苗田田 李 強(qiáng) 余宏軍 劉 鵬 郝 佳 蔣衛(wèi)杰

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

黃瓜（Cucumis sativusL.）起源于亞熱帶地區(qū)，喜溫不耐寒，對(duì)低溫敏感性較高（安志信 等，2006）。我國(guó)是世界上黃瓜栽培面積最大的國(guó)家，作為設(shè)施栽培最重要的蔬菜作物之一，隨著設(shè)施栽培的普及推廣，黃瓜在我國(guó)北方地區(qū)的反季節(jié)栽培中易受到低溫影響，引起產(chǎn)量和品質(zhì)的大幅度下降（李彩霞 等，2019）。在我國(guó)冬季和早春栽培中黃瓜受到低溫傷害，幼苗生長(zhǎng)緩慢或者停止生長(zhǎng)，葉片黃化萎縮，嚴(yán)重時(shí)能夠造成植株死亡（李淑菊等，2020）。因此，提高黃瓜的低溫抗性在生產(chǎn)中有重要作用。

肌醇（inositol），又稱(chēng)環(huán)己六醇，分子式為C6H12O6，相對(duì)分子質(zhì)量為180.16，有9 種異構(gòu)體，較重要且普遍存在的是肌肉肌醇（myo-inositol，MI）（楊楠 等，2017），本試驗(yàn)中使用的肌醇即肌肉肌醇。肌醇在植物生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中參與信號(hào)傳導(dǎo)、營(yíng)養(yǎng)儲(chǔ)存、細(xì)胞壁生成、滲透調(diào)節(jié)（Majumder et al.，1997；Loewus &Murthy，2000；Pendaries et al.，2005；Sengupta et al.，2012）等生命活動(dòng)。肌醇也是抗壞血酸（ascorbate，ascorbic acid，AsA）的底物之一（圖1），AsA 作為植物重要的抗氧化劑，在植物受到低溫、強(qiáng)光、鹽脅迫和干旱等脅迫時(shí)含量增加，它是植物體內(nèi)活性氧（ROS）清除劑（Rao et al.，1995；Mittler，2002；Yurena et al.，2014）。肌醇合成AsA 過(guò)程中的關(guān)鍵酶是肌醇加氧酶（MIOX），研究發(fā)現(xiàn)，與野生型擬南芥相比，過(guò)表達(dá)MIOX轉(zhuǎn)基因擬南芥植株AsA 含量增加了2～3 倍（Lorence et al.，2004），過(guò)表達(dá)MIOX轉(zhuǎn)基因植株葉片肌醇含量顯著低于野生型擬南芥肌醇含量（Endres &Tenhaken，2009）；在轉(zhuǎn)基因SlMIOX番茄上外施肌醇能夠提高AsA 含量，同時(shí)提高番茄的逆境抗性（Munir et al.，2020）。

肌醇作為細(xì)胞中重要的一類(lèi)糖類(lèi)物質(zhì)，近年來(lái)開(kāi)始受到人們關(guān)注。脅迫條件下外施肌醇的水稻、玉米和小麥幼苗抗氧化酶活性顯著提高，丙二醛（MDA）和過(guò)氧化氫含量顯著降低（郭元飛 等，2014；姚慧和夏凱，2014；袁紅梅 等，2014）。大麥發(fā)芽過(guò)程中添加肌醇、α-淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、植酸酶和庫(kù)爾巴哈值都顯著提高（張善飛 等，2012）。但是目前外施肌醇在蔬菜上的應(yīng)用以及對(duì)肌醇代謝相關(guān)基因水平變化的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)以黃瓜材料9930 為研究對(duì)象，苗期低溫條件下噴施肌醇，觀測(cè)在冷脅迫下黃瓜外觀、干鮮質(zhì)量變化，以及植株抗冷性相關(guān)生理指標(biāo)；并采用RT-PCR 技術(shù)，分析肌醇代謝相關(guān)基因在低溫脅迫下的響應(yīng)和水平變化，為外施肌醇對(duì)黃瓜抗冷性的影響提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2017 年10—12 月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所無(wú)土栽培課題組人工氣候室內(nèi)進(jìn)行，選用材料為黃瓜（Cucumis sativus）遺傳背景清晰的測(cè)序品種 9930（由本所顧興芳老師贈(zèng)與，本課題組自行繁種）。選取飽滿(mǎn)的黃瓜種子進(jìn)行催芽，用50 ℃溫水浸泡30 min，5%次氯酸鈉溶液遮光浸泡15 min，清水沖洗2～3 次，放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培育24 h，種子露白后在穴盤(pán)中播種育苗。待黃瓜長(zhǎng)至三葉一心，選用生長(zhǎng)狀態(tài)一致的幼苗進(jìn)行低溫和1 次噴施肌醇處理。肌醇濃度為0.8 g·L-1，由國(guó)藥集團(tuán)生化試劑公司提供。

