趙 鑫 王羽璇 葉 博 劉 玲

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院1，沈陽 110866)(遼寧省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)基地建設(shè)工程中心2，沈陽 110031)

美拉德反應(yīng)是一種非酶促褐變反應(yīng)，主要發(fā)生在還原糖和氨基化合物之間，形成不穩(wěn)定的Amadori產(chǎn)物，并進一步生成不同分子量的產(chǎn)物[1]。羰基化合物是美拉德反應(yīng)重要的中間體，它們與氨基化合物反應(yīng)可生成醛酮類化合物，褐色物質(zhì)以及晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)，適當(dāng)?shù)拿览路磻?yīng)可以提高蛋白的功能性，賦予了食品特殊的風(fēng)味、色澤等感官屬性[2,3]。然而，過度的美拉德反應(yīng)導(dǎo)致氨基酸損失，產(chǎn)生一些潛在的有毒物質(zhì)，不利于人體健康，例如AGEs的積累，被認為具有誘變性，細胞毒性或致癌性[4-7]。目前為止已發(fā)現(xiàn)超過20種AGEs，包括交聯(lián)產(chǎn)物和非交聯(lián)產(chǎn)物，其中羧甲基賴氨酸(CML)極具代表性[8]，它主要經(jīng)由糖基化反應(yīng)生成，同時油脂氧化對其積累具有促進作用。

糖基化和油脂氧化是食品加工和貯藏過程中兩個很重要的反應(yīng)，它們具有一些共同的中間產(chǎn)物和反應(yīng)途徑[9]。脂質(zhì)氧化主要由不飽和脂肪酸中自由基所引發(fā)[10]，這種氧化優(yōu)先發(fā)生在多不飽和脂肪酸上，如亞油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸等[11]。氧化反應(yīng)導(dǎo)致食品營養(yǎng)價值降低，食品保質(zhì)期縮短，還可能形成有毒和致癌化合物[12,13]。在富含蛋白、糖和脂肪的食品中，脂質(zhì)氧化反應(yīng)生成的脂過氧自由基、羥基自由基以及超氧自由基，可促進美拉德反應(yīng)的進行和AGEs的累積[14]。

蛋類是蛋白質(zhì)含量豐富的食品，其中卵清蛋白(OVA)是蛋清中的主要蛋白，約占蛋清總蛋白質(zhì)的55%，具有蛋清大部分功能特性[15]。OVA為球狀單體糖蛋白，以緊湊的球狀構(gòu)象存在[16]。蛋白質(zhì)在加工中易發(fā)生高級結(jié)構(gòu)變化而引發(fā)相關(guān)化學(xué)反應(yīng)，從而改變食品的加工貯藏性能。蛋制品種類豐富，加工中常使用糖和油脂，因此蛋制品加工中更容易發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。探究蛋類蛋白在加工中營養(yǎng)成分的化學(xué)反應(yīng)機理有利于改善蛋品的加工性質(zhì)，改進工藝，確保蛋制品質(zhì)量安全。雖然目前已有報道關(guān)于糖、脂和蛋白質(zhì)之間的相互作用，但是研究不夠深入，而且針對蛋類蛋白的研究尚少，故本研究以O(shè)VA糖基化反應(yīng)為研究對象，旨在探究脂肪對OVA糖基化反應(yīng)及AGEs累積的影響，為蛋制品加工性質(zhì)的改善和降低AGEs累積提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

甲醇、乙二醛、吡咯素(PRL)、3-脫氧葡萄糖醛酮(3-DG)、亞油酸(LIN)均為色譜純；油酸、二十碳五烯酸、羧甲基賴氨酸、D-葡萄糖(GLC)、鄰苯二胺(OPD)均為分析純。

超高效液相質(zhì)譜檢測儀。

1.2 方法

1.2.1 糖基化模擬組的制備

建立4個模擬組：單獨糖的GLC組，單獨蛋白的OVA組，蛋白與糖的糖基化GLC+OVA組及含有不飽和油脂的糖基化GLC+OVA+UFA組。油脂組分別含三種不同油脂。組分含量為3 g GLC，1.0 g OVA；油脂組中含2.0 g吐溫20，OLE、LIN、EPA分別 0.25 g。以上6組均用50 mmol/L hepes緩沖溶液(pH 8.0)在室溫下充分溶解并定容至25 mL。加熱溫度50 ℃，每隔12 h時計時取樣，每次取樣3 mL，迅速冷卻至室溫并于-20 ℃下冷凍保存待用。

