熊亞，李敏杰*，劉姍

（1.攀枝花學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，四川攀枝花617000；2.攀枝花市干熱河谷特色生物資源工程技術(shù)中心，四川攀枝花617000）

桑葚，又名桑椹子、桑蔗、桑棗等，桑樹的成熟果實(shí)，為?？浦参锷涞墓?。成熟的桑葚質(zhì)地油潤(rùn)，酸甜適口，以個(gè)大、肉厚、色紫紅、糖分足者為佳[1]。現(xiàn)代研究證實(shí)，桑葚果實(shí)中含有豐富的活性蛋白、維生素、氨基酸、胡蘿卜素、礦物質(zhì)、白藜蘆醇、花青素等成份，具有很好的預(yù)防血管硬化和癌癥、抗衰老等多種功效[2-5]。

草莓屬于多年生草本植物，富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如維生素C、維生素A、維生素E、胡蘿卜素、鞣酸、天冬氨酸、銅、草莓胺、果膠、纖維素、葉酸、鐵、鈣、鞣花酸與花青素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高[6-7]。更值得注意的是草莓中的維生素C 含量比蘋果、葡萄都高7～10 倍，另外蘋果酸、檸檬酸、維生素B1、維生素B2，以及胡蘿卜素、鈣、磷、鐵的含量也比蘋果、梨、葡萄高3～4 倍[8-10]。

復(fù)合果酒是由多種新鮮水果混合發(fā)酵而成的含酒精型飲料，它結(jié)合了各種水果原料的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，互為補(bǔ)充，它含有更多的糖、礦物質(zhì)、有機(jī)酸、維生素、氨基酸等多種營(yíng)養(yǎng)成分[11]。果酒也是一種良好的抗氧化劑，由于果酒是由各種新鮮且富含多種營(yíng)養(yǎng)成分的水果發(fā)酵而成的，它不僅含有多種氨基酸、芳香酯、有機(jī)酸、維生素和礦物質(zhì)，而且含有豐富的抗氧化物質(zhì)。有研究表明，這些抗氧化劑比維生素具有更強(qiáng)的抗氧化活性[12]。由于草莓香味濃顏色淺，而桑葚味淡顏色深，兩種水果形成良好的互補(bǔ)，不但能夠彌補(bǔ)相互的缺陷，發(fā)揮自身的優(yōu)勢(shì)，滿足人們對(duì)營(yíng)養(yǎng)和保健的需求，也能夠在一定程度上開拓果酒市場(chǎng)[13-16]。選用這兩種水果釀造成復(fù)合果酒，可獲得口感好、營(yíng)養(yǎng)全面、保健效果好的果酒。它開辟了新興果酒市場(chǎng)，解決了草莓、桑葚不易保存和運(yùn)輸?shù)膯栴}，使人們?cè)谌魏螘r(shí)候都能享受到美味。本試驗(yàn)通過對(duì)桑葚-草莓復(fù)合果酒動(dòng)力學(xué)模型的研究，對(duì)探索和優(yōu)化復(fù)合果酒的優(yōu)良釀造工藝，對(duì)復(fù)合果酒市場(chǎng)開發(fā)及擴(kuò)大化生產(chǎn)有著積極的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及儀器

桑葚、草莓：攀枝花學(xué)院水果超市；果膠酶（105U/g）：湖北興銀河醫(yī)藥有限公司；高活性酵母：安琪酵母股份有限公司；氫氧化鈉（分析純）、亞硫酸（≥99.8%，分析純）、無水檸檬酸（食品級(jí)）：成都科龍化工試劑廠。

1.2 主要儀器與設(shè)備

電子天平（FA1204B）：上海天平儀器廠；顯微鏡（SGO-PH300）：深圳市深視光谷光學(xué)儀器有限公司；手持式糖度儀（WS105 型）：上海普振生物科技有限公司；電熱恒溫水浴鍋（DZKW-S-8）：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；酒精計(jì)（0-40 型）：河間市宏利玻璃儀器廠；精密pH 計(jì)（PHS-3B）：上海圣科儀器設(shè)備有限公司；榨汁機(jī)（T2264MD）：上海九陽股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 復(fù)合發(fā)酵酒生產(chǎn)工藝

1.3.1.1 水果的挑選及處理

挑選成熟飽滿、無病蟲害及無損傷的新鮮桑葚、草莓。將選擇后的草莓、桑葚沖洗干凈后，撈出瀝干，備用。

1.3.1.2 混合榨汁

將處理好桑葚和草莓以2∶3 的質(zhì)量比混合，加入適量純凈水，榨汁機(jī)榨汁。

1.3.1.3 酶解

果膠酶按照40 mg/L 的量添加以增加出汁率，SO2添加量為60 mg/L，以防止雜菌污染。

1.3.1.4 成分調(diào)整

酵母菌按40 mg/L 發(fā)酵液的量進(jìn)行接種，添加白砂糖調(diào)節(jié)初始糖度為22°，加入檸檬酸調(diào)節(jié)果汁初始pH 值為4。