1.2 試驗(yàn)處理與取樣時(shí)間

試驗(yàn)分別在常溫和低溫人工氣候室進(jìn)行，相對(duì)濕度為65%，光照強(qiáng)度為150 μmol·m-2·s-1，光周期為12 h/12 h（晝/夜）。設(shè)置3 個(gè)處理：常溫對(duì)照（CK），晝夜溫度為28 ℃/18 ℃，葉面噴施0 g·L-1肌醇（即噴施蒸餾水，下同）；低溫對(duì)照（T1），保持晝夜溫度為6 ℃，葉面噴施0 g·L-1肌醇；低溫處理（T2），保持晝夜溫度為6 ℃，葉面噴施0.8 g·L-1肌醇，以葉片均勻附著一層小水珠為準(zhǔn)。每個(gè)處理100 株，3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)包含3 株黃瓜葉片。

1.3 植物生物量的測(cè)定

低溫處理72 h 后，將CK、T1 處理和T2 處理的黃瓜幼苗轉(zhuǎn)移至常溫條件下培養(yǎng)6 d 回暖，回暖后用萬(wàn)分之一天平測(cè)定植株鮮質(zhì)量，將植株鮮樣置于烘箱105 ℃殺青15 min，80 ℃恒溫72 h，然后用電子天平稱(chēng)量植株干質(zhì)量。

1.4 電解質(zhì)外滲率的測(cè)定

電解質(zhì)外滲率的測(cè)定參考張平艷等（2014）的方法，分別在低溫處理后0、3、6、12、24、48、72 h 取黃瓜葉片樣品，每個(gè)處理用打孔器取0.5 g鮮樣，用蒸餾水洗凈后浸泡在20 mL 蒸餾水中，抽氣3 次，每次20 min，放置2 h，其間多次搖動(dòng)，測(cè)定此時(shí)的電導(dǎo)率，記為EC1。將組織沸水浴10 min，使得組織完全被殺死，冷卻至室溫后測(cè)定此時(shí)的電導(dǎo)率，記為EC2。同時(shí)測(cè)定蒸餾水的電導(dǎo)率記為EC，試驗(yàn)重復(fù)3 次。電解質(zhì)外滲率（El）的計(jì)算公式為：El=100 ×（EC1 -EC）/（EC2 -EC）。

1.5 生理指標(biāo)的測(cè)定

分別在低溫處理后0、3、6、12、24、48、72 h 取黃瓜葉片樣品，AsA、總抗壞血酸（Total AsA，T-AsA）和脫氫抗壞血酸（DHA）含量參照Z(yǔ)hang 等（2016）的方法測(cè)定；脯氨酸、丙二醛含量的測(cè)定參考王學(xué)奎（2006）的方法；采用試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）測(cè)定H2O2、含量；采用試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）測(cè)定抗氧化酶SOD（超氧化物歧化酶）、POD（過(guò)氧化物酶）、CAT（過(guò)氧化氫酶）活性；可溶性糖和可溶性蛋白含量分別采用蒽酮比色法和考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析

分別在低溫處理后0、3、6、12、24、48、72 h 取黃瓜葉片，葉片用錫紙包裹迅速置于液氮中，保存在超低溫冰箱中。采用Trizol 方法提取植物樣品中的總RNA（Zhang et al.，2016），用滅菌的超純水溶解RNA，并用NanoDrop（Bio-Rad，美國(guó)）測(cè)定樣品RNA 濃度和OD260/OD280值，然后根據(jù)所測(cè)濃度調(diào)節(jié)最終RNA 濃度為1 000 ng·μL-1，并用試劑盒（Fermentas，美國(guó)）對(duì)樣品RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 即為qRT-PCR 的模板。qRT-PCR 的體系共15 μL，其中包含：7.5 μL iQ SYBR Green Supermix，目的基因上下游引物（10 μmol·L-1）各0.3 μL，cDNA 模板0.75 μL，滅菌超純水6.15 μL。試驗(yàn)中全部的qRT-PCR 均以黃瓜管家基因Actin作為內(nèi)參基因，其熒光定量值作為計(jì)算內(nèi)標(biāo)，參照Livak 和Schmittgen（2001）的2-ΔΔCt方法計(jì)算樣品目的基因相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣品均設(shè)置3 次技術(shù)性重復(fù)。