1.3.2 主要指標(biāo)的測定

1.3.2.1 二羰基化合物的衍生化及GO、3-DG的測定

羰基化合物性質(zhì)活潑，本文通過檢測相應(yīng)的衍生物為其定量，根據(jù)先前的方法稍作修改[17]，取樣250 μL，加入750 μL甲醇，渦旋振蕩30 s后在4 ℃，12 000 r/min條件下離心10 min，取100 μL上清液，加入900 μL 50 mmol/L OPD甲醇溶液，4 ℃避光衍生12 h。衍生后樣品過0.22 μm微孔濾膜并轉(zhuǎn)移至1 mL進樣瓶，UPLC-MS/MS檢測。

色譜質(zhì)譜條件：Shim-pack GIS C18 UPLC色譜柱(75 mm×2.1 mm，2 μm)，流動相A為含有0.1%甲酸的超純水，B為甲醇(70∶30)。進樣量1 μL，流速0.2 mL/min，柱溫30 ℃，等度洗脫模式，運行時間5 min。質(zhì)譜部分使用ESI離子源，離子源溫度100 ℃，脫溶劑溫度350 ℃，接口溫度300 ℃，DL溫度250 ℃，加熱塊溫度400 ℃。載氣高純氮氣，碰撞氣氦氣，噴霧電壓5.0 kV。以正離子模式獲得MS數(shù)據(jù)，并通過選擇離子監(jiān)測(SIM)模式和多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式鑒定所測得的化合物核質(zhì)比。實驗重復(fù)3次。

用50 mmol/L hepes緩沖溶液(pH 8.0)配制3-DG、GO衍生物的梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，并進行液相質(zhì)譜檢測。得到4種物質(zhì)的濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算相關(guān)性系數(shù)R2。使用加標(biāo)回收法分析檢測方法的有效性，使用日內(nèi)和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差驗證實驗方法的精密度。

1.3.2.2 蛋白酸水解及CML、PRL的測定

取樣500 μL，加入6 mol/L濃鹽酸4.5 mL，加入一滴正辛醇，真空封口后，在110 ℃條件下酸水解24 h。將反應(yīng)后的水解液過濾定容至10 mL，取200 μL用50 ℃氮氣吹干，超純水復(fù)溶至1 mL，渦旋振蕩30 s，過0.22 μm微孔濾膜并轉(zhuǎn)移至1 mL進樣瓶，UPLC-MS/MS檢測[18]。

1.3.2.3 TBA值的測定

取樣300 μL，加入1 000 μL三氯乙酸(TCA)溶液(0.5 mol/L，含0.3 mmol/L EDTA-2Na)，50 ℃振搖30 min后，4 ℃離心10 min(12 000 r/min)。取1 mL上清液加入1 mL三氯乙酸和等體積0.02 mol/L硫代巴比妥酸(TBA)，搖勻密封沸水浴加熱1 h后冷卻10 min。二次離心后，532 nm波長下測定吸光度值。使用1,1,3,3-四甲氧基丙烷作為丙二醛標(biāo)準(zhǔn)液進行標(biāo)曲的繪制[19]。

1.3.2.4 POV值的測定

取樣1 mL加入2 mL三氯甲烷-甲醇(70∶30)，4 ℃，12 000 r/min離心10 min。取2 mL上清液加入50 μL硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O，13 mmol/L)和50 μL硫氰酸鉀(KSCN，3 mol/L)渦旋振蕩，室溫下靜置5 min，500 nm下測定樣品的吸光度[20]。

1.3.2.5 圓二色譜的測定

樣品用50 mmol/L hepes緩沖溶液(pH 8.0)稀釋50倍，置于光徑為0.1 cm的樣品池中分析，設(shè)置靈敏度為20 medg，掃描速度50 nm/min，掃描范圍190～250 nm[21]。

