徐 磊 高 珊 王 心 許 歡 侯 陽 王曉樂 陳曉明

(淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，淮安 223003)

薏米屬禾本科，又名薏苡仁、六谷米等，是一種典型的藥食兩用資源，其加工利用價(jià)值較高，具有“世界禾本科植物之王”的美譽(yù)。薏米麩皮是薏米精白過程的主要副產(chǎn)物，約占糙薏米質(zhì)量的8%，含有豐富的蛋白質(zhì)、纖維素、脂肪和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，同時(shí)富含薏苡素、生育酚、多酚等多種天然生物活性成分[1]。薏米麩皮中的功能性成分具有抗發(fā)炎鎮(zhèn)痛[2]、治療高尿酸血癥[3]等多種生理活性。我國是薏米種植和消費(fèi)大國，具有較為完整的薏米產(chǎn)業(yè)鏈，然而目前我國薏米麩皮利用率仍較低，主要用作動(dòng)物飼料或者直接被拋棄，造成了薏米資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。探尋薏米麩皮的高值轉(zhuǎn)化利用技術(shù)成為薏米加工企業(yè)和科研工作者面臨的重要問題。

微生物發(fā)酵作為一種典型的食品加工技術(shù)，已被廣泛用于各種谷物及其副產(chǎn)物的開發(fā)利用中，不僅可改善谷物質(zhì)地和賦予新的風(fēng)味，還可以增強(qiáng)其生理活性。Yin等[4]研究表明植物乳桿菌發(fā)酵薏米可以顯著提高其游離氨基酸、可溶性膳食纖維及有機(jī)酸含量，同時(shí)還可改善薏米漿的風(fēng)味和穩(wěn)定性。劉磊等[5]利用復(fù)合乳酸菌對(duì)脫脂米糠進(jìn)行半固態(tài)發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵可提高可溶性膳食纖維和總酚含量，同時(shí)還可以提高米糠提取物中必需氨基酸和非必需氨基酸比值。Shin等[6]研究發(fā)現(xiàn)黑米麩皮經(jīng)泡盛曲霉和米曲霉固態(tài)發(fā)酵后，乙醇提取液的酚酸含量、自由基清除活力和酪氨酸酶抑制活性顯著提高。

米根霉具有發(fā)達(dá)的淀粉和蛋白酶系，是藥和酒曲中的優(yōu)勢(shì)菌種，在我國傳統(tǒng)發(fā)酵中扮演著重要角色[7]。目前關(guān)于米根霉發(fā)酵對(duì)薏米麩皮營養(yǎng)組成和抗氧化活性的影響鮮有報(bào)道。本研究以脫脂薏米麩皮為原料，采用米根霉發(fā)酵脫脂薏米麩皮，分析了發(fā)酵過程中游離氨基酸、多肽、多酚、黃酮、酚類物質(zhì)組成及抗氧化活性的變化，旨在為基于薏米麩皮功能性產(chǎn)品的開發(fā)以及拓寬薏米麩皮的加工途徑提供新思路和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

米根霉(1010CFU/g)；乙腈：色譜純；6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸(Trolox)、2,2'-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪(TPTZ)等均為分析純。

脫脂薏米麩皮：實(shí)驗(yàn)室自制。新鮮薏米麩皮購自福建省浦城縣官路神農(nóng)薏米專業(yè)合作社，經(jīng)正己烷脫脂，40 ℃烘干，粉碎過80目篩后備用。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

ZQLY-180S振蕩培養(yǎng)箱,TGL20M冷凍離心機(jī),SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī),Agilent 1100及Agilent 1260氨基酸專用高效液相色譜儀,LC-2030液相色譜儀。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵脫脂薏米麩皮的制備

準(zhǔn)確稱取30 g脫脂薏米麩皮和0.3 g米根霉于100 mL燒杯，加入45 mL蒸餾水?dāng)嚢杌靹?。然后置?7 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，分別發(fā)酵0、12、24、48、72 h，取樣冷凍干燥，磨粉過80目篩，-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 pH、可滴定酸和還原糖含量測(cè)定

參考崔晨曉等[8]的方法測(cè)定pH和可滴定酸。準(zhǔn)確稱取5 g發(fā)酵脫脂薏米麩皮，置于100 mL錐形瓶中，加入50 mL去離子水，室溫磁力攪拌30 min后直接測(cè)定pH。采用0.1 mol/L NaOH溶液滴定懸浮液使pH值至8.5，記錄消耗的NaOH溶液體積，可滴定酸以每克樣品所消耗的NaOH溶液表示(mL/g)。

