HPLC法測定藏藥三果湯中沒食子酸、三沒食子?；咸烟呛臀鍥]食子?；咸烟堑暮?/h1>
2021-03-16 07:53林艾和張艷嬌
中國民族民間醫(yī)藥 2021年4期
黃 寬 林艾和 張艷嬌 范 源,2*
1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；2.云南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，云南 昆明 650216
藏藥三果湯又名哲布湯，由余甘子、訶子、毛訶子組成，是藏藥中重要的常見基礎(chǔ)方，具有調(diào)節(jié)“隆”和“血”的功效。三果湯始載于《四部醫(yī)典》，具有治療瘟疫、紊亂熱癥、促使熱癥成型的作用[1]。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為三果湯方中余甘子味甘、酸、澀，歸肺、胃經(jīng)，性涼；訶子味苦、酸、澀，歸肺、大腸經(jīng)，性平；毛訶子味甘、澀，性平。三味藥合用具有清熱、調(diào)和氣血的功效。
現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，三果湯具有抗菌[2]、抗炎[3-4]、抗腫瘤[5-6]、抗氧化[7-8]、降糖[9]、降脂[10]等藥理作用。三果湯主要含有鞣質(zhì)酚酸類成分[11]，沒食子酸是鞣質(zhì)的重要組成成分，其常見的衍生物為1，3，6-O-三沒食子?；咸烟呛?，2，3，4，6-五-O-沒食子酰基葡萄糖，研究發(fā)現(xiàn)沒食子酸及其酯類衍生物都具有抗癌藥理活性[12-13]。目前研究單味藥的化學(xué)成分含量及藥理活性較為常見，而對三果湯復(fù)方研究較少。本研究針對三果湯中沒食子酸及其衍生物1，3，6-O-三沒食子?；咸烟恰?，2，3，4，6-五-O-沒食子?；咸烟沁M行含量測定，為提高藏藥三果湯質(zhì)量控制提供理論基礎(chǔ)。
1 儀器與試劑
Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，色譜柱為 Agilent Zorbax C18鍵合硅膠柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；DFY-600搖擺式高速萬能粉碎機(永康式速鋒工貿(mào)有限公司)；T-1000型電子天平(上海浦春計量儀器有限公司)；AB265-SMETTLER TOLEDO十萬分之一分析天平(梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司)。
沒食子酸(Gallica acid，GA)購自四川省維克奇生物科技有限公司(批號：wkq16081904)、1，3，6-O-三沒食子?；咸烟?1,3,6-tri-O-galloyl-β-D-glucose，TGG)購自武漢天植生物技術(shù)有限公司(批號：CFS201802)、1，2，3，4，6-五-O-沒食子?；咸烟?1,2,3,4,6-O-galloyl-D-glucose，PGG)購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司(批號：PRF10011001)；乙腈(色譜純)，磷酸(分析純)購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司；Agilent 1200高效液相色譜儀，色譜柱為 Agilent Zorbax C18鍵合硅膠柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；電子天平(購自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。
2 方法與結(jié)果
2.1 色譜條件 色譜條件：色譜柱為Agilent C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.1%磷酸水溶液；梯度洗脫：0～6 min，4%～8%；6～30 min，8%～20%；30～55 min，20%～40%；檢測波長260 nm；柱溫：25 ℃；流速：0.8 mL/min；進樣量為10 μL。色譜圖如圖1所示。
圖1 高效液相色譜圖
2.2 溶液的制備
2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取GA、3GG、PGG對照品3.9 mg、1.3 mg、0.7 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇配制成含GA、3GG、PGG 0.39 mg/mL、0.13 mg/mL、0.07 mg/mL的混合對照品溶液，用0.45 μm的微孔濾膜進行過濾處理，備用。
2.2.2 供試品溶液 取訶子、毛訶子、余甘子藥材(去核)各5.0 g，搗碎，加入100 mL餾水，浸泡30 min，煎煮3次，每次20 min，過濾，合并3次濾液，濃縮10 mL的三果湯水提物，吸取水提物1 mL，加50%甲醇定容50 mL容量瓶中，冷藏備用。用0.45 μm的微孔濾膜進行過濾處理，即得到樣品溶液。
2.3 線性關(guān)系考察 配制不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，在“2.1”項條件下依次連續(xù)進樣，以質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積(mAU*s)為縱坐標(biāo)(Y)進行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1，表明各成分均具有良好的線性關(guān)系。
表1 線性關(guān)系考察結(jié)果
2.4 精密度 試驗精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液，在“2.1”項條件下連續(xù)進樣6次，結(jié)果顯示GA、TGG、PGG峰面積RSD分別為1.22%、1.58%、1.01%，表明儀器精密度良好。
2.5 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，在“2.1”項條件下，分別于2、4、6、8、10、12 h進樣，結(jié)果顯示GA、TGG、PGG 10 h內(nèi)峰面積的RSD值分別為0.77%、1.39%、1.08%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.6 重復(fù)性試驗 取同一批三果湯粉末6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項條件下進樣，結(jié)果顯示GA、TGG、PGG含有量RSD分別為1.18%、0.37%、0.83%，表明該方法重復(fù)性良好。
2.7 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的同一批三果湯粉末6份，每份精密稱取5.0 g，按“2.2.2”項下方法制備供試溶液，加入GA、TGG、PGG對照品適量(約相當(dāng)于5.0 g樣品中所含GA、3GG和PGG的量)，再按“2.3”項下色譜條件，進樣10 μL，進行檢測，計算平均回收率。按“2.2.3”項下方法制備供試溶液，在“2.1”項條件下進樣。結(jié)果見表2。
2.8 含量測定 取3份不同批次余甘子樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項下條件下進樣，計算四種成分含有量。結(jié)果見表3。
表2 加樣回收率試驗 (n=9)
表3 含量測定結(jié)果
3 討論
三果湯作為傳統(tǒng)藏藥在臨床上應(yīng)用廣泛，且具有良好的臨床療效。鞣質(zhì)酚酸類化合物是三果湯的主要有效成分，易溶于水，故本研究采用水提的方式處理樣品。對比煎煮次數(shù)，結(jié)果顯示，煎煮三次時，含量達到最高。
