李杰華 端 群 史明濤 吳潞梅 柳 寒 林擁軍吳高兵 范楚川,* 周永明,*

1 華中農業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室, 湖北武漢 430070; 2 浙江省農業(yè)科學院, 浙江杭州 310021; 3 華中農業(yè)大學植物科學技術學院, 湖北武漢 430070

油菜是我國重要的油料作物, 常年種植面積約700多萬公頃, 菜籽油占國產油料作物產油量的55%以上, 是國產食用植物油的第一大來源, 在維護國家食用油供給安全戰(zhàn)略中居于核心地位[1]。雜草危害是造成油菜減產的主要因素。雜草與油菜競爭水、肥等生存資源, 影響油菜正常生長發(fā)育, 可導致產量平均下降15.8%, 嚴重時可達50%以上[2]。油菜田間雜草可通過人工除草和施用化學除草劑防治。人工除草耗工耗力, 大幅增加了田間用工成本、制約了油菜的機械化規(guī)?；N植, 導致生產效率和農民收益降低; 培育抗除草劑油菜新品種是油菜機械化、規(guī)?；N植的必要配套措施, 可解決大田除草的問題, 有效降低生產成本。

草甘膦是一種非選擇性除草劑, 其作用靶標為莽草酸路徑中的關鍵酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase, EPSPS); 通過抑制 EPSPS的活性, 阻斷莽草酸途徑, 導致植物芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)的生物合成受到抑制和莽草酸在植物體內過量積累, 最終引起植物體內代謝混亂和植物死亡[3]。作為應用最為廣泛的廣譜性除草劑之一, 草甘膦具有除草效率高、成本低、生態(tài)風險小等優(yōu)勢。在2015年全球農藥市場調查中, 草甘膦以49.65億美元的銷售額位居除草劑銷售額榜首[4]。

目前抗草甘膦作物的培育主要通過常規(guī)的誘變育種和轉基因育種來實現(xiàn)。誘變育種是在細胞或組織培養(yǎng)基中添加除草劑進行篩選, 以及通過對花粉、小孢子、種子等誘變處理后進行篩選, 獲得抗性材料; 利用該方法已在油菜、水稻和大豆等多種作物中獲得了具有草甘膦抗性的突變體[5-7]。而轉基因育種是利用從從微生物或植物體中分離出抗性基因, 通過遺傳轉化載體導入作物基因組中來實現(xiàn);利用該方法已成功培育了大豆、油菜、棉花、玉米等多種抗草甘膦作物[8-11], 是目前發(fā)展迅速、應用最為廣泛和有效的抗草甘膦育種方法。在轉基因育種中, 利用的抗草甘膦基因主要有3種: (1)突變后的I型EPSPS基因。例如, Comai等[12]從鼠傷寒沙門氏菌中分離得到具有草甘膦抗性的aroA基因, 并將其轉入煙草獲得了抗草甘膦轉基因煙草; (2)天然的抗草甘膦II型EPSPS基因。例如, 孟山都公司從根癌農桿菌 CP4菌株中獲得的抗草甘膦cp4-epsps基因[13]; (3)草甘膦降解基因。例如, 來源于蒼白桿菌的gox基因[14]。目前商業(yè)化應用的草甘膦抗性基因主要包含CP4-epsps、mepsps、2mepsps、epsps(Ag)、grg、gat4601、gat4621等, 其中應用最為廣泛的是CP4-epsps基因[8,15]。利用這些基因培育的抗草甘膦油菜已在美國、加拿大、澳大利亞等國家實現(xiàn)了廣泛的商業(yè)化應用。但是這些基因資源的知識產權絕大部分被國外生物技術公司所壟斷, 極大限制了我國油菜抗除草劑品種的培育及其產業(yè)化的發(fā)展。近年來, 隨著基因編輯技術的快速發(fā)展, 對植物體內EPSPS基因的保守氨基酸進行精準的堿基替換, 也成功獲得了抗草甘膦的水稻和木薯[16-17], 為除草劑作物的培育提供了新方法。但是, 該方法在不同作物中的應用還有賴于單堿基編輯技術的建立。