1.3.1.5 發(fā)酵

在室溫下（25 ℃）進(jìn)行發(fā)酵，當(dāng)發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵現(xiàn)象不明顯且發(fā)酵液比重＜1 時(shí)，發(fā)酵結(jié)束。

1.3.1.6 過濾

將發(fā)酵酒液用3 層滅菌紗布過濾，以濾去發(fā)酵過程中死亡的酵母以及殘存下來的果渣。

1.3.1.7 陳釀

將發(fā)酵過濾后的果酒靜置兩周左右，待酒液澄清后進(jìn)行果酒的裝瓶、貯存。

1.3.2 酵母菌數(shù)量的測(cè)定

采用血球板計(jì)數(shù)法測(cè)定發(fā)酵過程中酵母菌數(shù)量。

1.3.3 總糖含量的測(cè)定

采用3-5-二硝基水楊酸比色法[17]測(cè)定發(fā)酵過程中總糖含量。

1.3.4 酒精度含量的測(cè)定

采取蒸餾法[18]進(jìn)行酒精度含量的測(cè)定。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Origin8.6 軟件進(jìn)行菌體生長(zhǎng)量、酒精生成量和總糖消耗量的非線性擬合。通過回歸曲線得到動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)，建立酵母菌菌體生長(zhǎng)、酒精生成和總糖消耗的動(dòng)力學(xué)模型方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葚-草莓復(fù)合果酒發(fā)酵過程主要指標(biāo)變化情況

桑葚-草莓復(fù)合果酒發(fā)酵過程主要指標(biāo)變化曲線見圖1。

圖1 桑葚-草莓復(fù)合果酒發(fā)酵過程主要指標(biāo)變化曲線Fig.1 Change curves of main indexes of the fermentation process of compound wine

由圖1 可知，在發(fā)酵前2 d，酵母菌數(shù)量增長(zhǎng)較為平緩，這是由于酵母菌代謝系統(tǒng)為適應(yīng)新環(huán)境的需要，處于生長(zhǎng)代謝適應(yīng)階段。從第3 天開始其數(shù)量快速增長(zhǎng)，這是因?yàn)榻湍妇堰m應(yīng)環(huán)境，能夠大量利用發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在第7 天數(shù)量達(dá)到最大值，為7.56×107個(gè)/mL，從第8 天開始逐漸減少，說明酵母菌負(fù)生長(zhǎng)速率開始大于正生長(zhǎng)速率，屬于衰亡期。總糖含量隨時(shí)間的變化在發(fā)酵的前3 天緩慢減少，可能是由于酵母菌在前3 d 處于適應(yīng)生長(zhǎng)階段。從第3 天開始，總糖含量急劇減少，可能是由于酵母菌大量繁殖，導(dǎo)致底物大量消耗。從第8 天開始，總糖含量減少趨勢(shì)緩慢，并逐漸趨于穩(wěn)定，這可能是由于酵母菌也在這一時(shí)期開始逐漸衰亡，底物消耗逐漸減弱，這也預(yù)示著發(fā)酵基本完成。發(fā)酵過程中酒精度含量在發(fā)酵前2 d 變化很小，是由于酵母菌處于生長(zhǎng)適應(yīng)階段，還未完全進(jìn)行產(chǎn)酒精作用。從發(fā)酵第3 天開始，酒精度快速上升，這是因?yàn)榻湍妇_始大量繁殖，將糖轉(zhuǎn)化為酒精，導(dǎo)致酒精度大幅度上升，在發(fā)酵第10 天酒精度達(dá)到最大值，為13.4%vol。從酵母菌生長(zhǎng)、酒精度及總糖含量隨發(fā)酵的變化上看，酵母菌菌體數(shù)量曲線和酒精度生成曲線的變化趨勢(shì)相同，三者之間相互聯(lián)系，其變化符合發(fā)酵規(guī)律。

2.2 酵母菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型建立

酵母菌的生長(zhǎng)曲線呈“S”型，因此可以用Logistic模型應(yīng)用于果酒發(fā)酵過程進(jìn)行模擬[19]，Logistic 方程是用來表現(xiàn)菌體生長(zhǎng)與營(yíng)養(yǎng)底物之間的非線性關(guān)系的經(jīng)驗(yàn)方程[16]。Logistic 方程如下。

式中：Y 表示發(fā)酵過程中酵母菌的數(shù)量，×107個(gè)/mL；A1表示初始酵母菌數(shù)，×107個(gè)/mL；A2表示最終酵母菌數(shù)，×107個(gè)/mL；x 表示發(fā)酵時(shí)間，d；x0、p 為方程系數(shù)。

通過origin8.6 軟件對(duì)菌體數(shù)量和方程式（1）進(jìn)行擬合，得到A1=2.722 35，A2=7.312 54，x0=4.038 37，p=7.663 67，帶入式（1）得酵母菌數(shù)量隨發(fā)酵過程變化的動(dòng)力學(xué)模型為式（2）。

