曾張琴 綜述，董家書 審校

廣西醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院檢驗科，廣西柳州 545005

由人類免疫缺陷病毒(HIV)引起的獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)，即艾滋病，在全球范圍內(nèi)廣泛流行，是一種至今尚無有效療法的致命性傳染病?，F(xiàn)有的抗病毒藥物雖然在某種程度上可以緩解病情，但AIDS的治療問題還是沒有解決：藥物本身的毒性作用與昂貴價格，長期用藥導(dǎo)致的耐藥病毒株，整合到宿主基因組中的病毒基因等[1-2]。針對傳統(tǒng)藥物的上述弊端，尋找新的治療靶點成為HIV藥物研究的重要方向[3]。

1 HIV侵染機制

HIV可分為HIV-1和HIV-2兩種亞型，其中HIV-1致病性強，是引起AIDS的主要病原體。HIV-1感染機體免疫細(xì)胞除了需要CD4受體外，還需要CC趨化因子受體5(CCR5)或CXC趨化因子受體4(CXCR4)作為輔助受體。HIV侵染機體細(xì)胞主要包括3個步驟[4]：病毒包膜糖蛋白gp120與細(xì)胞表面蛋白受體CD4結(jié)合，病毒吸附在細(xì)胞表面；隨后病毒gp120再與細(xì)胞表面輔助受體CCR5或CXCR4結(jié)合，病毒的第2個包膜蛋白gp41暴露出來；最后，病毒的gp41構(gòu)象發(fā)生一系列改變，其N末端片段插入細(xì)胞膜，導(dǎo)致病毒包膜與細(xì)胞膜發(fā)生融合，病毒內(nèi)容物RNA進入細(xì)胞內(nèi)。HIV-1通過何種途徑感染細(xì)胞決定于病毒的嗜性。T細(xì)胞嗜性的病毒株主要通過CXCR4感染細(xì)胞，稱為X4嗜性；單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞嗜性的病毒株主要通過CCR5感染機體細(xì)胞，稱為R5嗜性；而R5/X4嗜性的病毒既可以通過CCR5也可以通過CXCR4感染細(xì)胞。此外，在感染的不同階段，病毒利用的輔助受體也有所不同。一般在感染早期階段，病毒主要通過CCR5感染機體細(xì)胞，隨著病程延長，HIV-1由R5嗜性逐漸向R5/X4雙嗜性轉(zhuǎn)變，感染晚期以X4嗜性病毒株占主導(dǎo)，而單一的CXCR4途徑一般不會導(dǎo)致機體感染[5]。

2 CCR5的分子機制

2.1CCR5簡介 趨化因子是一類具有趨化活性的小分子細(xì)胞因子，它能募集細(xì)胞表面具有G蛋白耦聯(lián)受體的細(xì)胞聚集在一起，參與機體免疫平衡作用。迄今發(fā)現(xiàn)的趨化因子家族共有50多種成分，根據(jù)其N-末端2個半胱氨酸殘基位置的不同可分為4大類：CXC(或α)、CC(或β)、C(或γ)和CXC3C(或δ)。CCR5是CC亞族趨化因子(RANTES、MIP-α和MIP-β)的受體，主要表達(dá)在記憶性T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及未成熟的樹突狀細(xì)胞等細(xì)胞膜上，其表達(dá)量可被促炎癥因子上調(diào)[6]，具有調(diào)控T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞遷移、增殖及免疫反應(yīng)的功能。CCR5基因位于人3q21.3上，其mRNA長約3.6 Kb，共編碼352個氨基酸，相對分子質(zhì)量為40.6×103。CCR5具有G蛋白耦聯(lián)受體家族所特有的呈α螺旋的7個跨膜區(qū)(TM),在結(jié)構(gòu)上包括以下幾個部分：胞外N-末端、3個胞外環(huán)(ECL1-3)、3個胞內(nèi)環(huán)、7個跨膜α螺旋及胞內(nèi)C-末端?？缒^(qū)的氨基酸具有高度保守性，ECL1和ECL2以二硫鍵相連，以維持蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，其N-末端和ECL2對于CCR5與HIV的gp120結(jié)合起著關(guān)鍵的作用，目前研發(fā)的很多CCR5拮抗劑都是針對上述幾個位點[7-10]。