非敏感EPSPS合酶基因I.variabilis EPSPS是華中農業(yè)大學從放線菌屬變異白蟻菌(Isoptericola variabilis)中克隆到的草甘膦抗性基因[18]。該基因編碼的蛋白不具有CP4-EPSPS專利保護的4條保守序列, 但保留了對草甘膦較高的耐受性, 是具有完全自主知識產權的抗除草劑基因資源[19]。利用該基因創(chuàng)制的水稻轉化體可以耐受8400 g hm-2高劑量的草甘膦, 顯示出良好的應用前景[18]。本研究旨在利用該基因創(chuàng)制新型的抗草甘膦油菜種質資源, 為培育抗除草劑轉基因新品種奠定基礎, 從而為我國油菜大田生產的雜草治理提供新的解決方案。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及其種植

用于遺傳轉化的甘藍型油菜受體品系為 J9707,是本實驗室篩選獲得的具有高遺傳轉化效率的半冬性低芥酸品系。常規(guī)品種中雙11號由華中農業(yè)大學國家油菜工程技術中心提供。轉基因T0代材料在晝/夜 16 h /8 h、22℃/18℃、光照強度 115～144 μmol m-2s-1的培養(yǎng)室內種植。其后代材料種植于華中農業(yè)大學校內油菜轉基因試驗基地。

1.2 植物載體及其遺傳轉化

本研究所用的草甘膦抗性基因EPSPS是從放線菌屬變異白蟻菌中克隆得到, 命名為I.variabilis EPSPS[20]。在該基因的5′端連入來源于擬南芥EPSPS蛋白的葉綠體信號肽序列(chloroplast transit peptide,CTP; GenBank: CAA29828.1), 具有將表達出的EPSPS蛋白運送到芳香族氨基酸的合成場所葉綠體中的功能。然后, 將其替換 pCAMBIA1300質粒中的潮霉素基因,獲得具有CaMV 35S啟動子和CaMV poly(A)終止子的I.variabilis EPSPS超量表達載體pTGH-1 (圖1)。

遺傳轉化采用農桿菌介導的油菜下胚軸遺傳轉化法[21]。

1.3 轉基因植株的陽性和轉化體特異性的 PCR檢測

設計 3對特異性引物 EPSPS-F/EPSPS-R、35SP-1/35SP-2和 35ST-1/35ST-2分別用于檢測pTGH-1載體 T-DNA區(qū)的目的基因I.variabilis EPSPS、CaMV 35S啟動子元件和CaMV 35S終止子元件(圖1)。

利用分離的T-DNA插入位點側翼序列信息, 設計油菜轉化體的特異性上游引物, 分別與位于T-DNA的LB端的共同下游引物(P5)進行組合, 用于轉化體特異性PCR檢測。PCR擴增體系含50 ng μL-1的模板 DNA 2.0 μL、10×PCR buffer 1.0 μL、2 mmol L-1dNTPs 0.8 μL、10 μmol L-1引物各 0.4 μL、2 U μL-1TaqDNA聚合酶 0.15 μL, 添加 ddH2O至10 μL。PCR擴增程序為94℃預變性4 min; 94℃變性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 擴增32個循環(huán); 最后72℃延伸10 min。PCR產物在1.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳和照相觀察。所有引物序列見表1。

1.4 Southern blot檢測轉基因拷貝數(shù)

在目的基因I.variabilis EPSPS和CaMV 35S啟動子上分別設計特異性引物對 Iva-EPSPS-F/Iva-EPSPS-R 和 p130-35sF/p130-35sR, 并對pTGH-1質粒進行擴增, 用于制備 EPSPS探針和CaMV 35S promoter探針(圖1)。油菜基因組DNA的提取、酶切、電泳和轉膜、DNA探針的制備、雜交和檢測等具體程序見李杰華[22]的方法。引物序列見表1。

1.5 轉化單株中的T-DNA插入位點鑒定

利用反向PCR的方法分離轉基因的T-DNA插入位點。具體程序見李杰華[22]的方法。第1輪PCR引物為P1/SP2, 第2輪PCR引物為P3/SP3, 引物序列見表1所示。以SP3引物進行PCR產物測序。將克隆得到的序列與甘藍型油菜參考基因組序列(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)進行比對和分析, 確定T-DNA插入在油菜基因組中的具體位點。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.6 基因表達量檢測

