楊衛(wèi)民，杜京旗，劉 猛，賴靜茹，劉慧敏

（呂梁林果植物化學(xué)省市共建山西省重點實驗室培育基地；山西省特色植物功能成分工程研究中心，呂梁學(xué)院，山西呂梁 033001）

正北芪，又稱恒山黃芪，地理標(biāo)志為“渾源正北芪”。中國著名藥物學(xué)家李時珍在《本草綱目》中把“正北芪”列為上品，為中國北芪之正宗。正北芪富含蔗糖、葡萄糖、淀粉、黏液質(zhì)、葉酸、甜茶堿、膽堿、樹膠、纖維素及多種氨基酸，具有瀉陰火、益正氣、壯脾胃、去肌熱、排膿止痛、活血醫(yī)瘡等功能。北芪菇的命名是依據(jù)中醫(yī)藥學(xué)“藥食同源”的記載，將正北芪、多種中草藥、農(nóng)作物副產(chǎn)品作培養(yǎng)料，采用科學(xué)的配方和特殊的工藝培育而成的新型菌類產(chǎn)品，故命名為“北芪菇”[1-2]。經(jīng)過山西省醫(yī)藥研究所化驗檢測和權(quán)威專家進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)北芪菇中含有多種人體所需的微量元素、維生素、礦物質(zhì)，是一種食用菌。長期食用北芪菇可以充分補(bǔ)充人體所需的一些營養(yǎng)物質(zhì)，是人們健康實用的美味佳品。分析化驗顯示，北芪菇的營養(yǎng)價值是任何動物食品、植物食品不能比擬的。其高蛋白、低脂肪、礦質(zhì)元素（硫、鐵、鉀、硒）、維生素（硫胺素、核黃素、煙酸）等都是人體良好的營養(yǎng)源。其代謝產(chǎn)物具有極高的藥用價值，有抗腫瘤的多糖蛋白，有抗菌作用的抗生素，有降低血壓、防治腦血管障礙的微量牛黃酸，還有有利于胃腸作用的菌糖、甘露糖和幫助消化的各種酶等。特別是北芪菇內(nèi)含有特殊功能的高倍量硒化物多糖，是普通蘑菇所不具有的。北芪菇可以治療牛皮癬，早在1992、1993 年光明日報就對此作了2 次詳細(xì)的報道[3-4]。

黃芪甲苷是環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物，是中藥黃芪中的有效成分之一，其含量的高低是評價黃芪質(zhì)量好壞的主要標(biāo)準(zhǔn)。其植物來源是來自于豆科亞歷山大黃芪（Astragalus alexandrinus Boiss）的根，深裂黃芪（Astragalus dissectus）的根，膜莢黃芪（Astr-agalus membranaceus（Fisch.）Bungede）的根，綿毛黃芪（Astragalus sieversianus Pall.）的根，多刺黃芪（Astragalus spinosus Vahl）地上部分[5]。黃芪甲苷不僅具有黃芪多糖的作用，還有許多是黃芪多糖無法比擬的作用，其藥效強(qiáng)度是常規(guī)黃芪多糖的2 倍多，抗病毒作用更是黃芪多糖的30 倍。由于含量少、效果好，更是有“超級黃芪多糖”之稱。主要具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、提高機(jī)體的抗病能力、抗病毒作用、抗應(yīng)激功效和作為促生長劑的作用，此外黃芪甲苷還具有改善心肺的功能[6-11]。

有關(guān)北芪菇的化學(xué)成分研究方法有多種，大致有超濾法、高速離心法，水提取法、回流法、超聲提取法、水提醇法，甲醇提取法、酸性乙醇提取法、乙醇提取法、乙醚提取法等。最好的黃芪甲苷的提取方法是乙醇提取法，這種提取方法可以將甲苷的提取率增值到最大[12-19]。至今有關(guān)運用TLC- CMS 聯(lián)用測定北芪菇中的黃芪甲苷還沒有，以北芪菇作為原料，利用薄層色譜法制備提取生物活性物質(zhì)，采用質(zhì)譜、紅外對其進(jìn)行表征與分析。應(yīng)用Plate ExpressTM 技術(shù)可直接從TLC 薄層板上獲取質(zhì)譜圖，其優(yōu)點是不經(jīng)過樣品前處理，可快速從復(fù)雜混合物中獲得目標(biāo)物分子質(zhì)量信息，并對其進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北芪菇和黃芪，山西省渾源縣恒山北芪菇專業(yè)合作社提供。

乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、甲醇、無水乙醇、石油醚、濃硫酸（均為分析純）；色譜甲醇，美國Fisher 提供；硅膠高效 G 板；黃芪甲苷 （CAS:84687-42-3），上海麥克林生化科技有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

ALB-224 型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；XH-300B 型微波-超聲波組合合成/萃取儀，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；KH-3000Plus 型薄層色譜儀，上?？普苌萍加邢薰井a(chǎn)品；Expressions 型質(zhì)譜儀，Plate ExpressTLS-型質(zhì)譜接口，美國Advion 公司產(chǎn)品；Tensor-11 型傅里葉紅外光譜儀，德國布魯克公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 北芪菇中黃芪甲苷的提取

將北芪菇和正北芪干燥粉碎，過80 目篩，取10 g 置于70%乙醇250 mL 溶液中振蕩，于50 ℃下浸提24 h。

超聲波微波萃取儀分3 個階段提取，每階段5 min，共15 min。在超聲波恒定的條件下，設(shè)置溫度為45，50，55 ℃；超聲功率為800，900，1 000 W；微波功率為250，300，350 W；超聲頻率為50 kHz，模式15∶10，電機(jī)轉(zhuǎn)速900 r/min。

將提取液以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心10 min，3 次，合并上清液、過濾、濃縮至體積的1/10。

石油醚去雜后，用飽和正丁醇萃取3 次[20-21]，合并上層溶液、濃縮至無液體溢出時用甲醇（色譜純）將其定容至10 mL。備用。

標(biāo)準(zhǔn)品的制備：稱取黃芪甲苷20 mg 標(biāo)準(zhǔn)品置于10 mL 容量瓶中，用色譜甲醇定容，超聲條件下溶解后分別得到2 mg/mL 的黃芪皂苷Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ標(biāo)準(zhǔn)品，置于2～4 ℃的冰箱中保存。備用。

1.3.2 薄層色譜技術(shù)分離與制備

（1）點樣。用微量進(jìn)樣器緩慢吸取25 μL 黃芪甲苷對照品溶液，置于全自動點樣機(jī)上，設(shè)置點樣參數(shù)（點樣間距10 mm，點樣寬度8 mm，點樣數(shù)目4，點樣量分別為 2，4，6 μL，點樣速度 5 s/μL），在聚酰胺薄層板上進(jìn)行點樣，在吸取25 μL 供試品溶液，點樣20 μL。

（2）展開。在層析缸中配制北芪菇和黃芪的展開劑，分別為氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水= 13∶7∶2∶2 和氯仿∶甲醇∶水= 13∶7∶2，蓋上蓋子搖晃混勻，靜置20 min，將已點樣的薄層板放入展開缸內(nèi)，待距薄層板頂端約1 cm 處時，取出晾干，于通風(fēng)口處，并噴10%硫酸乙醇顯色劑在105 ℃下高溫顯色。

（3）成像。將顯色后的層析板放入薄層色譜成像系統(tǒng)，于波長365 nm 處紫外光燈下拍照觀察層析情況，并拍照記錄。

1.3.3 質(zhì)譜和紅外質(zhì)譜檢測方法

（1）質(zhì)譜檢測方法。用色譜甲醇和超純水作為流動相。將儀器和軟件打開使其處于工作狀態(tài)，用微量進(jìn)樣器吸取10 μL 的黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液插入到進(jìn)樣口處，打到Load 檔開始進(jìn)樣，進(jìn)完樣后打回到Inject 檔。點開譜圖界面對譜圖進(jìn)行分析并保存。

（2）待測液的質(zhì)譜檢測。流動相與測標(biāo)準(zhǔn)品的流動相相同。使儀器和軟件處于工作狀態(tài)，將待測品薄層板置于TLC-質(zhì)譜接口上，使激光對準(zhǔn)圈出的硒代蛋氨酸斑點中心處。用軟件操作進(jìn)行取樣，點開譜圖界面對譜圖進(jìn)行分析并保存。