制備的發(fā)酵薏米麩皮懸浮液4 000 r/min離心10 min，收集上清液，然后采用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定還原糖含量，結(jié)果以每克樣品含葡萄糖表示(mg/g)。

1.2.3 游離氨基酸分析

參考GB/T 18246—2019《飼料中氨基酸的測(cè)定》的方法，使用安捷倫氨基酸自動(dòng)分析儀對(duì)發(fā)酵薏米麩皮中的18種游離氨基酸進(jìn)行分析。

1.2.4 多肽分子量分布測(cè)定

參考Zhao等[9]的方法進(jìn)行多肽分子量分布分析。HPLC系統(tǒng)選用TSK gel G2000 SWXL凝膠柱(300 mm×7.8 mm)；流動(dòng)相為10%乙腈(含0.1%TFA)；柱溫為30 ℃；檢測(cè)器波長為220 nm；流速為0.5 mL/min。準(zhǔn)確稱取0.4 g發(fā)酵脫脂薏米麩皮溶于4 mL流動(dòng)相，室溫振蕩提取2 h，10 000 r/min離心20 min后收集上清液。上清液經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過濾后進(jìn)行HPLC分析，進(jìn)樣量為20 μL。

1.2.5 游離型、結(jié)合型酚類物質(zhì)的提取

參考Zhao等[3]的方法提取游離型、結(jié)合型酚類物質(zhì)。準(zhǔn)確稱取1 g發(fā)酵脫脂薏米麩皮，加入20 mL預(yù)冷的酸化甲醇溶液(甲醇∶去離子水∶濃鹽酸=64∶15∶1)，室溫下振蕩提取2 h，然后4 000 r/min離心15 min收集上清液。離心所得殘?jiān)谙嗤瑮l件下再重復(fù)提取兩次。合并3次離心所得上清液，在45 ℃下旋蒸至干燥，所得殘余用甲醇重新定容到10 mL，此即為游離型酚類物質(zhì)提取液，貯存于-40 ℃冰箱待用。

將上述游離型酚類物質(zhì)提取后的殘?jiān)占?00 mL錐形瓶中，加入2 mol/L NaOH溶液20 mL，并充氮密封，于室溫下振蕩水解2 h，接著用6 mol/L HCl調(diào)整pH值至2.0。然后用20 mL乙酸乙酯萃取6次，合并萃取液，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干燥，殘留物用甲醇定容到10 mL，得結(jié)合型酚類物質(zhì)提取液，于-40 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 總酚、總黃酮含量測(cè)定

1.2.6.1 總酚含量

采用福林酚法測(cè)定總酚含量[3]。取0.2 mL稀釋1倍的酚類物質(zhì)提取液至離心管中，加入1.3 mL去離子水和0.25 mL福林酚試劑，充分混勻后靜置6 min，再加入0.75 mL 20% Na2CO3溶液和2.5 mL去離子水，漩渦混勻后于40 ℃水浴避光孵育2 h，于760 nm波長下測(cè)定吸光值。同時(shí)以0.2 mL甲醇代替提取液作空白對(duì)照，以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?？偡雍恳悦?00 g干基(DW)所對(duì)應(yīng)的沒食子酸(GAE)當(dāng)量表示(mg GAE/100 g DW)。

1.2.6.2 總黃酮含量

參考Amir等[10]的方法測(cè)定總黃酮含量。取0.5 mL稀釋1倍的酚類物質(zhì)提取液，加入2 mL 30%乙醇溶液和0.15 mL 5% NaNO2，充分混勻后反應(yīng)6 min。然后加入0.15 mL 10% Al(NO3)3·6H2O溶液，混勻后靜置 6 min。最后加入2 mL 1 mol/L NaOH溶液和0.2 mL去離子水，混勻后室溫避光孵育15 min，于510 nm波長下測(cè)定其吸光值。同時(shí)以0.5 mL甲醇代替樣品作空白對(duì)照，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。總黃酮含量以每100 g干基所對(duì)應(yīng)的蘆丁(RE)當(dāng)量表示(mg RE/100 g DW)。

