主要包括了一組膜蛋白，其主要的職責(zé)是對分泌蛋白的細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行定位和轉(zhuǎn)移[23]，分泌蛋白以肽鏈形式在轉(zhuǎn)移階段存在。在穿過細(xì)胞膜后，信號肽酶在C區(qū)切除信號肽，蛋白質(zhì)被正確折疊，并穿過細(xì)胞壁，最終作為成熟蛋白分泌到培養(yǎng)基中[24]，詳見圖1[25]。

圖1 枯草芽孢桿菌蛋白質(zhì)Sec途徑轉(zhuǎn)移機(jī)制

Sec途徑是枯草芽孢桿菌分泌胞外蛋白質(zhì)的主要途徑，也是酶制劑工業(yè)化生產(chǎn)的主要途徑，但經(jīng)Sec途徑可成功分泌的外源蛋白較少，而且表達(dá)量并不高[26]。主要原因如下：

(1)效率較低。Sec 轉(zhuǎn)運(yùn)途徑只能將以非折疊狀態(tài)即多肽鏈形式存在的分泌蛋白前體從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜外，但在細(xì)胞質(zhì)中已經(jīng)折疊完全的蛋白質(zhì)不能通過該途徑轉(zhuǎn)移；

(2)蛋白降解。經(jīng)sec途徑轉(zhuǎn)運(yùn)的外源蛋白在轉(zhuǎn)移到膜外后才進(jìn)行折疊，但這一過程比較慢，有時來不及折疊就會被蛋白酶降解，降低了外源蛋白的表達(dá)量。

(3)錯誤折疊。王光強(qiáng)等嘗試用不同的Sec信號肽來引導(dǎo)分泌表達(dá)耐熱乳糖酶BgaB，均分泌失敗，利用python語言編寫的程序分析表明，細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)的N端較容易折疊成高級結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致外源蛋白無法進(jìn)入分泌途徑而失敗。

(4)膜定位能力差。

Tat(twin-arginine translocation)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑。2000年Jongbloed等通過功能基因組的分析發(fā)現(xiàn)Tat轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，這也是研究較為清楚的另一種蛋白分泌途徑，與Sec轉(zhuǎn)運(yùn)途徑有很大區(qū)別的是，該途徑可以將折疊緊密的蛋白或者多亞基酶復(fù)合物直接分泌到胞外，而Sec轉(zhuǎn)運(yùn)途徑只能轉(zhuǎn)移多肽鏈型式的蛋白。除枯草芽孢桿菌外，如一些植物葉綠體和細(xì)菌如大腸桿菌等均存在該途徑[27]。

Tat途徑的典型特征為分泌蛋白信號肽中兩個精氨酸殘基相鄰，經(jīng)此途徑分沁的蛋白大多數(shù)都帶有聯(lián)精氨酸信號肽。Tat途徑由TatA(3個TatA/B/E的同源基因)和TatC(2個TatC的同源基因)組成[28]，其中3個TatA/B/E同源基因的跨膜和兩親性雙螺旋在蛋白分泌過程中起著關(guān)鍵性的作用。首先，蛋白信號肽雙精氨酸前體與TatC相連，隨后TatC和TatB再相連，在具有跨膜PH梯度下，再連入TatA，最后，TatB調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移折疊好的基質(zhì)從TatC轉(zhuǎn)移到Tat孔，具體途徑如圖2[29]。

圖2 枯草芽孢桿菌蛋白質(zhì)Tat途徑轉(zhuǎn)移機(jī)制

Tat途徑的研究多集中于大腸桿菌上，berk等發(fā)現(xiàn)大腸桿菌中Tat基質(zhì)在輔助因子作用下可以轉(zhuǎn)運(yùn)折疊蛋白，Santini和Thomas分別證明綠色熒光蛋白可以在折疊狀態(tài)下通過Tat途徑在大腸桿菌中轉(zhuǎn)移至胞外。對枯草芽孢Tat途徑的研究較少，主要集中在與大腸桿菌的Tat途徑的對比上，只有很少的蛋白質(zhì)可以通過Tat途徑分泌，目前僅磷酸二酯酶(PhoD)和未知功能蛋白質(zhì)YwbN是枯草芽孢桿菌Tat途徑分泌至胞外的蛋白質(zhì)[30]。

3 枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)的研究方向

近年來，枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)不斷地發(fā)展，在外源基因克隆表達(dá)領(lǐng)域和工業(yè)生產(chǎn)上都得到了廣泛應(yīng)用，很多外源基因經(jīng)枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)得到高效表達(dá)[31]，但同時枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)仍存在以下問題，影響了其進(jìn)一步的應(yīng)用發(fā)展。

(1)分子克隆效率低?？莶菅挎邨U菌中很少有可以自發(fā)形成感受態(tài)的菌株，而且形成感受態(tài)持續(xù)的時間也很短，現(xiàn)有的質(zhì)粒載體不穩(wěn)定，經(jīng)常會發(fā)生結(jié)構(gòu)或者分離方面的問題，使質(zhì)粒結(jié)構(gòu)改變甚至丟失。

(2)蛋白酶降解?？莶輻U菌中存在大量表達(dá)和分泌蛋白酶，比如堿性蛋白酶、中性蛋白酶、金屬蛋白酶等。這些蛋白酶沒有底物專一性，外源蛋白分泌到胞外后，會被這些蛋白酶降解，從而降低產(chǎn)率。現(xiàn)在通過研究已經(jīng)構(gòu)建了許多蛋白酶失活的突變菌株，如WB600和WB700，可以在一定程度上解決蛋白酶降解的問題，提高產(chǎn)率。

(3)枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中有大量的信號肽(如Sec途徑有148個，Tat途徑有27個)，這些信號肽對不同的蛋白有不同的引導(dǎo)分泌效率，目前研究中一般通過高通量篩選的方法來確定目的蛋白的適配信號肽，無法進(jìn)行有效預(yù)測。

(4)真核蛋白表達(dá)量低[32]。因此在今后的研究中，一方面需要優(yōu)化胞內(nèi)蛋白酶質(zhì)量控制體系，提高目的蛋白產(chǎn)率，另一方面要加強(qiáng)信號肽分泌機(jī)制研究，并構(gòu)建目的蛋白的信號肽篩選系統(tǒng)，提高表達(dá)效率。