待測樣品質(zhì)譜檢測方法與黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜檢測方法相同。

（3）紅外檢測方法。打開儀器選擇相應(yīng)的工作界面，用擦鏡紙擦干凈點樣中心處，測試背景，再用毛細(xì)管吸取少量的黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品于點樣中心處，測試樣品，對譜圖界面出現(xiàn)的譜圖進(jìn)行處理和分析。待測樣品的制備與待測樣品的質(zhì)譜檢測方法相同；待測樣品的紅外檢測方法與黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品的檢測相同。

注：待測樣品溶液是指與黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品Rf 值相同的樣品斑點。

1.3.4 熔點儀/旋光儀進(jìn)行物理表征檢測

用甲醇對旋光儀進(jìn)行校正后，然后將待測溶液（用于質(zhì)譜檢測的樣液）倒入，調(diào)節(jié)模式，測定黃芪甲苷的旋光度和比旋光度，記錄其數(shù)值及平均值。將待測溶液蒸發(fā)結(jié)晶后測定其熔點。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄層圖像比對分析

北芪菇樣品與黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品的TLC 成像圖見圖1，正北芪樣品與黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)瓶的TLC 成像圖見圖2。

圖1 北芪菇樣品與黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品的TLC 成像圖

圖2 正北芪樣品與黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)瓶的TLC 成像圖

由圖1 可知，最佳展開劑為氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水= 13∶7∶2∶2（V/V），展開后，與黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品熒光斑點位置一致的熒光斑點為北芪菇中的黃芪甲苷，Rf 值為0.31。

由圖2 可知，最佳展開劑為氯仿∶甲醇∶水=13∶7∶∶2（V/V），展開后，與黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品熒光斑點位置一致的熒光斑點為正北芪中的黃芪甲苷，Rf 值為 0.31。

黃芪甲苷的結(jié)構(gòu)式見圖3。

圖3 黃芪甲苷的結(jié)構(gòu)式

2.2 質(zhì)譜波譜分析

2.2.1 黃芪甲苷結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)

黃芪甲苷為環(huán)阿爾廷型三萜皂苷類化合物，白色至淡黃色粉末，mp29510～29610e；CAS 編號：83207-58-3，分子式：C41H68O14，分子量：784.970 2；白色至淡黃色粉末，熔點295.0～296.0 ℃；易溶于甲醇、乙醇、丙酮，難溶于氯仿、乙酸乙酯等弱極性有機(jī)溶劑。

2.2.2 黃芪甲苷質(zhì)譜波譜分析

黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜波譜圖見圖4，北芪菇中黃芪甲苷的質(zhì)譜波譜圖見圖5，正北芪中黃芪甲苷的質(zhì)譜波譜圖見圖6。

圖4 黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜波譜圖

通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)[20]可以得知，分子離子峰的識別首先是該離子峰范圍內(nèi)最大的峰值（m/z），其次需要判斷該物質(zhì)是否符合氮律，不含N 或含偶數(shù)N的有機(jī)分子，其分子離子峰的質(zhì)荷比（即分子量）為偶數(shù)。含奇數(shù)N 的有機(jī)分子，其分子離子峰的質(zhì)荷比（即分子量）為奇數(shù)，這兩點是識別離子峰的關(guān)鍵。黃芪甲苷的分子量為784.97，分子式為C41H68O14，結(jié)構(gòu)式中不含N。從圖4、圖5 和圖6 可以觀察到，三者離子峰范圍內(nèi)的最大峰值均為807.6，與黃芪甲苷的分子量相差約23，表示該物質(zhì)在電子的轟擊下增加了一個Na 離子[M+Na+=807.97]，為合理性的增加，由此可以確定黃芪甲苷的離子峰為807.6。

圖5 北芪菇中黃芪甲苷的質(zhì)譜波譜圖

圖6 正北芪中黃芪甲苷的質(zhì)譜波譜圖

2.3 黃芪甲苷的紅外圖譜分析

黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品的紅外圖譜見圖7，北芪菇中黃芪甲苷的紅外波譜圖見圖8，正北芪中黃芪甲苷的紅外波譜圖見圖9。

