蘇雨，田振華，羅丹丹，齊祥宇，劉魯娜，管慶波

山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院，濟(jì)南250021

肝癌是常見的人類消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在所有癌癥中位居第七，是全球癌癥相關(guān)的第四大死因［1］。在美國(guó)，肝癌的五年生存率約為18%，其致死性僅次于胰腺癌［2］，在中國(guó)，肝癌的五年生存率更差，僅為12%［3］。肝細(xì)胞肝癌（HCC）為原發(fā)性肝癌的主要類型，早期HCC 可以接受潛在的治愈性治療，包括手術(shù)治療、射頻消融和肝臟移植等［4］，但由于其起病隱匿、高度惡性、早期即發(fā)生轉(zhuǎn)移等特征，對(duì)于80%以上的患者，在診斷時(shí)通常已喪失良好的治療機(jī)會(huì)［5］。因此，探索和尋找HCC 預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物及潛在的治療靶點(diǎn)對(duì)解決這一全球性健康問題尤為重要。DNAJC13 是熱休克蛋白家族（Hsp40）成員之一，也被稱為RME8，是早期在秀麗隱桿線蟲的胞吞缺陷篩查中發(fā)現(xiàn)的一種含有DnaJ 結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸中發(fā)揮作用［6-7］。近年來(lái)，DNAJC13在腫瘤中的作用逐漸被發(fā)現(xiàn)，有研究報(bào)道，DNAJC13是ErbB2陽(yáng)性乳腺癌的潛在調(diào)控靶標(biāo)［8］，DNAJC13 可作為miR-193b 的靶基因促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展［9］。然而，DNAJC13 在HCC 中的作用目前仍未知。本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)癌癥基因組圖集（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)、國(guó)際癌癥基因組聯(lián)盟（ICGC）數(shù)據(jù)庫(kù)、基因表達(dá)綜合（GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)中DNAJC13 在HCC 中的mRNA 表達(dá)水平進(jìn)行分析，對(duì)其表達(dá)與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系及潛在的生物信號(hào)通路進(jìn)行深度挖掘，為HCC 的預(yù)后評(píng)價(jià)及治療提供思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)資料獲取 通過(guò)檢索TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//portal. gdc. cancer. gov/）及ICGC 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：//dcc.icgc.org/）下載HCC及其他26種癌癥相關(guān)的表達(dá)數(shù)據(jù)、HCC 相關(guān)的臨床資料，TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)HCC 臨床資料檢索條件：TCGA-LIHC，共424個(gè)樣本（包含50 個(gè)癌旁樣本）用于表達(dá)分析，370 個(gè)病例用于臨床相關(guān)分析，下載時(shí)間為2020年12月；ICGC 數(shù)據(jù)庫(kù)臨床資料檢索選用ICGC-LIRI-JP 項(xiàng)目的資料，共431個(gè)樣本（包含199個(gè)癌旁樣本）用于表達(dá)分析，232 個(gè)病例用于臨床相關(guān)分析，下載時(shí)間為2020 年12 月。同時(shí)，選取GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www. ncbi.nlm. nih. gov/geo/）中GSE25097（包含癌旁：289、癌：268 個(gè)）、GSE14520（包含癌旁：220 個(gè)、癌：225 個(gè)）數(shù)據(jù)集用于表達(dá)分析驗(yàn)證。數(shù)據(jù)整理及標(biāo)準(zhǔn)化矯正使用R（3.6.3）及Perl（5.26.3）。