1.3.2.6 數(shù)據(jù)分析

實驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式來表示。用SPSS 21進行數(shù)據(jù)間的線性回歸分析及ANOVA顯著性分析(P<0.05)，并且使用最小顯著差數(shù)法(LSD)進行全配對多重比較。使用smart PLS 3.0軟件進行PLS-SEM建模及路徑分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)物GO、3-DG、CML、PRL的分析

用3-DG、GO、CML、PRL標(biāo)準(zhǔn)品分別配制質(zhì)量濃度1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，對4種標(biāo)準(zhǔn)品分別進行液相質(zhì)譜檢測。4種標(biāo)準(zhǔn)品所對應(yīng)的保留時間、分子離子及特征碎片離子如表1所示。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜信息

2.2 不同脂肪酸對模擬體系中GO、3-DG生成的影響

圖1a所示3-DG含量變化。在24 h反應(yīng)中，GLC組中3-DG含量略有增加。對照GLC+OVA組在72 h 時3-DG含量增加32.97%，是GLC組的2.5倍(P<0.01)。GLC組與對照組中3-DG生成規(guī)律差異歸因于3-DG的生成途徑不同。GLC組中3-DG通過還原糖的自氧化途徑生成且含量較低，積累到一定水平則達到反應(yīng)平衡狀態(tài)不再變化。OVA的加入使3-DG生成更多地來自美拉德反應(yīng)中席夫堿和Amadori產(chǎn)物的裂解，這個途徑的反應(yīng)速率遠大于GLC的自氧化速率。三組油脂中，EPA組中3-DG含量增加42.66%，與其他組比較差異顯著(P<0.05)，說明 EPA對3-DG的形成有顯著的促進作用，而且這種促進作用來自于對糖基化反應(yīng)的促進，而不是對糖自氧化的促進作用。

圖1b為GO含量變化，各組在36 h之后GO含量均趨于穩(wěn)定。在GLC組中GO含量是3-DG的2.5倍，說明GO比3-DG更易生成。對照組中GO含量與GLC體系差異不大(P>0.05)，說明糖基化反應(yīng)過程對GO積累貢獻不大，GO主要經(jīng)葡萄糖自氧化生成。三組脂肪酸中GO含量比對照組都有顯著升高(P<0.01)，說明油脂對于生成GO的促進作用，在油脂組中GO主要是經(jīng)過油脂氧化生成。已有研究表明在食物烹飪和儲存過程中，魚油中生成的GO要明顯高于植物油中的GO含量，正是由于魚油中含有大量PUFA的緣故[22]。另外，EPA組中GO含量明顯高于OLE和LIN組，表明這種促進作用隨不飽和度的增高而增大。因為EPA含有大量的不飽和雙鍵，能有效地促進羥基自由基和二次氧化產(chǎn)物的生成，有助于形成二羰基化合物和AGEs[23,24]。

隨反應(yīng)時間的延長，兩種羰基化合物含量都隨著油脂不飽和度升高而增加，3-DG主要歷經(jīng)糖基化反應(yīng)途徑，因此油脂通過促進糖基化反應(yīng)促進3-DG形成，而GO的含量增加更多的是油脂自氧化的結(jié)果，正因為此，在反應(yīng)到36 h后，GO含量的增加明顯趨于緩和，這也反映了美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(MRPs)積累對油脂的抗氧化作用。

圖1c顯示了PRL含量的變化。4種模擬體系中PRL含量均隨反應(yīng)時間增加而顯著的上升(P<0.05)。對照組PRL含量增長了4.86%(72 h)，加油脂組PRL含量高于對照組(P<0.05)，說明脂肪酸會顯著促進體系中PRL的生成，且脂肪酸不飽和度與CML的生成量之間成反比。圖1d為反應(yīng)中CML含量變化。四組中CML含量變化都隨反應(yīng)時間的增加而顯著上升(P<0.05)。油脂組CML含量高于對照組，說明脂肪酸可有效促進CML生成。且脂肪酸不飽和度與CML的生成量之間成反比。蛋白的適當(dāng)氧化可以促進AGEs生成，然而蛋白質(zhì)過度氧化會導(dǎo)致大量二硫鍵交聯(lián)形成蛋白質(zhì)的聚集，使蛋白質(zhì)在x結(jié)構(gòu)上形成空間位阻效應(yīng)[25]。這種結(jié)構(gòu)不利于羰基化合物與氨基酸結(jié)合生成AGEs。脂肪酸的不飽和度高，對PRL和CML的促進作用減弱可能與PUFA對OVA的過度氧化有關(guān)，也可能因MRPs具有較高的抗氧化活性，MRPs生成量越多對氧化抑制作用越強，從而使后期糖基化反應(yīng)減弱。