預(yù)實驗分別以甲醇-水溶液、乙腈-水溶液、甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液作為流動相進行考察，當(dāng)乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相時，采用梯度洗脫，目標(biāo)峰的色譜圖峰拖尾得到改善，且峰形更好，達到更高的分離度，因此選定乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動相。另外，還對柱溫(25、30、35、40 ℃)和流速(0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 mL/min)進行了優(yōu)化，結(jié)果顯示，柱溫25 ℃、流速0.8 mL/min 時分離效果較佳。
本研究建立同時測定藏藥三果湯中沒食子酸、1，3，6-O-三沒食子?；咸烟?、1，2，3，4，6-五-O-沒食子?；咸烟呛康母咝б合嗌V法，供試品制備簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，專屬性高，結(jié)果可靠，可為三果湯質(zhì)量控制提供一定依據(jù)。
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1 儀器與試劑
Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，色譜柱為 Agilent Zorbax C18鍵合硅膠柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；DFY-600搖擺式高速萬能粉碎機(永康式速鋒工貿(mào)有限公司)；T-1000型電子天平(上海浦春計量儀器有限公司)；AB265-SMETTLER TOLEDO十萬分之一分析天平(梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司)。
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2 方法與結(jié)果
2.1 色譜條件 色譜條件：色譜柱為Agilent C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.1%磷酸水溶液；梯度洗脫：0～6 min，4%～8%；6～30 min，8%～20%；30～55 min，20%～40%；檢測波長260 nm；柱溫：25 ℃；流速：0.8 mL/min；進樣量為10 μL。色譜圖如圖1所示。
圖1 高效液相色譜圖
2.2 溶液的制備
2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取GA、3GG、PGG對照品3.9 mg、1.3 mg、0.7 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇配制成含GA、3GG、PGG 0.39 mg/mL、0.13 mg/mL、0.07 mg/mL的混合對照品溶液，用0.45 μm的微孔濾膜進行過濾處理，備用。
2.2.2 供試品溶液 取訶子、毛訶子、余甘子藥材(去核)各5.0 g，搗碎，加入100 mL餾水，浸泡30 min，煎煮3次，每次20 min，過濾，合并3次濾液，濃縮10 mL的三果湯水提物，吸取水提物1 mL，加50%甲醇定容50 mL容量瓶中，冷藏備用。用0.45 μm的微孔濾膜進行過濾處理，即得到樣品溶液。
2.3 線性關(guān)系考察 配制不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，在“2.1”項條件下依次連續(xù)進樣，以質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積(mAU*s)為縱坐標(biāo)(Y)進行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1，表明各成分均具有良好的線性關(guān)系。
表1 線性關(guān)系考察結(jié)果
2.4 精密度 試驗精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液，在“2.1”項條件下連續(xù)進樣6次，結(jié)果顯示GA、TGG、PGG峰面積RSD分別為1.22%、1.58%、1.01%，表明儀器精密度良好。
2.5 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，在“2.1”項條件下，分別于2、4、6、8、10、12 h進樣，結(jié)果顯示GA、TGG、PGG 10 h內(nèi)峰面積的RSD值分別為0.77%、1.39%、1.08%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.6 重復(fù)性試驗 取同一批三果湯粉末6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項條件下進樣，結(jié)果顯示GA、TGG、PGG含有量RSD分別為1.18%、0.37%、0.83%，表明該方法重復(fù)性良好。
2.7 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的同一批三果湯粉末6份，每份精密稱取5.0 g，按“2.2.2”項下方法制備供試溶液，加入GA、TGG、PGG對照品適量(約相當(dāng)于5.0 g樣品中所含GA、3GG和PGG的量)，再按“2.3”項下色譜條件，進樣10 μL，進行檢測，計算平均回收率。按“2.2.3”項下方法制備供試溶液，在“2.1”項條件下進樣。結(jié)果見表2。
2.8 含量測定 取3份不同批次余甘子樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項下條件下進樣，計算四種成分含有量。結(jié)果見表3。
表2 加樣回收率試驗 (n=9)
表3 含量測定結(jié)果
3 討論
三果湯作為傳統(tǒng)藏藥在臨床上應(yīng)用廣泛，且具有良好的臨床療效。鞣質(zhì)酚酸類化合物是三果湯的主要有效成分，易溶于水，故本研究采用水提的方式處理樣品。對比煎煮次數(shù)，結(jié)果顯示，煎煮三次時，含量達到最高。
預(yù)實驗分別以甲醇-水溶液、乙腈-水溶液、甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液作為流動相進行考察，當(dāng)乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相時，采用梯度洗脫，目標(biāo)峰的色譜圖峰拖尾得到改善，且峰形更好，達到更高的分離度，因此選定乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動相。另外，還對柱溫(25、30、35、40 ℃)和流速(0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 mL/min)進行了優(yōu)化，結(jié)果顯示，柱溫25 ℃、流速0.8 mL/min 時分離效果較佳。
本研究建立同時測定藏藥三果湯中沒食子酸、1，3，6-O-三沒食子?；咸烟?、1，2，3，4，6-五-O-沒食子?；咸烟呛康母咝б合嗌V法，供試品制備簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，專屬性高，結(jié)果可靠，可為三果湯質(zhì)量控制提供一定依據(jù)。
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