對CCR5研究發(fā)現(xiàn)，其基因發(fā)生多個突變的個體能有效抵抗HIV的感染，其中以編碼區(qū)CCR5Δ32研究最為廣泛[11-13]。CCR5Δ32是指CCR5基因編碼區(qū)的32個堿基發(fā)生缺失突變，即在CCR5等位基因編碼第185個氨基酸密碼子后的32個堿基發(fā)生缺失，導(dǎo)致讀碼框架錯位，ECL3結(jié)構(gòu)缺失，CCR5結(jié)構(gòu)不完整而喪失其輔助受體功能，因此，HIV無法通過gp120與CCR5結(jié)合侵襲細(xì)胞。CCR5Δ32是在歐洲人群中比較常見，而在黑種人、日本人和中國人中卻很少發(fā)現(xiàn)這種缺失突變型[11]。其突變包括CCR5Δ32/CCR5Δ32純合子型和CCR5/CCR5Δ32雜合子型，其中純合子只占小部分，絕大部分是雜合子型。純合子基因型對HIV感染有高度抵抗性，但也并非是絕對的；而雜合子基因型人群感染率也比一般人群低35%，其AIDS發(fā)病也較緩慢，一般可延長2～4年。并且CCR5突變?nèi)笔蛽碛姓Ｃ庖吖δ芎脱仔苑磻?yīng)，因此，關(guān)于CCR5位點的拮抗劑成為目前HIV藥物研發(fā)的熱點。

2.2CCR5拮抗劑 傳統(tǒng)的抗HIV-1藥物主要為反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑，主要通過和底物競爭結(jié)合酶或者與酶分子結(jié)合使其變性，進而破壞HIV-1的生活周期，從而達(dá)到抑制病毒復(fù)制的作用。這種藥物雖然在一定程度上推遲了病情的惡化，但同時也產(chǎn)生一些問題，如長期用藥導(dǎo)致病毒耐藥性的產(chǎn)生、昂貴的藥物價格、藥物的不良反應(yīng)等。因此，迫切需要研發(fā)新的、與以往藥理機制不同的抗HIV-1藥物[2]。目前，關(guān)于CCR5拮抗劑的藥物研究成為研究者們關(guān)注的熱點?？偟膩碚f，以CCR5為靶點的HIV-1受體拮抗劑主要包括以下幾大類:趨化因子衍生物、非肽類小分子化合物、單克隆抗體及肽類化合物等。

2.2.1CC類趨化因子 CC類趨化因子(如RANTES、MIP-α和MIP-β)作為CCR5的天然配體是HIV-1受體的天然拮抗劑，其作用機制主要是誘導(dǎo)CCR5內(nèi)吞作用。雖然低水平CC趨化因子在一定程度上可以保護細(xì)胞抵抗HIV-1感染，但由于天然趨化因子半衰期短，同時能誘導(dǎo)炎性反應(yīng)等缺陷而不適合臨床應(yīng)用[14]。與之相比，趨化因子衍生物不激活信號通路，通過誘導(dǎo)CCR5內(nèi)吞而減少HIV-1與受體結(jié)合，因此更具優(yōu)越性，其中主要以AOP-RANTER、重組人趨化因子CCL14(HCC-1)和vMIP-Ⅱ等為代表。AOP-RANTER是將AOP基團耦聯(lián)到RANTES氨基末端而產(chǎn)生的強CCR5拮抗劑。它可誘導(dǎo)細(xì)胞膜表面的CCR5不可逆的被內(nèi)吞，減少R5型HIV-1 gp120與CCR5結(jié)合，從而抑制病毒感染，并且AOP-RANTES不會產(chǎn)生趨化作用而引起相關(guān)不良反應(yīng)。HCC-1的蛋白水解產(chǎn)物通過促進細(xì)胞Ca2+釋放和CCR5內(nèi)吞作用，能使細(xì)胞膜上的CCR5表達(dá)量減少75%，具有較強的CCR5拮抗作用。vMIP-Ⅱ是由人單純皰疹病毒8編碼的趨化因子，能與大量CC類和CXC類細(xì)胞因子受體高親和力結(jié)合，能同時抑制由CCR5和CXCR4介導(dǎo)的HIV-1入侵，此類大分子拮抗劑主要由于生產(chǎn)成本高、口服利用度差等缺點而限制了其發(fā)展。