注：*為同一反應(yīng)時間內(nèi)不同組之間含量的差異顯著性P<0.05。圖1 不同模擬組中AGEs產(chǎn)物含量隨熱處理時間的變化

2.3 不同脂肪酸對模擬體系中TBA值的影響

圖2a為油脂初級產(chǎn)物的POV值變化。3組油脂在24 h內(nèi)POV值均呈明顯下降趨勢，24 h后隨反應(yīng)時間的延長逐漸放緩。含EPA組與含LIN組趨勢下降的最顯著。這種下降是來自MRPs的抗氧化作用。從圖2b看出，除了含有EPA的組之外，其他組的TBA值都增加很少(P>0.05)，這也說明了MRPs的影響。EPA組前36 h TBA值增加了6.39%，是OLE組的2.33倍(P<0.01)，可以看出高不飽和脂肪酸氧化很快。脂肪酸氧化可以生成大量次級產(chǎn)物，促進羰基化合物生成，羰基化合物使脂質(zhì)氧化與美拉德反應(yīng)協(xié)同作用。

注：*為同一反應(yīng)時間內(nèi)不同組之間含量的差異顯著性P<0.05。圖2 不同模擬組中氧化產(chǎn)物含量隨熱處理時間的變化

為進一步探究脂質(zhì)過氧化與美拉德反應(yīng)之間的聯(lián)系，將脂質(zhì)過氧化與蛋白糖基化產(chǎn)物含量進行回歸分析(表2)。TBA值與3-DG、GO、CML、及PRL之間均表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系(P<0.01)，POV值與4種糖基化產(chǎn)物之間也有顯著的負相關(guān)性(P<0.01)，這一現(xiàn)象在EPA組中體現(xiàn)得尤為明顯，這說明脂肪酸氧化會顯著影響蛋白糖基化進程。

表2 不同模擬組中AGEs與氧化產(chǎn)物之間的相關(guān)性

2.4 糖基化蛋白的圓二色譜分析

圓二色譜是探究蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)變化的一種重要方法。圖3中200 nm和230 nm處的峰值是蛋白質(zhì)α螺旋的特征峰。與天然OVA相比，經(jīng)過加熱的OVA在200 nm處的正橢圓率降低，負橢圓率增大，經(jīng)過計算α螺旋減少7.1%，說明熱反應(yīng)破壞蛋白二級結(jié)構(gòu)，使蛋白結(jié)構(gòu)變得松散無序。糖基化反應(yīng)后蛋白分子結(jié)構(gòu)適度展開，二級結(jié)構(gòu)破壞率低于直接加熱，可能二羰基化合物與氨基酸殘基結(jié)合阻礙了側(cè)鏈之間的共價交聯(lián)，緩解了蛋白由于熱處理引起的結(jié)構(gòu)變化。油脂的加入使蛋白結(jié)構(gòu)變化增大，并隨著不飽和度升高對OVA結(jié)構(gòu)的影響更加明顯，這說明脂質(zhì)氧化導(dǎo)致蛋白氧化引發(fā)蛋白空間結(jié)構(gòu)進一步展開。已有研究表明，脂類氧化易導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化，這些氧化主要包括蛋白質(zhì)肽鍵斷裂、分子結(jié)構(gòu)的展開、以及氨基酸殘基的氧化等[26]。脂肪在氧化過程中生成的氫過氧自由基以及活性氧自由基可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化的發(fā)生[27]。這些氧化損傷會導(dǎo)致在蛋白天然構(gòu)象中分子內(nèi)部的氨基酸殘基暴露，使體系中的二羰基化合物與氨基酸殘基之間充分接觸，從而促進AGEs的生成。