試驗(yàn)中根據(jù)測(cè)序黃瓜9930 材料數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因序列，用Primer 5.0 設(shè)計(jì)不同目的基因的特異性引物（表1），所有引物合成和測(cè)序委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。qRT-PCR 將在iQTM5 多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀器（Bio-Rad，美國(guó)）上進(jìn)行，具體程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；40個(gè)PCR 循環(huán)（95 ℃變性5 s，再60 ℃退火30 s）；溶解曲線分析以20 ℃·s-1快速升溫至95 ℃，迅速降低（20 ℃·s-1）至65 ℃持續(xù)15 s，再以0.1 ℃·s-1的速度升高至95 ℃，在達(dá)到退火溫度時(shí)采集熒光。

表1 特異性引物設(shè)計(jì)

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析，采用Duncan 法進(jìn)行多重比較及差異顯著性分析。采用Graphpad Prism 5.0 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下外施肌醇對(duì)黃瓜幼苗長(zhǎng)勢(shì)、幼苗生物量和電解質(zhì)外滲率的影響

由圖2 可以看出，低溫處理72 h 后，T1 處理的植株第1 片真葉葉脈變黃，第3 片真葉整體變黃失綠且萎縮，T2 處理的植株第1 片真葉葉邊緣變黃，第3 片真葉受傷害較小。

低溫脅迫回暖6 d 后，T2 處理的植株干、鮮質(zhì)量均顯著高于T1 處理，但顯著低于CK，可見(jiàn)低溫脅迫下植株干、鮮質(zhì)量降低，噴施肌醇對(duì)黃瓜幼苗冷害有緩解作用。低溫脅迫下植株的電解質(zhì)外滲率明顯增加，且呈持續(xù)升高的趨勢(shì)。低溫處理后0～12 h，T1 和T2 處理的電解質(zhì)外滲率升高但兩處理間無(wú)顯著差異，處理24 h 后T1 處理的電解質(zhì)外滲率顯著高于T2 處理。其中低溫處理48 h 時(shí)T1 與T2 處理相差最大，T2 處理的電解質(zhì)外滲率比T1 處理降低了20.44%（圖3）。

2.2 低溫脅迫下外施肌醇對(duì)黃瓜幼苗抗壞血酸含量的影響

由圖4 可知，在低溫條件下黃瓜幼苗葉片中AsA、T-AsA 和DHA 含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。T2 處理的AsA 含量在處理后12 h 達(dá)到最大值，此時(shí)T2 和T1 處理分別比CK 增加了131.27%和46.49%；在處理后12 h 和24 h，T2 處理的AsA 含量顯著高于T1 處理，且在處理后72 h，T2 處理的AsA 含量顯著高于T1 處理和CK。T2 處理的T-AsA含量在處理后12 h 達(dá)到最大值，是CK 的2.91 倍，T1、T2 和CK 三者之間呈現(xiàn)顯著差異。低溫條件下T1 和T2 處理的DHA 含量整體看來(lái)沒(méi)有顯著差異。在低溫處理后3 h 時(shí)，T2 處理的DHA 含量顯著高于CK；低溫處理后12 h 和24 h，T1 和T2 處理的DHA 含量顯著高于CK；而在低溫處理后72 h，T1 和T2 處理的DHA 含量顯著低于CK。

2.3 低溫脅迫下外施肌醇對(duì)黃瓜幼苗MDA、H2O2、和滲透物質(zhì)含量的影響

隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，黃瓜幼苗葉片中的MDA 含量呈持續(xù)升高的趨勢(shì)（表2），處理48 h 時(shí)，T1、T2 和CK 三者之間的MDA 含量差異顯著，與CK 相比，T1 和T2 處理的MDA 含量分別增加了103.03%和75.76%。低溫處理6～72 h，T1 和T2處理黃瓜幼苗葉片的H2O2含量顯著高于CK，且T1 處理在低溫后12～48 h 一直顯著高于T2 處理。低溫處理3～6 h 和24～72 h，T1 和T2 處理的含量顯著高于CK，在低溫處理48～72 h，T1 處理的含量顯著高于T2 處理。

