荊 鋒，宋志紅

陜西省渭南市大荔縣醫(yī)院：1.眼科;2.外三科,陜西渭南 715103

葡萄膜炎是臨床中常見(jiàn)的致盲性眼科疾病，主要累及葡萄膜、視網(wǎng)膜、視網(wǎng)膜血管與玻璃體。該病好發(fā)于青壯年，病情較長(zhǎng)，且存在反復(fù)發(fā)作等特點(diǎn)，治療難度較大[1]。有研究指出，葡萄膜炎在我國(guó)致盲性眼病中排4～7位[2]。有研究指出，我國(guó)葡萄膜炎疾病中以Behcet病與Vogt-小柳原田綜合征(VKH))為主[3]。目前，多數(shù)研究認(rèn)為葡萄膜炎是一種炎癥性疾病與免疫性疾病，但具體病因至今仍不明確，但大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為感染與免疫反應(yīng)參與葡萄膜炎的發(fā)生[4-5]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，作為固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體被認(rèn)為參與了多種疾病的發(fā)生與預(yù)后，其在眼科疾病中的作用亦被多數(shù)學(xué)者認(rèn)可，但其在葡萄膜炎中的的作用臨床中研究較少。故筆者結(jié)合自身臨床實(shí)踐選取290例葡萄膜炎患者作為研究對(duì)象，旨在研究NLRP3在葡萄膜炎發(fā)生及預(yù)后中的作用，旨在為臨床中該病患者診斷治療提供幫助，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年4月至2020年2月本院收治的葡萄膜炎患者290例作為觀察組，另選取同期在本院體檢健康者280例作為對(duì)照組。觀察組男155例，女135例，年齡26～42歲，平均(32.33±4.68)歲，均為中間型葡萄膜炎患者；對(duì)照組男143例，女137例，年齡25～43歲，平均(32.87±4.73)歲。2組性別、年齡等一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)本研究獲得患者或其家屬同意，并簽署知情同意書；(2)玻璃體炎性細(xì)胞多于前房炎性細(xì)胞、玻璃體內(nèi)典型雪球狀混濁、特征性雪堤樣病變、伴有后囊下白內(nèi)障、黃斑囊樣水腫、視盤炎、視網(wǎng)膜周邊血管炎等患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有其他眼科疾病如青光眼、結(jié)膜炎等患者；(2)患有嚴(yán)重的免疫疾病者；(3)患有精神抑郁類疾病或是長(zhǎng)期服用相關(guān)藥物者；(4)患者存在眼部疾病史或手術(shù)史者。

1.3方法

1.3.1試劑與儀器 4 ℃低溫高速離心機(jī)購(gòu)自長(zhǎng)沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，熒光定量PCR儀購(gòu)自西安天隆科技有限公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自上海賽默科技生物發(fā)展有限公司，淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司，酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購(gòu)自南京信帆生物技術(shù)有限公司，RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒均為天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)。

1.3.2標(biāo)本采集 抽取受試者清晨空腹靜脈血6 mL共分為2份，1份至于室溫下凝血后采用3 000 r/min離心10 min得到血清；另1份用肝素抗凝后，加入淋巴細(xì)胞分離液后離心，抽取懸浮于中層的單個(gè)核細(xì)胞備用。取血清標(biāo)本按照酶聯(lián)免疫吸附試劑盒說(shuō)明書中步驟，配置蛋白濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品、適當(dāng)稀釋血清標(biāo)本，隨后進(jìn)行點(diǎn)樣抗體孵育、洗板等操作，最后在酶標(biāo)儀上讀取450 nm處的吸光值(A450)，對(duì)白細(xì)胞介素(IL)-1β表達(dá)水平進(jìn)行記錄觀察。取外周血單個(gè)核細(xì)胞，采用RNA抽提試劑盒提取細(xì)胞中的RNA，隨后紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度后取2 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA樣本后即逆行PCR擴(kuò)增，NLRP3引物序列參考文獻(xiàn)[6]，經(jīng)溶解曲線驗(yàn)證后用于實(shí)驗(yàn)。