2.2.2非肽類小分子化合物 非肽類小分子化合物主要通過與跨膜區(qū)的關(guān)鍵氨基酸殘基組成的袋狀結(jié)構(gòu)結(jié)合，進而誘導(dǎo)ECL2發(fā)生構(gòu)象改變，使HIV-1 gp120無法與CCR5結(jié)合，從而阻斷了HIV-1侵襲細(xì)胞[15-16]。目前，研究的小分子化合物主要包括吡咯烷類化合物、托品烷類化合物、哌啶類化合物、螺環(huán)二酮哌嗪類化合物等。TAK-220是吡咯烷類化合物，其作用于CCR5跨膜α螺旋4、5、6，選擇性抑制RANTES和MIP-α與CCR5結(jié)合，不抑制MIP-β與CCR5作用，其口服生物利用度較好，與其他抗HIV-1藥物一起使用具有協(xié)同作用，具有較強的抗高耐藥性活性。SCH-C是小分子肟哌啶類化合物，也是第一個進入臨床使用的小分子CCR5拮抗劑，它與CCR5的1、2、3、7跨膜區(qū)結(jié)合，從而改變CCR5胞外區(qū)的構(gòu)象，可以有效地抑制R5型病毒株在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。對這類小分子化合物增加或修飾某些基團能明顯增強其抑制病毒作用和藥物吸收率。由于小分子化合物的生產(chǎn)成本較小分子蛋白少，能有效抑制HIV-1感染，同時不引起炎性反應(yīng)等優(yōu)點，目前這類藥物在CCR5拮抗劑研究中占主導(dǎo)地位，但小分子化合物不能下調(diào)細(xì)胞表面CCR5的表達(dá)，口服或注射藥物后易出現(xiàn)頭暈、嘔吐等不良反應(yīng)[17]，同時其藥效作用也受細(xì)胞類型和細(xì)胞表面CCR5水平的影響。

2.2.3單克隆抗體 CCR5的胞外結(jié)構(gòu)包括N-末端和ECL1-3，理論上可以為單克隆抗體提供多個抗原表位識別位點，但目前報道有效的單克隆抗體并不多，僅有PRO140、mAb004等幾種[18]。根據(jù)識別位點的不同，可將單克隆抗體分為以下3類：第1類，識別CCR5的N-末端；第2類，識別ECL2；第3類，識別CCR5多個胞外位點。其中，第二類單克隆抗體抑制病毒感染細(xì)胞的功效最強。雖然單克隆抗體具有高度靶向?qū)Ｒ恍?、半衰期較長等優(yōu)點，但由于它容易誘發(fā)機體產(chǎn)生中和抗抗體、引起過敏反應(yīng)、不能下調(diào)細(xì)胞表面CCR5表達(dá)等缺陷，因此極大地限制了其發(fā)展。

2.2.4CCR5肽類拮抗劑 CCR5肽類拮抗劑與單克隆抗體相似，主要通過與CCR5胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合而產(chǎn)生抑制病毒感染作用，但它不同于小分子拮抗劑產(chǎn)生的毒性作用，安全性較好。目前主要通過噬菌體肽庫篩選技術(shù)篩選出與靶蛋白特異性結(jié)合且具有高度親和力的多肽[19]。其具有制備成本低，制備的多肽活性高、組織穿透性較好、不易誘發(fā)機體免疫反應(yīng)等優(yōu)點。但由于多肽本身在體內(nèi)不穩(wěn)定，容易被機體消化降解。