1.2.7 酚類物質(zhì)組成測(cè)定

參照Chen等[11]的方法，采用LC-2030液相色譜儀對(duì)酚類物質(zhì)提取液中的酚類物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。選用SunFire C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫設(shè)置為35 ℃；檢測(cè)器波長為280 nm；流速為0.9 mL/min。采用梯度洗脫，流動(dòng)相A和B分別為水(含0.1%乙酸)和甲醇(含0.1%乙酸)。各樣品過0.45 μm的微孔濾膜后進(jìn)行HPLC分析，進(jìn)樣量為20 μL，結(jié)果以每克干重脫脂薏米麩皮所含有的化合物含量表示(μg/g DW)。

1.2.8 抗氧化活性測(cè)定

1.2.8.1 ABTS+·清除能力

參考Erel等[12]的方法測(cè)定ABTS+·清除能力。取0.1 mL多酚提取液，加入3.9 mL 新鮮配制的ABTS+·工作液，混勻后在25 ℃下避光反應(yīng)15 min，測(cè)定734 nm處吸光值。同時(shí)以0.1 mL甲醇代替樣品作為空白對(duì)照，以Trolox標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。ABTS+·清除能力以每克干基所對(duì)應(yīng)的Trolox當(dāng)量表示(μmol TE/g DW)。

1.2.8.2 鐵離子還原能力(FRAP)

參考Benzie等[13]的方法測(cè)定FRAP。取2.7 mL新鮮配制的FRAP試劑，分別加入90 μL酚類物質(zhì)提取液和270 μL去離子水，振蕩混勻后于室溫避光處反應(yīng)30 min，測(cè)定593 nm下吸光值。同時(shí)以90 μL甲醇代替提取液作空白對(duì)照，用Trolox標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。FRAP以每克干基所對(duì)應(yīng)的Trolox當(dāng)量表示(μmol TE/g DW)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用SPSS 19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan’s多重比較(P<0.05表示差異顯著)，使用Origin 9.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵對(duì)pH、可滴定酸及還原糖含量的影響

脫脂薏米麩皮發(fā)酵過程中pH、可滴定酸和還原糖含量的變化與米根霉生長繁殖過程中代謝產(chǎn)物的積累具有密切關(guān)系。由表1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，脫脂薏米麩皮的pH呈逐漸降低的趨勢(shì)，而可滴定酸呈逐漸增加的趨勢(shì)。張杰等[14]報(bào)道黑青稞在米根霉發(fā)酵后，pH顯著降低，而總酸含量顯著提高，這與本研究結(jié)果一致。發(fā)酵12 h后，脫脂薏米麩皮還原糖含量顯著增加，而后隨著發(fā)酵時(shí)間的延長還原糖含量逐漸降低，72 h后還原糖含量僅為未發(fā)酵脫脂薏米麩皮的51.9%。

表1 脫脂薏米麩皮發(fā)酵過程中pH、可滴定酸和還原糖含量的變化

2.2 發(fā)酵對(duì)游離氨基酸含量的影響

微生物發(fā)酵谷物過程中可利用其自身蛋白酶系降解谷物蛋白生成氨基酸，一部分作為氮源供給自身代謝，另一部分則作為游離氨基酸存在于谷物中[14]。脫脂薏米麩皮發(fā)酵過程中游離氨基酸含量的變化如表2所示。發(fā)酵過程中總游離氨基酸含量顯著增加，從發(fā)酵初期至發(fā)酵結(jié)束增加了近9倍。發(fā)酵72 h后，必需氨基酸的含量從0.88 mg/g增加到13.43 mg/g，非必需氨基酸的含量從2.27 mg/g增加到18.32 mg/g，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值從0.39增加到0.73。發(fā)酵過程中，除了絲氨酸、精氨酸、酪氨酸和賴氨酸，其他游離氨基酸都隨著發(fā)酵時(shí)間的延長含量呈緩慢上升趨勢(shì)；必需氨基酸中，亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸含量變化最為明顯，發(fā)酵72 h后分別增加了2.82、2.52、1.93 mg/g；而非必需氨基酸中，谷氨酸、丙氨酸和天冬氨酸含量變化最為明顯，發(fā)酵72 h后分別增加了5.89、3.10、2.31 mg/g。γ-氨基丁酸是一種谷物中廣泛存在的四碳非蛋白質(zhì)氨基酸，對(duì)人體健康具有很多益處[15]。脫脂薏米麩皮發(fā)酵初期γ-氨基丁酸含量為0.22 mg/g，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長含量逐漸增加，72 h后增長了2.7倍。Kim等[16]在大米麩皮孵育過程中也報(bào)道了顯著增長的γ-氨基丁酸含量。