1.4觀察指標(biāo) 檢測(cè)2組受試者NLRP3表達(dá)與IL-1β水平，隨后根據(jù)文獻(xiàn)[6]標(biāo)準(zhǔn)對(duì)患者疾病嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分，結(jié)膜睫狀充血記1分，房水細(xì)胞或房水閃輝陽(yáng)性記1分，角膜后沉著物記1分，虹膜粘連記1分，伴玻璃體細(xì)胞、黃斑囊樣水腫、并發(fā)白內(nèi)障或繼發(fā)性青光眼等并發(fā)癥的其中任何一項(xiàng)記1分，計(jì)算患者總得分，并分析評(píng)分與NLRP3、IL-1β的相關(guān)性。對(duì)觀察組患者隨訪3個(gè)月，根據(jù)其治療效果分為預(yù)后良好組、預(yù)后較差組。療效判定根據(jù)本院自制的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，預(yù)后良好組：患者臨床癥狀表現(xiàn)消失，視力提高1～3行，3個(gè)月內(nèi)無(wú)復(fù)發(fā)；預(yù)后較差組：患者臨床癥狀無(wú)明顯改善，視力無(wú)明顯提高或下降，眼底熒光血管造影視網(wǎng)膜血管滲漏有所減輕，但改善程度較小。分析2組患者NLRP3、IL-1β表達(dá)情況，采用受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析NLRP3與IL-1β對(duì)預(yù)后良好患者的預(yù)測(cè)價(jià)值。

2 結(jié) 果

2.12組NLRP3相對(duì)表達(dá)水平與IL-1β水平比較 觀察組NLRP3相對(duì)表達(dá)水平[(245.43±30.58)]、IL-1β水平[(78.73±9.08)ng/L]均高于對(duì)照組[(105.33±14.85)、(13.84±2.03)ng/L]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=69.187，P<0.001；t=116.794，P<0.001)。見(jiàn)圖1。

2.2觀察組患者疾病嚴(yán)重程度與NLRP3、IL-1β的相關(guān)性 290例患者疾病嚴(yán)重程度評(píng)分為(4.61±1.27)分，采用Pearson相關(guān)分析顯示，疾病嚴(yán)重程度評(píng)分與NLRP3、IL-1β均呈正相關(guān)。見(jiàn)圖2、3。

圖1 觀察組與對(duì)照組NLRP3相對(duì)表達(dá)水平及IL-1β水平柱狀圖

圖2 疾病嚴(yán)重程度評(píng)分與NLRP3的相關(guān)性

圖3 疾病嚴(yán)重程度評(píng)分與IL-1β的相關(guān)性

2.3隨訪3個(gè)月預(yù)后良好組與預(yù)后較差組患者NLRP3相對(duì)表達(dá)水平及IL-1β水平比較 隨訪3個(gè)月預(yù)后良好組患者188例，預(yù)后較差組患者102例，預(yù)后良好組患者NLRP3相對(duì)表達(dá)水平[(155.32±25.38)]、IL-1β水平[(43.28±7.65)ng/L]均低于預(yù)后較差組[(193.27±28.82)、(58.39±8.66)ng/L]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.561，P<0.001；t=12.653，P<0.001)。見(jiàn)圖4。

圖4 預(yù)后良好組與預(yù)后較差組NLRP3相對(duì)表達(dá)水平及IL-1β水平柱狀圖

2.4NLRP3、IL-1β對(duì)預(yù)后良好患者療效的預(yù)測(cè)價(jià)值 采用ROC曲線分析NLRP3、IL-1β對(duì)預(yù)后良好患者療效的預(yù)測(cè)價(jià)值，結(jié)果顯示，NLRP3、IL-1β預(yù)測(cè)預(yù)后良好組患者的AUC為0.884(95%CI：0.835～0.934)、0.880(95%CI：0.832～0.928)，最佳臨界值為178.52、51.17 ng/L，靈敏度為88.6%、84.1%，特異度為78.4%、82.4%。見(jiàn)表1、圖5。