抽提油菜不同組織的 RNA進行 RT-PCR (reversed transcript polymerase chain reaction)和qRTPCR (quantitative real-time PCR)的基因表達量檢測。RNA抽提、反轉錄和RT-PCR等程序詳見Fan等[23]的方法。I.variabilis EPSPS和內參基因ACTIN2的表達檢測引物對分別為 EPs-qRTF/EPs-qRTR和BnACT-qRTF/ BnACT-qRTR, 序列詳見表1。qRT-PCR反應體系包含cDNA模板4 μL、2 × SYBR Green Mix 10 μL、2.5 μmol L-1的引物各 2 μL, 加 ddH2O 至總體積20 μL。PCR反應程序為95℃變性3 min; 95℃變性12 s, 60℃退火 30 s, 72℃延伸 30 s, 45個循環(huán)。以ACTIN2作為對照, 目的基因的Ct值減去ACTIN的Ct值得到ΔCt, 計算2(ΔCt)即為相對表達量的值。

用Western blot方法對轉化體葉片中的I.variabilisEPSPS蛋白表達量進行檢測, 以油菜ACTIN2為內參基因, 以轉化受體J9707為陰性對照。油菜葉片的蛋白提取、蛋白濃度測定和Western blot檢測等具體程序見李杰華[22]的方法。

1.7 除草劑抗性檢測

待油菜長出 5～6片真葉時, 對各材料進行除草劑草甘膦的噴施處理, 以J9707為陰性對照。除草劑施用劑量設置0倍(噴施等量清水)、生產上推薦劑量的1倍(450 g hm-2農達異丙胺鹽制劑)、2倍(900 g hm-241%農達異丙胺鹽制劑)和 4倍(1800 g hm-2農達異丙胺鹽制劑)。在噴施處理前、噴施處理后1～4周內觀察和調查抗性表現(xiàn)。

2 結果與分析

2.1 甘藍型油菜I.variabilis EPSPS轉基因材料創(chuàng)建及其陽性鑒定

將轉化載體 pTGH-1通過電擊法轉入農桿菌GV3101中, 然后通過農桿菌介導的油菜下胚軸遺傳轉化法導入到 J9707中。由于 pTGH-1中不含篩選標記基因, 因此在油菜轉化過程中利用目的基因I.variabilis EPSPS進行篩選, 分別在愈傷誘導和分化階段添加30 mg L-1的草甘膦, 而在其他階段中沒有施加選擇壓。最終, 經過侵染、共培養(yǎng)、愈傷誘導、分化、生根和移苗等轉化過程, 共獲得130個抗性植株。

為了確定這些抗性植株的基因組中轉化載體的功能元件整合情況, 利用3對特異性引物EPSPS-F/EPSPS-R、35SP-1/35SP-2和 35ST-1/35ST-2分別檢測 pTGH-1載體 T-DNA區(qū)的目的基因I.variabilisEPSPS、CaMV 35S啟動子元件和CaMV 35S終止子元件(圖1)發(fā)現(xiàn), 126株含有完整外源插入序列的目的功能片段, 轉基因陽性率為97% (圖2)。

2.2 陽性轉化單株的拷貝數(shù)檢測

針對I.variabilis EPSPS基因設計探針(圖1), 采用Southern blot技術對96份T0代陽性轉化單株進行了轉基因拷貝數(shù)檢測。如圖3所示, 轉基因單株中的 T-DNA插入存在 1～12個拷貝的變異, 其中單拷貝個體占 44.8%, 兩拷貝和三拷貝個體分別占15.6%和11.5%。表明本研究所采用的農桿菌介導的油菜下胚軸遺傳轉化法以及采用的草甘膦選擇壓有利于單拷貝和低拷貝轉基因株系的產生。

根據(jù) T0代拷貝數(shù)檢測結果, 同時結合它們后代株系的田間表現(xiàn), 選擇具有 1～2個拷貝的優(yōu)良株系的后代進行了拷貝數(shù)驗證。分別采用HindIII和EcoRI 2種酶切、EPSPS基因和CaMV 35S啟動子2種探針(探針位置見圖1所示)對它們的T2和T3代陽性株系進行 Southern blot檢測, 證實這些家系的拷貝數(shù)與 T0代檢測結果一致(圖4)。進一步選擇 4個具有單拷貝插入的株系進行了T1代除草劑抗性分離的檢測, 即苗期使用田間推薦濃度的 2倍草甘膦進行處理, 結果可以看出這些家系的存活單株與死亡單株符合 3∶1的分離比(表2), 從而進一步證實了轉基因拷貝數(shù)檢測結果的準確性。基于上述結果,從中挑選出 3個單拷貝插入株系(EPS-2、EPS-6和EPS-7)和2個雙拷貝插入株系(EPS-1和EPS-5)用于后續(xù)的試驗研究。