1.2 基因富集分析（GSEA） 本研究中，首先利用GSEA 軟件根據(jù)與DNAJC13表達(dá)的相關(guān)性生成所有基因的有序列表，然后進(jìn)行基因富集來(lái)說(shuō)明高、低DNAJC13 表達(dá)組之間存在的生存差異。富集分析基于從GSEA 官網(wǎng)下載的c2. cp. kegg. v7.2. sym?bols. gmt 規(guī)范化通路基因集，每次分析對(duì)基因組進(jìn)行1 000次排列。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用R（3.6.3）及Graphpad（8.0.8）統(tǒng)計(jì)軟件。兩組間的差異比較使用非參數(shù)檢驗(yàn)，非配對(duì)樣本使用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)，配對(duì)樣本使用Wilcoxon matched-pairs signed rank 檢驗(yàn)。使用邏輯回歸方法分析臨床病理特征與DANJC13表達(dá)間的關(guān)系。生存分析采用Kaplan-Meier法，Logrank 檢驗(yàn)計(jì)算P，最佳截?cái)嘀凳褂肦 語(yǔ)言中的“survminer”程序包確定。單因素和多因素Cox 風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型用于分析DANJC13 及其他臨床病理特征與生存率間的關(guān)系。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基本臨床信息 本研究納入的臨床數(shù)據(jù)來(lái)自TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)370 例原發(fā)性HCC 病例和ICGC數(shù)據(jù)庫(kù)232 例原發(fā)性HCC 病例，患者臨床特征包括年齡、性別、BMI、T 分期（T），淋巴結(jié)侵犯（N），遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M），病理分期及分級(jí)、生存狀態(tài)、癌癥家族史、新的腫瘤事件等。來(lái)自TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)的HCC 病例中，年齡分布在16～90 歲，中位年齡為61 歲，其中61～80 歲病例最多，為183 例（49.5%）；男249 例（67.3%），女120 例（32.7%）；病理分期Ⅰ期病例最多，為171 例（46.2%）；病理分級(jí)G2級(jí)病例最多，為177 例（47.8%）。來(lái)自ICGC 數(shù)據(jù)庫(kù)的HCC 病例中，年齡分布在31～89 歲，中位年齡68 歲，占比最多的在61～80 歲，為167 例（72.0%）例；男171 例（73，7%），女61 例（26.3%）；病理分期Ⅱ期病例最多，為106 例（45.7%）；病理分級(jí)G2級(jí)病例最多，為121 例（52.2%）。

2.2 DNAJC13 在肝癌及多種腫瘤組織中的表達(dá)通過(guò)對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中的肝細(xì)胞肝癌表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行非配對(duì)和配對(duì)分析，結(jié)果表明，相對(duì)于癌旁組織，DNAJC13 表達(dá)在腫瘤組織中上調(diào)（P 均＜0.01）。IC?GC 數(shù)據(jù)庫(kù)、GSE25097 和GSE14520 數(shù)據(jù)庫(kù)集中肝細(xì)胞癌表達(dá)數(shù)據(jù)分析結(jié)果與TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果一致（P均＜0.01）。

2.3 DNAJC13 高表達(dá)者病理分期和分級(jí) 來(lái)自TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)的樣本中，DANJC13 表達(dá)較高的患者病理分期和病理分級(jí)更高（P 均＜0.05）；來(lái)自ICGC數(shù)據(jù)庫(kù)的樣本中，DANJC13 表達(dá)較高的患者病理分期和病理分級(jí)更高（P 均＜0.05）。邏輯回歸分析的方法亦得出相似結(jié)果，見表1。

表1 DNAJC13 mRNA表達(dá)的臨床相關(guān)性分析（邏輯回歸）

2.4 DNAJC13高表達(dá)與HCC預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier 生存分析顯示，在TCGA 隊(duì)列中，DNAJC13 高表達(dá)組的總生存率（OS）（圖1A，P＜0.01）及無(wú)病生存率（DFS）（圖1B，P＜0.01）均相對(duì)于低表達(dá)組更差；在ICGC 隊(duì)列中，DANJC13 高表達(dá)組總生存率（0S）更差（圖1C，P＜0.05）。對(duì)于TCGA 隊(duì)列的單因素和多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸分析提示DNAJC13可作為影響HCC 預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因子（HR 分別為1.877、2.038，P均＜0.01），見圖1D。

2.5 DNAJC13 相關(guān)信號(hào)通路富集分析 在DNAJC13 高表達(dá)組出現(xiàn)adherens junction、endocyto?sis、ERBB signaling pathway、pathways in cancer、ubiq?uitin mediated proteolysis基因集的富集。

3 討論

熱休克蛋白（HSP）是細(xì)胞在應(yīng)激條件下產(chǎn)生的一類蛋白質(zhì)，因最初發(fā)現(xiàn)這些基因在熱處理細(xì)胞中表達(dá)而得名，其被人們所熟知的功能是幫助蛋白質(zhì)的折疊，是細(xì)胞中蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的守護(hù)者［10］。然而，并不是所有的HSP 都在應(yīng)激誘導(dǎo)時(shí)才表達(dá)，有許多是組成性表達(dá)，并在細(xì)胞內(nèi)具有管家基因功能［11］。隨著研究的深入，HSP 在癌癥中的作用逐漸走進(jìn)人們的視線，HSP90 和HSP70 家族成員已被確定為癌癥的重要因素，并被認(rèn)為是真正的抗癌藥物靶點(diǎn)［12］。