酵母菌生長(zhǎng)試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值模型擬合曲線如圖2所示。

圖2 酵母菌生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值模型擬合曲線Fig.2 Fitness curve of test values of yeast growth and prediction values

由圖2 可知，發(fā)酵過程中酵母菌的變化曲線與其擬合曲線的復(fù)合度較好，桑葚-草莓復(fù)合果酒發(fā)酵過程中的Logistic 模型R2=0.978 85，酵母菌數(shù)量的試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值能夠較好的擬合，表明該模型能較好的反應(yīng)酵母菌的生長(zhǎng)發(fā)育情況。

2.3 底物總糖消耗動(dòng)力學(xué)模型

在復(fù)合果酒的發(fā)酵過程中，總糖的消耗模型包括底物消耗以維持細(xì)胞呼吸新陳代謝作用、供給菌體生長(zhǎng)、形成產(chǎn)物3 個(gè)部分[20]。通過物料平衡，利用Boltzmann模型建立方程如下。

式中：Y 為總糖含量，g/L；A1為初始總糖含量，g/L；A2為總糖終濃度，g/L；x0、dx 為方程系數(shù)；x 為發(fā)酵時(shí)間，d。

通過origin8.6 軟件對(duì)總糖含量和方程式（3）進(jìn)行擬合，得A1=232.218 19，A2=15.649 97，x0=5.219 53，dx=1.414 81，帶入式（3）得總糖含量隨發(fā)酵進(jìn)程變化的動(dòng)力學(xué)模型。

總糖消耗試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值模型擬合曲線見圖3。

圖3 總糖含量與預(yù)測(cè)值模型擬合曲線Fig.3 Fitness curve of test values and prediction values of total sugar content

如圖3 所示，發(fā)酵過程中總糖含量隨發(fā)酵時(shí)間的變化曲線與其擬合曲線的吻合程度極高，此動(dòng)力學(xué)模型的R2=0.996 54，說明總糖含量的試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值能夠很好的擬合，該模型能很好的反映總糖消耗情況。

2.4 產(chǎn)物酒精生成動(dòng)力學(xué)模型

不同時(shí)間的酒精度含量數(shù)據(jù)，用origin8.6 作圖軟件進(jìn)行非線性擬合，得到復(fù)合果酒生產(chǎn)中產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型。

式中：Y 表示發(fā)酵過程中的酒精度，%vol；A1表示初始酒精度，%vol；A2表示最終酒精度，%vol；x 表示發(fā)酵時(shí)間，d；x0、p 為方程系數(shù)。

通過origin8.6 軟件對(duì)發(fā)酵過程中酒精度數(shù)據(jù)和方程式（5）進(jìn)行擬合，得到A1=1.184 98，A2=20.406 54，x0=7.473 71，P=1.950 6，帶入式（5）得酒精度隨發(fā)酵過程變化的動(dòng)力學(xué)模型。

圖4 酒精度產(chǎn)量與預(yù)測(cè)值模型擬合曲線Fig.4 Fitness curve of test values and prediction values of alcohol production

酒精度產(chǎn)量與預(yù)測(cè)值模擬擬合曲線如圖4 所示。酒精度產(chǎn)量與預(yù)測(cè)值模型擬合曲線的R2=0.994 1，說明在發(fā)酵過程中酒精生成動(dòng)力學(xué)模型的預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值相對(duì)誤差較小，其擬合度高。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以桑葚、草莓為原料，混合榨汁后加入酵母進(jìn)行發(fā)酵，得到酒液透亮清澈，色澤呈深紅色，帶有草莓清香的復(fù)合果酒。在桑葚-草莓復(fù)合果酒的發(fā)酵過程中對(duì)菌體量、酒精度、總糖含量進(jìn)行測(cè)定，隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)行，這3 個(gè)參數(shù)出現(xiàn)了規(guī)律性的變化。發(fā)酵完成后復(fù)合果酒的酒精度為13.4%vol，殘?zhí)呛繛?4 g/L；采用Origin8.6 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用Logistic 方程建立了桑葚-草莓復(fù)合果酒發(fā)酵的菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)酒精動(dòng)力學(xué)模型，用Boltzmannm 模型建立了總糖消耗的動(dòng)力學(xué)模型，其決定系數(shù)R2分別為0.979、0.997、0.994，均大于0.9。所以，采用的動(dòng)力學(xué)模型預(yù)測(cè)與實(shí)際果酒發(fā)酵的情況符合度都很好，表明此動(dòng)力學(xué)模型能較好的描述桑葚-草莓復(fù)合果酒發(fā)酵過程中基質(zhì)、產(chǎn)物、酵母菌的變化。

通過桑葚-草莓復(fù)合果酒發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的建立，對(duì)掌握酵母菌的生理特征，酒精生產(chǎn)的優(yōu)化條件，以及各發(fā)酵指標(biāo)之間的關(guān)系，為工業(yè)化生產(chǎn)桑葚-草莓復(fù)合果酒提供一定的參考價(jià)值。