2.3 單拷貝轉化株系中T-DNA插入位點鑒定

利用反向PCR技術分離T-DNA插入位點側翼序列, 并將分離的序列與甘藍型油菜參考基因組序列進行比對, 確定了這些轉化體中T-DNA整合到染色體中的具體位置(圖5)。在EPS-2轉基因系分離得到 1617 bp的側翼序列, 可以比對到油菜參考基因組的chrA05:16529633處, 序列同源性達到99%; 該插入位置位于BnaA05g21420D基因的3′末端。EPS-6轉基因系分離得到 1578 bp的側翼序列, 可以比對到油菜參考基因組的 chrC02:9519946處, 序列同源性達到99%; 該插入位置位于基因BnaC02g14170D和BnaC02g14180D之間的基因間區(qū)。EPS-7轉基因系分離得到491 bp的側翼序列, 可以比對到油菜參考基因組的 chrC07:19068559處, 序列同源性達到99%; 該插入位置位于基因BnaC07g13430D和BnaC07g13440D之間的基因間區(qū)。

表2 單拷貝轉基因家系草甘膦抗性分離鑒定Table 2 Glyphosate-resistant segregation analysis of transgenic lines with single T-DNA insertion

2.4 利用特異性PCR驗證轉化株系中的T-DNA插入位點

利用上述分離的側翼序列信息, 分別設計了EPS-2、EPS-6和EPS-7等油菜轉化體的特異性的上游引物(EPSPS2 F、EPSPS6 F和EPSPS7 F), 分別與載體上的共同下游引物P5進行組合, 用于轉化體特異性PCR檢測(表1)。

利用轉化體特異性引物對這些家系的4個不同世代的植株(T0～T3)進行 PCR 檢測(圖5)發(fā)現(xiàn), 各轉化體從 T0～T3世代單株均獲得了預期特異性片段,而陰性對照 J9707都沒有任何條帶。證明 EPS-2、EPS-6和 EPS-7等油菜轉化體基因組中整合的T-DNA在不同世代間的是穩(wěn)定的。

2.5 轉基因植株中I.variabilis EPSPS基因的表達檢測

在T0代, 分別用RT-PCR和Western blot檢測了幾個轉化體的葉片組織中目的基因的表達情況。從圖7可以看出, 在EPS-1、EPS-2、EPS-5、EPS-6和 EPS-7等轉化體中可以檢測到目的基因超量表達, 而在轉化受體 J9707中檢測不到明顯的目的基因表達。

在 T3代, 利用 qRT-PCR技術檢測了 EPS-2、EPS-6和EPS-7等轉化體在幼葉、成熟葉、子葉、下胚軸、根、花蕾和種子等不同組織中的基因表達量(圖7-C)。相對于轉化受體J9707, 3個轉化體在各個組織中均能檢測到目的基因的上調表達; 在不同轉化體中目的基因的表達量有所變異, 其中 EPS-6在不同組織中都表現(xiàn)出相對較高的表達水平。

2.6 轉基因植株的除草劑抗性鑒定

在 T1代, 對 EPS-2、EPS-6和 EPS-7等轉化體的草甘膦抗性進行了初步評價, 以 J9707和常規(guī)品種中雙11號為陰性對照, 苗期使用田間推薦濃度的2倍草甘膦進行了處理。由圖8可以看出, 2種陰性對照在處理后藥害嚴重, 20 d左右植株完全死亡; 而各轉化體都表現(xiàn)出對草甘膦的抗性。EPS-6在處理后幾乎未見明顯的藥害, 與對照條件下(噴施等量清水)的植株生長相似, 表現(xiàn)出很好的草甘膦抗性;EPS-2和 EPS-7等轉化體也表現(xiàn)較好的抗性, 但是比對照條件下的植株生長弱小, 表現(xiàn)出一定程度的藥害。