低溫處理后黃瓜幼苗葉片中脯氨酸含量顯著高于CK，處理24 h 時(shí)T2 處理的脯氨酸含量顯著高于T1 處理，比T1 處理提高了155.50%。隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，黃瓜幼苗葉片中可溶性蛋白含量呈先增加后降低的趨勢(shì)，T1 和T2 處理的可溶性蛋白含量從處理12 h 開(kāi)始顯著高于CK。低溫處理下黃瓜幼苗葉片中可溶性糖含量整體呈增加的趨勢(shì)，在低溫處理24 h 和48 h，T2 處理的可溶性糖含量顯著高于T1 處理，分別比T1 處理高出54.62%和17.02%；在低溫處理72 h 時(shí)，T1 和T2 處理的可溶性糖含量與CK 相比分別提高了124%和149%，均與CK 差異顯著。

2.4 低溫脅迫下外施肌醇對(duì)黃瓜幼苗抗氧化酶的影響

如圖5 所示，與CK 相比，T1 和T2 處理的抗氧化酶活性均有提高的趨勢(shì)。在低溫處理后0～6 h 內(nèi)，T1、T2 處理的SOD 和POD 活性沒(méi)有顯著差異；低溫處理24 h 后，T2 處理的SOD 和POD活性一直高于T1 處理，且24 h 時(shí)達(dá)到最高，并與T1 處理差異顯著；在72 h 時(shí)，T2 處理的POD 和CAT 活性顯著高于CK 和T1 處理，此時(shí)T2 處理的POD 和CAT 活性分別比CK 提高了62.44%和83.87%。

2.5 低溫脅迫下外施肌醇對(duì)黃瓜幼苗肌醇代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

由圖6-A 可見(jiàn)，低溫處理和外施肌醇能夠顯著影響肌醇代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平。肌醇代謝相關(guān)酶有肌醇半乳糖苷合酶（Gols）、磷脂酰肌醇合酶（PIS）和肌醇加氧酶MIOX（Taji et al.，2002；Pendaries et al.，2005；Zhuo et al.，2012），其中肌醇加氧酶基因CsMIOX1迅速響應(yīng)，低溫處理后3 h 其表達(dá)水平顯著高于其他基因，T2 處理的CsMIOX1基因相對(duì)表達(dá)量超出T1 處理的2 倍左右。對(duì)CsMIOX1基因進(jìn)行低溫處理72 h 內(nèi)水平變化分析發(fā)現(xiàn)（圖6-B），低溫脅迫處理3～12 h，CsMIOX1的相對(duì)表達(dá)量增加，且外施肌醇的T2 處理的CsMIOX1的相對(duì)表達(dá)量一直顯著高于T1 處理，3 h 時(shí)T2 處理CsMIOX1的相對(duì)表達(dá)量最大，與CK 相比，T1 處理和T2 處理的CsMIOX1表達(dá)量分別上升了3.68 倍和10.64 倍；12 h 時(shí)，T1、T2處理與CK 相比分別上升1.44、3.65 倍。在處理后期，T2 處理和T1 處理的CsMIOX1表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異。說(shuō)明低溫條件下外施肌醇能夠改變肌醇代謝基因的表達(dá)水平，其中CsMIOX1基因水平強(qiáng)烈響應(yīng)低溫脅迫和噴施外源肌醇。

3 討論與結(jié)論

低溫脅迫是影響植物正常生長(zhǎng)的不利因素之一，尤其是早春和冬季黃瓜設(shè)施栽培中，低溫是作物生長(zhǎng)的主要限制因子。有研究發(fā)現(xiàn)外源肌醇能夠提高水稻低溫抗性（郭元飛 等，2014），但是肌醇在蔬菜作物上的應(yīng)用研究鮮有報(bào)道。與常規(guī)噴施外源物質(zhì)不同的是，肌醇是AsA 合成過(guò)程肌醇途徑的底物，說(shuō)明肌醇除了作為滲透物質(zhì)調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，還可以作為底物合成關(guān)鍵的抗氧化物質(zhì)AsA（Valluru &Ende，2011）。AsA 作為植物逆境條件下產(chǎn)生的非酶抗氧化物質(zhì)，在植物受到低鹽、臭氧、紫外線、低氮、低溫脅迫時(shí)含量提高（Zhang et al.，2016），AsA 能夠?qū)2O2還原為脫氫抗壞血酸（DHA），AsA 和DHA 在抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)中相互轉(zhuǎn)化（許英 等，2015）。本試驗(yàn)結(jié)果表明，整體來(lái)看，低溫脅迫下黃瓜幼苗中AsA 和T-AsA含量有所增加，且噴施肌醇可以進(jìn)一步提高AsA及T-AsA 的含量。