圖3 不同模擬組OVA圓二色譜

圖4 模型路徑圖

2.5 糖基化模擬體系的SEM結(jié)構(gòu)模型路徑分析

2.5.1 理論模型構(gòu)建和信度與效度分析

本實驗用smart PLS 3.0軟件進行SEM建模，研究脂質(zhì)氧化反應(yīng)對糖基化早中期產(chǎn)物(GO、3-DG)及晚期產(chǎn)物(CML、PRL)的影響。信度反應(yīng)系統(tǒng)的變異程度，考察數(shù)據(jù)之間的穩(wěn)定性。信度越大說明測量結(jié)果具有較好的內(nèi)部一致性。采用克隆巴赫值(cronbach′s alpha)進行檢驗，檢驗值大于0.7說明數(shù)據(jù)之間內(nèi)部一致性良好，數(shù)據(jù)可靠性較高。平均抽取變異量(AVE)考察數(shù)據(jù)間的收斂情況，AVE值越大，潛在變量越能夠表征對應(yīng)項。檢驗值大于0.5說明潛在變量間相對收斂。本模型的信度與效度分析結(jié)果如表3所示，說明數(shù)據(jù)相對收斂且具有良好的一致性，可以進行下一步分析。

表3 信度與效度分析

2.5.2 模型路徑的關(guān)系

模型通過變量之間的路徑系數(shù)揭示了脂質(zhì)過氧化反應(yīng)中的初級產(chǎn)物及次級產(chǎn)物與糖基化中間產(chǎn)物及終末期產(chǎn)物之間的關(guān)系(表4)。模型中標(biāo)準(zhǔn)差均在0.049～0.160之間，潛變量與測量指標(biāo)之間的外部模型載荷、潛變量間載荷的P值均小于0.05，表明模型中所有估計計算的變量間差異均顯著。

表4 路徑相關(guān)性

從表4中可以看出脂質(zhì)氧化次級產(chǎn)物到糖基化中間產(chǎn)物之間的路徑系數(shù)為0.814，說明其他條件均不變的情況下，“脂質(zhì)過氧化次級產(chǎn)物”潛變量每變化一個單位，“糖基化中間產(chǎn)物”潛變量將變化0.814個單位，由此可見脂質(zhì)過氧化次級產(chǎn)物對糖基化中間產(chǎn)物的影響力強，對糖基化終產(chǎn)物的影響力較弱。這是因為脂質(zhì)氧化的次級產(chǎn)物主要為醛酮類物質(zhì)，它們既是糖基化反應(yīng)的中間產(chǎn)物，也是促進氧化的主要物質(zhì)，因此對促進糖基化反應(yīng)中間產(chǎn)物的形成也有很大作用。表4也可見脂質(zhì)氧化初級產(chǎn)物對糖基化終產(chǎn)物的影響力強于對中間產(chǎn)物的影響力，但是作用都不大。這是因為脂質(zhì)氧化初級產(chǎn)物和糖基化終產(chǎn)物都一定程度上受到MRPs的抗氧化影響。該模擬體系的模擬路徑分析如圖4所示。

3 結(jié)論

AGEs是由糖基化反應(yīng)和油脂氧化反應(yīng)的中間產(chǎn)物進一步反應(yīng)形成。在對二羰基化合物GO和3-DG的分析看出，油脂是通過自氧化和提供自由基氧化糖基化過程中底物的方式形成羰基化合物。在糖基化途徑中，UFA通過改變OVA蛋白高級結(jié)構(gòu)來促進糖基化反應(yīng)進行。脂肪酸的不飽和度與二羰基化合物含量、TBA值、POV值均成正比，與CML和PRL含量成反比，這表明了高不飽和脂肪酸對形成MRPs具有強烈的促進作用，加速了MRPs的累積，對后期AGEs的形成和不飽和脂肪酸氧化都明顯抑制。通過結(jié)構(gòu)模型的路徑分析可知，脂質(zhì)氧化初級產(chǎn)物對AGEs累積的作用更大，而脂質(zhì)氧化次級產(chǎn)物對二羰基化合物的影響非常強勁。