2.3sCCR5拮抗HIV-1感染的推測 盡管上述4種CCR5拮抗劑都可有效抑制HIV-1感染，遏制AIDS的流行，但各自都有其缺陷，且由于其作用機制和作用位點較為單一，因此容易導(dǎo)致耐藥性產(chǎn)生。近年來，研究者在人血清中檢測到一種sCCR5蛋白分子的存在，其相對分子質(zhì)量約為22.0×103，大概是膜表面CCR5蛋白相對分子質(zhì)量的一半。針對膜受體特征性結(jié)構(gòu)的一系列單克隆抗體檢測發(fā)現(xiàn)，sCCR5蛋白包含N-末端、ECL1、ECL2及ECL2近C-末端尾部等結(jié)構(gòu)，且在血清中的濃度與血清中CCR5配體MIP-β濃度呈正相關(guān)[20]。通過提取PBMCs的RNA進行RT-PCR檢測和核酸測序分析發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物為單一的cDNA，且核苷酸序列與之前公布的CRR5 cDNA序列完全一致，因此推測出機體內(nèi)并不存在表達(dá)sCCR5的單獨DNA，sCCR5同樣來源于體內(nèi)CCR5的編碼序列，可能是膜CCR5在第5跨膜區(qū)的裂解產(chǎn)物[20]。DOI等[21]通過對合成的ECL2近C-末端的一段多肽檢測，發(fā)現(xiàn)其在有無CD4分子的情況下均能抑制R5和X4 HIV-1感染。與作用于單一位點的CCR5拮抗劑相比，sCCR5具有多個抗HIV-1感染結(jié)構(gòu)(N-末端、ECL2及ECL2近C-末端尾部結(jié)構(gòu))，由于sCCR5是天然存在于人血清中的蛋白質(zhì)分子，因此具有半衰期較長、毒性作用小、不易誘發(fā)機體不良反應(yīng)及中和抗體等優(yōu)點。

sCCR5潛在的功能目前尚不明確，推測sCCR5可通過以下幾個方面拮抗HIV-1感染：其一，sCCR5可通過與膜表面CCR5分子競爭HIV-1 gp120來抑制HIV-1感染作用。由于sCCR5包含N-末端、ECL2及ECL2近C-末端尾部結(jié)構(gòu)，因此具有與gp120結(jié)合的多個位點，可在gp120與CCR5作用的多個步驟中與gp120結(jié)合，引起其構(gòu)象發(fā)生改變，阻斷病毒包膜與細(xì)胞膜發(fā)生融合，使病毒的核酸物質(zhì)無法進入細(xì)胞。其二，sCCR5可通過阻斷膜表面CD4分子來抑制HIV-1感染機體細(xì)胞。KIM等[22]發(fā)現(xiàn)，無論gp120存在與否，裂解的膜表面CCR5均可與CD4分子形成復(fù)合物，且這種sCCR5和CD4在水平極低的情況下，復(fù)合物依然可形成。其三，sCCR5可間接通過CC類趨化因子來抑制HIV-1感染。由于血清中sCCR5與CC趨化因子存在正相關(guān)關(guān)系，推測二者可能存在促進對方表達(dá)分泌機制。如前所述，CC類趨化因子具有抑制HIV-1感染效應(yīng)，其作用機制主要包括2個方面:一方面，CC趨化因子作為CCR5的天然配體，可以與gp120競爭膜表面CCR5分子；另一方面，趨化因子還具有誘導(dǎo)CCR5內(nèi)吞作用，通過減少細(xì)胞膜上CCR5的數(shù)量從而達(dá)到抑制HIV-1感染作用。

3 小 結(jié)

綜上所述，sCCR5由于具有多個gp120結(jié)合位點及多條途徑拮抗HIV感染，且作為天然存在于人血清中的蛋白分子，具備安全性好、半衰期較長、不易誘發(fā)中和抗體及不良反應(yīng)等特點，因此是一種新穎的、理想的HIV-1拮抗劑。針對目前HIV-1流行的嚴(yán)重性和致命性，可用藥物的單一性及耐藥現(xiàn)象的普遍性等現(xiàn)狀，研制sCCR5并明確其作用機制對于HIV-1的預(yù)防和治療具有重要意義。