為進一步確定目標除草劑抗性的功能穩(wěn)定性,在 T3代對 EPS-1、EPS-2、EPS-5、EPS-6和 EPS-7等株系進行苗期的4種草甘膦濃度的噴施處理(0倍、1倍、2倍和4倍), 以J9707為對照。從圖9可以看出, 陰性對照J9707在處理后藥害嚴重, 在4倍濃度噴施處理后第 4周完全死亡; 而各轉化體在 4倍濃度噴施處理后仍未見明顯的藥害發(fā)生, 都表現(xiàn)出很好的草甘膦抗性。

3 討論

根據(jù)國際農業(yè)生物技術應用服務組織(International Agricultural Biotechnology Application Service Organization, ISAAA)提供的數(shù)據(jù), 截至2020年, 全世界共有70個國家和地區(qū)種植或進口了轉基因作物, 全球轉基因作物種植面積達 1.917億公頃, 涉及32個作物種類、526項轉基因作物事件。其中, 除草劑耐受性的轉基因事件達 341項, 占總轉基因作物事件的 64.8%, 而抗除草劑轉基因油菜轉化事件有38項, 占轉基因油菜轉化事件的90.5%。目前應用的抗除草劑轉基因油菜主要有抗草甘膦、抗草銨膦和抗溴苯氰等類型, 其中種植面積最廣的是抗草甘膦。油菜中廣泛應用的的抗草甘膦基因絕大部分來自于孟山都和杜邦等國外生物技術公司,其中孟山都公司從根癌農桿菌CP4菌株中獲得的抗草甘膦CP4-epsps基因應用最為成功; 該酶對草甘膦不敏感, 對 EPSPS催化的底物 5-磷酸烯醇式丙酮酸(5-phosphoenolpyruvate, PEP)具有很高的親和力; 因此, 它可以取代植物的內源EPSPS合成酶體系, 使莽草酸途徑正常進行, 從而達到抗草甘膦的效果[15,22]。本研究使用的I.variabilis EPSPS是從細菌I.variabilis中克隆到的一種新型的抗草甘膦基因[11], 與已獲得轉基因批準的CP4-epsps、玉米EPSPS突變體以及GRG23突變體中的EPSPS基因的氨基酸序列同源性分別只有 27.1%、33.5%和31.5%[24]。因此,I.variabilis EPSPS是一種具有完全自主知識產權的新型抗草甘膦基因[19]。

本研究成功將該基因轉入到甘藍型油菜中, 獲得了一批單拷貝的轉基因株系。通過多代的分子特征檢測證實該基因穩(wěn)定整合到油菜基因組中, 在多個世代間可以檢測到目的基因的超量表達。在 T1代對單拷貝家系EPS-2、EPS-6和EPS-7進行草甘膦噴施處理發(fā)現(xiàn), 轉I.variabilis EPSPS的不同家系均表現(xiàn)出草甘膦抗性, 其中EPS-6家系抗性表現(xiàn)最優(yōu)(圖8),這與該家系中目標基因在葉片等組織中的相對表達量最高一致(圖9), 顯示提高該目的基因的表達量有利于增強轉基因油菜的草甘膦抗性水平。這3個家系中, EPS-6和EPS-7的T-DNA都位于基因間區(qū), 理論上對插入位點附近的基因表達不會產生太大影響,是比較理想的轉化株系; 而EPS-2的T-DNA插入在BnaA05g21420D基因的 3′末端, 可能會影響該基因表達, 還需要后續(xù)的試驗進行驗證。在T3代, 進一步對這3個單拷貝家系和2個雙拷貝插入的轉基因家系(EPS-1和 EPS-5)進行了 0～4倍田間推薦使用劑量的草甘膦噴施處理, 表明它們都具有很好的抗性。因此,I.variabilis EPSPS基因有望作為一個新型的草甘膦抗性基因應用到油菜抗除草劑品種培育中。

4 結論

將來自放線菌屬變異白蟻菌中的新型抗除草劑基因I.variabilis EPSPS通過農桿菌介導的遺傳轉化法導入甘藍型油菜中, 獲得了 126株轉基因陽性單株。通過對外源插入片段的拷貝數(shù)、整合穩(wěn)定性、表達穩(wěn)定性和目標除草劑抗性的穩(wěn)定性等特性的分析, 篩選出優(yōu)異的新型抗廣譜性除草劑草甘膦轉基因株系, 將為我國抗除草劑轉基因油菜品種培育提供優(yōu)異的種質資源。