表2 脫脂薏米麩皮發(fā)酵過程中游離氨基酸含量的變化/mg/g

2.3 發(fā)酵對(duì)多肽分子量分布的影響

多肽是一種重要的功能性物質(zhì)，據(jù)報(bào)道來源于薏米蛋白的多肽具有治療扁平疣、腫瘤等疾病的功效[17]。表3為脫脂薏米麩皮發(fā)酵過程中多肽分子量分布的分析。脫脂薏米麩皮發(fā)酵過程中，48.63%～54.77%的多肽分子量小于180 u，22.37%～27.02%的多肽分子量位于500～180 u，表明脫脂薏米麩皮中的多肽主要是一些三肽、二肽及氨基酸。脫脂薏米麩皮發(fā)酵過程中分子質(zhì)量位于15 000～1 000 u的多肽比例隨發(fā)酵時(shí)間的延長逐漸降低，而分子質(zhì)量低于500 u的多肽比例隨著發(fā)酵時(shí)間的延長逐漸增加。分子質(zhì)量位于1 000～500 u的多肽比例在發(fā)酵12 h后顯著降低，12～48 h之間呈逐漸增加的趨勢(shì)，而后又顯著降低。與本研究結(jié)果一致，Liu等[18]在脫脂小麥胚芽發(fā)酵過程中也報(bào)道了顯著增加的小分子多肽含量和顯著降低的大分子多肽含量。小分子多肽具有更高的功能活性[19]，脫脂薏米麩皮發(fā)酵過程中顯著增加的小分子多肽比例可顯著提高其生物活性。

表3 脫脂薏米麩皮發(fā)酵過程中多肽分子量分布的變化

2.4 發(fā)酵對(duì)多酚和黃酮含量的影響

酚類物質(zhì)是一種廣泛存在于植物體中的重要次生代謝產(chǎn)物，具有抑菌、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性。根據(jù)酚類物質(zhì)與植物細(xì)胞中其他組分結(jié)合的緊密程度可將酚類物質(zhì)分為游離型和結(jié)合型。脫脂薏米發(fā)酵過程中不同結(jié)合形態(tài)多酚和黃酮含量的變化如圖1所示。未發(fā)酵脫脂薏米中游離型、結(jié)合型和總多酚含量分別為245.67、273.11、518.78 mg GAE/100 g DW。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長游離型和總多酚含量逐漸增加，發(fā)酵72 h后分別增長了111.7%和53.2%，而結(jié)合型多酚含量在發(fā)酵過程中未發(fā)生顯著變化(P>0.05)。脫脂薏米麩皮中的黃酮主要以游離態(tài)的形式存在，未發(fā)酵脫脂薏米中游離型、結(jié)合型和總黃酮含量分別為184.45、69.62、254.06 mg RE/100 g DW。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，游離型和總黃酮含量逐漸增加，發(fā)酵72 h后分別增長了168.6%和121.9%，而結(jié)合型黃酮含量在發(fā)酵過程中保持不變。Shumoy等[20]報(bào)道tefinjera在發(fā)酵過程中游離型、結(jié)合型多酚和黃酮含量隨著發(fā)酵時(shí)間顯著提高。冉玉兵等[21]在研究乳酸菌發(fā)酵龍眼果漿時(shí)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵可顯著提高游離型多酚含量而對(duì)結(jié)合多酚含量無影響。微生物代謝過程中產(chǎn)生的各種酶可水解植物細(xì)胞壁促進(jìn)酚類物質(zhì)釋放，但不同植物細(xì)胞壁在組成和結(jié)構(gòu)方面存在顯著差異也導(dǎo)致發(fā)酵過程中游離型、結(jié)合型酚類物質(zhì)變化的不一致。

注：同一指標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，余同。圖1 脫脂薏米麩皮發(fā)酵過程中不同形態(tài)多酚和黃酮含量的變化