圖1 DNAJC13高表達(dá)與HCC預(yù)后不良的關(guān)系

DNAJC13 是HSP40 成員之一［6］，在該家族成員中，有許多蛋白已被證實(shí)參與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，在諸多腫瘤中發(fā)揮促癌或抑癌作用，如在惡性膠質(zhì)瘤和前列腺癌中，DNAJA1 表達(dá)與腫瘤惡性程度及放療耐受性相關(guān)［13］；DNAJA3 被證明參與多種腫瘤的增殖、凋亡、遷移及轉(zhuǎn)移調(diào)控［14］；DNAJB4 可抑制肺癌的進(jìn)展［15］；在乳腺癌中，DNAJB6 通過(guò)抑制Wnt 信號(hào)通路抑制細(xì)胞遷移、侵襲和腫瘤發(fā)生［16］；在轉(zhuǎn)移性宮頸癌中，DNAJC9 表達(dá)上調(diào)［17］；在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中，DNAJC10 過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡敏感性［18］；最近研究已證實(shí)DNAJC13 是ErbB2 陽(yáng)性乳腺癌的潛在調(diào)控靶標(biāo)［8］，可作為miR-193b 的靶基因促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展［9］。這些結(jié)果提示HSP 家族在腫瘤中有較大的潛在研究?jī)r(jià)值。

近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和諸多大型數(shù)據(jù)庫(kù)的建立為腫瘤潛在機(jī)制的研究提供了便利，本研究中我們利用生物信息學(xué)的方法探究DNAJC13在HCC 中的潛在作用。GSEA 是一種計(jì)算方法，可確定先驗(yàn)定義的一組基因是否在兩個(gè)生物學(xué)狀態(tài)之間顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異［19］。通過(guò)對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)、ICGC數(shù)據(jù)庫(kù)、GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中肝癌及其他腫瘤表達(dá)譜的分析，我們發(fā)現(xiàn)，DNAJC13 在肝癌及多種腫瘤中的表達(dá)較正?；虬┡越M織升高且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。隨后我們結(jié)合臨床資料對(duì)其表達(dá)在TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)和ICGC 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行臨床相關(guān)性分析，結(jié)果顯示在這兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中DNAJC13 高表達(dá)均與更高的病理分期和分級(jí)呈正相關(guān)關(guān)系。對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)的生存分析顯示，在HCC患者中DNAJC13高表達(dá)組無(wú)論總生存率還是無(wú)病生存率均較低表達(dá)組差，對(duì)ICGC數(shù)據(jù)庫(kù)的生存分析顯示，在HCC患者中DNAJC13高表達(dá)組總生存率相對(duì)更差。TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)資料進(jìn)行的單因素和多因素Cox回歸分析提示DNAJC13表達(dá)可作為影響HCC 患者總生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，進(jìn)一步說(shuō)明DNAJC13對(duì)HCC 預(yù)后預(yù)測(cè)的可靠性。GSEA 結(jié)果顯示adherens junction、endocytosis、ERBB signaling pathway、pathways in cancer、ubiquitin mediated prote?olysis 五個(gè)基因集在兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)排名前20 個(gè)富集結(jié)果中均有出現(xiàn)且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這些通路與腫瘤發(fā)生有關(guān)，其中DNAJC13 通過(guò)ERBB 信號(hào)通路在乳腺癌中作用已被證實(shí)［8］，提示DNAJC13 在HCC 中可能是一個(gè)致癌基因，并通過(guò)這些通路在HCC 中發(fā)揮作用，這將對(duì)后續(xù)的機(jī)制研究提供有力的理論支持和指導(dǎo)，提示DNAJC13 可能是一個(gè)潛在的HCC 治療靶點(diǎn)。

本研究存在以下局限性。首先，這項(xiàng)研究是一項(xiàng)回顧性研究，將來(lái)應(yīng)進(jìn)行前瞻性研究以彌補(bǔ)該回顧性研究的局限性；其次，公共數(shù)據(jù)庫(kù)中缺少例如患者用藥和（或）手術(shù)治療的具體細(xì)節(jié)，亦會(huì)影響患者的預(yù)后；最后，肝癌中DNAJC13 的蛋白及其在肝癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中的直接作用仍有待體外驗(yàn)證。盡管這項(xiàng)研究有一定局限性，但確實(shí)為研究DNAJC13 在肝癌中的作用提供了線索，并為HCC 提供了可能的治療靶標(biāo)和潛在的預(yù)后標(biāo)志物。

綜上所述，DNAJC13表達(dá)升高可能是HCC 的一個(gè)可靠的獨(dú)立預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。此外，黏附連接、內(nèi)吞作用、ERBB 信號(hào)通路、泛素介導(dǎo)的蛋白水解作用可能是DNAJC13 參與HCC 發(fā)生和進(jìn)展的關(guān)鍵通路。