表1 NLRP3、IL-1β對(duì)預(yù)后良好患者療效的預(yù)測(cè)價(jià)值

圖5 NLRP3、IL-1β對(duì)預(yù)測(cè)預(yù)后良好組患者療效的ROC曲線圖

3 討 論

葡萄膜炎的發(fā)病機(jī)制至今未得到證實(shí)，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為與自身免疫功能紊亂有較強(qiáng)的關(guān)系，且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明，免疫應(yīng)答、花生四烯酸、前列腺素、白三烯等炎癥因子的釋放會(huì)導(dǎo)致葡萄膜炎的發(fā)生[7-8]。隨著臨床研究的不斷深入，NLRP3炎癥小體進(jìn)入學(xué)者視線，有較多研究指出，NLRP3參與多類眼部疾病的發(fā)生及疾病進(jìn)展[9-11]。另有研究指出，NLRP3炎癥小體可活化IL-1β等細(xì)胞因子前體，使其成熟并釋放[12-13]，而IL-1β在葡萄膜炎中的作用亦十分重要，葡萄膜炎患者IL-1β水平會(huì)隨著疾病的進(jìn)展應(yīng)激性增高[14]。

本研究顯示，觀察組患者NLRP3相對(duì)表達(dá)水平與IL-1β水平均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明葡萄膜炎患者發(fā)病后NLRP3與IL-1β水平均會(huì)出現(xiàn)應(yīng)激性升高。有研究指出，葡萄膜炎患者NLRP3與IL-1β水平可出現(xiàn)顯著升高，這主要是因NLRP3激活Toll樣受體3/4通道，引起人體炎性反應(yīng)，隨著疾病的進(jìn)一步發(fā)展，活性氧簇被激活，導(dǎo)致IL-1β細(xì)胞因子前體被活化并大量釋放，最終引起NLRP3與IL-1β表達(dá)水平提升[15-16]。此外，活性氧簇可通過(guò)硫氧蛋白相互作用蛋白激活NLRP3炎癥小體，即當(dāng)活性氧簇水平升高時(shí)，掌握人體氧化能力的氧化還原酶硫氧還蛋白自生發(fā)生解離，而作為上配體的NLRP3因此得到激活，刺激其下游炎癥小體IL-1β水平提升，從而導(dǎo)致葡萄膜炎的發(fā)生與疾病進(jìn)展[17]。

本研究對(duì)患者疾病嚴(yán)重程度評(píng)分與NLRP3、IL-1β相關(guān)性分析顯示，疾病嚴(yán)重程度評(píng)分與NLRP3、IL-1β均呈正相關(guān)，表明NLRP3與IL-1β參與患者疾病進(jìn)程。本研究對(duì)患者隨訪3個(gè)月發(fā)現(xiàn)，預(yù)后良好組患者NLRP3與IL-1β水平均低于預(yù)后較差組。ROC曲線分析顯示，NLRP3、IL-1β預(yù)測(cè)預(yù)后良好組患者的AUC分別為0.884(95%CI：0.835～0.934)、0.880(95%CI：0.832～0.928)，NLRP3與IL-1β對(duì)患者的預(yù)后具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值，說(shuō)明NLRP3與IL-1β參與了患者疾病預(yù)后進(jìn)程。NLRP3胞內(nèi)某些模式識(shí)別受體能夠感受到細(xì)胞外的危險(xiǎn)信號(hào)，這有助于炎癥因子的成熟，從而參與人體免疫反應(yīng)。NLRP3是目前研究較多的炎癥小體，其功能異常與許多先天、后天免疫性疾病有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，NLRP3與IL-1β參與葡萄膜炎患者的疾病進(jìn)程及預(yù)后，且二者與疾病嚴(yán)重程度也具有關(guān)系，可能是NLRP3與IL-1β之間相互影響所致。NLRP3可識(shí)別各種外源性、內(nèi)源性炎癥信號(hào)，通過(guò)不同的識(shí)別受體，促進(jìn)炎癥因子的生成，并產(chǎn)生炎癥免疫反應(yīng)；IL-1β是白細(xì)胞介素家族中的重要組成因子，主要由單核巨噬細(xì)胞合成與分泌，當(dāng)NLRP3被活化后，將前體形式的IL-1β剪切成為成熟具有活性的炎癥因子，從而參與到人體疾病的進(jìn)展與發(fā)展中[18]。

綜上所述，NLRP3作為固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其參與了葡萄膜炎疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后進(jìn)程。NLRP3被活化后可激活下游IL-1β炎癥因子的分泌，共同參與葡萄膜炎疾病發(fā)展。但NLRP3在葡萄膜炎患者中的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步明確，以期為臨床中葡萄膜炎患者的治療提供全新靶點(diǎn)。