2.5 發(fā)酵對(duì)酚酸組成的影響

脫脂薏米麩皮發(fā)酵過程中酚酸組成及含量變化見表4。脫脂薏米麩皮發(fā)酵過程中共檢出8種游離型酚酸和4種結(jié)合型酚酸，各酚酸含量隨發(fā)酵時(shí)間發(fā)生顯著變化。脫脂薏米麩皮中的3,4-二羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸和丁香酸以游離態(tài)的形式存在，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長含量逐漸升高，發(fā)酵72 h后分別增長了3.4、3.2、7.9倍?？Х人嵋惨杂坞x態(tài)的形式存在，發(fā)酵初期其含量從18.4 μg/g DW增加到38.0 μg/g DW，而后隨著發(fā)酵時(shí)間的延長逐漸降低，發(fā)酵72 h后為10.0 μg/g DW。脫脂薏米麩皮發(fā)酵過程中，游離型和結(jié)合型的綠原酸含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長都呈逐漸增加的趨勢(shì)。脫脂薏米麩皮中游離型和結(jié)合型齊墩果酸含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長均顯著增加(P<0.05)，發(fā)酵72 h分別增長了3.0、0.6倍。脫脂薏米麩皮中游離型香豆酸主要以結(jié)合態(tài)形式存在，發(fā)酵過程中游離型香豆酸逐漸降低，而結(jié)合型香豆酸在發(fā)酵前24 h逐漸增加，之后含量逐漸降低，總香豆酸含量變化與結(jié)合型香豆酸變化基本一致。阿魏酸也主要以結(jié)合態(tài)形式存在，發(fā)酵過程中結(jié)合態(tài)和總阿魏酸含量分別降低了20.2%和16.6%，而游離型阿魏酸含量增長了78%。發(fā)酵過程中的生物學(xué)作用可促進(jìn)結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)的釋放，提高游離態(tài)多酚含量，同時(shí)酚類物質(zhì)也可發(fā)送生物轉(zhuǎn)化作用變成其他物質(zhì)導(dǎo)致其含量降低[22]。

表4 脫脂薏米麩皮發(fā)酵過程中游離型、結(jié)合型和總酚酸含量的變化/μg/g DW

2.6 發(fā)酵對(duì)抗氧化活性的影響

谷物中的酚類物質(zhì)可通過提供電子、氫原子或者鰲合金屬離子的方法淬滅和清除自由基，因此具有較高的抗氧化活性[23]。本研究采用FRAP和ABTS+·清除能力表征脫脂薏米發(fā)酵過程中酚類提取物的抗氧化活力，結(jié)果如圖2所示。脫脂薏米發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長游離型和總酚類物質(zhì)提取物的FRAP逐漸增加，發(fā)酵72 h后分別增長了119.6%和60.5%，而結(jié)合型多酚含量在發(fā)酵過程中保持不變(P>0.05)。在發(fā)酵過程中，脫脂薏米的游離型和總酚類物質(zhì)提取物的ABTS+·清除能力隨著發(fā)酵時(shí)間的延長顯著上升(P<0.05)，在72 h相較于未發(fā)酵脫脂薏米分別增長了52.1%和25.9%，而結(jié)合型酚類物質(zhì)提取物的ABTS+·清除能力在整個(gè)發(fā)酵過程中未發(fā)生顯著變化(P>0.05)。Gan等[24]也報(bào)道了可食用豆類發(fā)酵過程中可顯著提高游離型酚類物質(zhì)提取物的抗氧化活力。

圖2 脫脂薏米麩皮發(fā)酵過程中不同形態(tài)多酚提取物的FRAP和ABTS+·清除能力的變化

3 結(jié)論

以脫脂薏米麩皮為原料，考察了米根霉發(fā)酵對(duì)其營養(yǎng)組成及抗氧化活性的影響。脫脂薏米麩皮經(jīng)米根霉發(fā)酵后pH顯著下降、可滴定酸顯著提高(P<0.05)，而還原糖含量呈先上升后下降的趨勢(shì)。在發(fā)酵過程中，脫脂薏米麩皮的總游離氨基酸增加了近9倍，小分子多肽(分子質(zhì)量小于500 u)比例隨著發(fā)酵時(shí)間延長逐漸提高。米根霉發(fā)酵顯著提高了脫脂薏米麩皮的游離型多酚和黃酮含量(P<0.05)，但對(duì)結(jié)合型多酚和黃酮含量無顯著影響(P>0.05)。脫脂薏米麩皮發(fā)酵過程中共檢出8種游離型酚酸和4種結(jié)合型酚酸，發(fā)酵處理提高了大部分游離型酚酸含量。此外，發(fā)酵處理后脫脂薏米麩皮的游離型酚類提取物的抗氧化活力顯著提高(P<0.05)，而對(duì)結(jié)合型酚類提取物的抗氧化活力無顯著性影響(P>0.05)。該研究可為薏米麩皮的加工利用提供新思路和技術(shù)指導(dǎo)。