圖7 黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品的紅外圖譜

通過查閱文獻(xiàn)[21]與分析圖7、圖8 和圖9，可以看到三者在1 600～1 700 cm-1有相似的峰，說明都含有苯環(huán)；在3 000～3 200 cm-1三者有相似的峰，說明都含有羥基；在2 900～3 000 cm-1有相似的峰，說明都含有-C-H 單鍵；在1 380 cm-1附近有相似的峰，說明都含有-CH3鍵；在1 000～1 500 cm-1有相似的峰，說明都含有C-O 單鍵；在700～1 000 cm-1之間有相似的峰，說明=C-H 彎曲振動吸收峰在三者中都具有，這些峰值基本符合黃芪甲苷結(jié)構(gòu)的特征峰。

圖8 北芪菇中黃芪甲苷的紅外波譜圖

圖9 正北芪中黃芪甲苷的紅外波譜圖

結(jié)合質(zhì)譜波譜特征，由此可以確定所測樣品是黃芪甲苷。

2.4 樣品熔點、旋光度和比旋光度分析

北芪菇中黃芪甲苷的熔點見表1。

表1 北芪菇中黃芪甲苷的熔點/℃

由表1 可知，北芪菇樣品與黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品熔點均為295 ℃，在熔點295.0～296.0 ℃內(nèi)，而且易溶于甲醇、乙醇、丙酮等極性溶劑。

北芪菇中黃芪甲苷的旋光度與比旋光度見表2。

表2 北芪菇中黃芪甲苷的旋光度與比旋光度

相關(guān)文獻(xiàn)記載，黃芪甲苷的旋光度：-56.6（c,0.13 in DMF），與北芪菇所測樣品基本一致。

3 結(jié)論

以恒山北芪菇為原料，乙醇-水（7∶3（V/V））為提取劑。微波超聲波萃取儀分3 個階段提取，每階段5 min，共15 min。在超聲波恒定的條件下，設(shè)置溫度為45，50，55 ℃，超聲功率為800，900，1 000 W，微波功率為250，300，350 W，超聲頻率為50 kHz，模式15∶10，電機(jī)轉(zhuǎn)速900 r/min。經(jīng)多級萃取后獲得黃芪皂苷的正丁醇相。以氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水=13∶7∶2∶2（V/V）為展開劑，薄層層析獲得的黃芪甲苷樣品熒光斑點顯色清晰，與黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品比對熒光斑點位置一致，其Rf 值為0.31。

質(zhì)譜圖譜顯示，黃芪所測樣品的質(zhì)荷比與黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品基本保持一致，質(zhì)荷比均為807.6，與黃芪甲苷的分子量相差約23，表示該物質(zhì)在電子的轟擊下增加了一個Na 離子[M+Na+=807.97]，為合理性的增加。紅外譜圖顯示，黃芪所測樣品所含官能團(tuán)與黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品基本相同。

北芪菇樣品與黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品熔點均為295 ℃，在熔點295.0～296.0 ℃內(nèi)，而且易溶于甲醇、乙醇、丙酮等極性溶劑。黃芪甲苷的旋光度：-56.6（c,0.13 in DMF），與北芪菇所測樣品基本一致。

黃芪甲苷應(yīng)用在醫(yī)學(xué)上可以治療牛皮蘚、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、提高機(jī)體的抗病能力，還有抗病毒作用和抗應(yīng)激功效；作為促生長劑、黃芪甲苷可改善心肺功能等[22-24]。然而，研究發(fā)現(xiàn)不同物化特性的溶劑體系和多樣性的操作條件，具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，為從復(fù)雜的天然產(chǎn)物粗制品中提取不同特性的有效成分提供了有利條件。

TLC-MS-IR 聯(lián)用在北芪菇生物活性物質(zhì)分離純化中具有操作簡便、容易掌握、回收率高、重現(xiàn)性好、分離效率高、分離量較大等特點，該技術(shù)有望在標(biāo)準(zhǔn)品的制備、天然產(chǎn)物化學(xué)成分研究及新藥篩選、評價、分析或質(zhì)控需求等領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用。