本試驗(yàn)中低溫處理初期，T1、T2 處理的黃瓜幼苗MDA、H2O2和含量顯著增加，但是二者沒(méi)有顯著差異。植物受到脅迫產(chǎn)生活性氧激活抗氧化酶系統(tǒng)，通過(guò)自身抗氧化酶活性來(lái)清除活性氧維持正常代謝（Miller，2004；Rubio et al.，2005），低溫處理開(kāi)始階段噴施肌醇的T2 處理的抗氧化酶系統(tǒng)活性和滲透物質(zhì)含量與未噴施肌醇的T1 處理沒(méi)有顯著差異。低溫處理12 h 時(shí)，T2 處理的AsA和T-AsA 含量最高，且顯著高于T1 處理；此時(shí)T2 處理的H2O2含量顯著低于T1 處理，但T1 和T2 處理的抗氧化酶系統(tǒng)活性還沒(méi)有顯著差異。低溫處理3 h 時(shí)，與CK 相比噴施肌醇的T2 處理的DHA 含量顯著增加，說(shuō)明低溫開(kāi)始后植株內(nèi)已有的AsA 在清除活性氧之后被氧化為DHA（Noctor，2006）。低溫處理12～48 h 時(shí)，T2 處理的H2O2含量一直顯著低于T1 處理，從24 h 開(kāi)始，T2 處理的SOD 和POD 活性才開(kāi)始高于T1 處理，抗氧化酶活性的升高使植株抗性增加（錢(qián)恒彥 等，2019），此時(shí)T2 處理的脯氨酸和可溶性糖含量顯著高于T1處理；至低溫處理48 h 時(shí)，T2 處理的過(guò)氧化氫含量、含量、MDA 含量均顯著低于T1 處理，可能是由于植株累積的AsA 能夠清除活性氧，減少了抗氧化酶系統(tǒng)壓力，從而植株受低溫?fù)p傷較小。以上現(xiàn)象說(shuō)明，在低溫處理開(kāi)始后，外施肌醇的植株內(nèi)迅速累積AsA，葉片吸收肌醇后生成更多的AsA（Lorence et al.，2004；Endres &Tenhaken，2009），這個(gè)結(jié)果與在轉(zhuǎn)基因番茄上飼喂肌醇提高了AsA 含量結(jié)果一致（Munir et al.，2020）。

有研究發(fā)現(xiàn)MIOX基因與抗性顯著相關(guān)。MIOX基因受環(huán)境脅迫調(diào)控，干旱條件誘導(dǎo)MIOX表達(dá)，過(guò)表達(dá)MIOX基因能夠提高植株抗氧化酶活性和抗堿性，在水稻中過(guò)表達(dá)OsMIOX能夠通過(guò)降低轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)自由基含量來(lái)提高水稻抗旱性（王海光 等，2007；Duan et al.，2012；Chen et al.，2015）。與野生型植株相比，過(guò)表達(dá)MIOX4擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的AsA 含量提高了2～3 倍（Lorence et al.，2004）；飼喂肌醇后過(guò)表達(dá)MIOX轉(zhuǎn)基因擬南芥內(nèi)肌醇含量一直低于野生型植株（Endres &Tenhaken，2009）。根據(jù)本試驗(yàn)研究結(jié)果，低溫處理誘導(dǎo)黃瓜幼苗CsMIOX1表達(dá)，外施肌醇后肌醇加氧酶作用的底物增加，CsMIOX1進(jìn)一步被誘導(dǎo)表達(dá)，從而生成更多抗壞血酸抵抗低溫脅迫，此結(jié)果與Munir 等（2020）的研究結(jié)果一致。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，低溫脅迫下外施肌醇能夠顯著增加植株干鮮質(zhì)量，降低電解質(zhì)外滲率，緩解低溫?fù)p害。肌醇作為底物生成更多抗壞血酸，抗壞血酸的累積能夠清除活性氧，抗氧化酶系統(tǒng)活性升高；此外，肌醇加氧酶基因表達(dá)水平在外施肌醇后顯著上升，進(jìn)一步說(shuō)明MIOX 發(fā)揮作用使肌醇生成了更多抗壞血酸。綜上所述，外施肌醇能夠提高黃瓜幼苗的抗壞血酸含量和抗氧化酶活性，提高植株的抗冷性。