吳冰卉 王桂萍 王玉斌 李召虎 張明才

植物生長調(diào)節(jié)劑教育部工程研究中心 / 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 北京100193

玉米是重要的糧飼作物和工業(yè)原料, 目前已位列我國三大糧食作物的首位, 因此玉米豐產(chǎn)高效栽培對我國糧食安全具有重要的現(xiàn)實意義[1]。氮素在玉米生長發(fā)育中作用十分重要, 大量研究表明, 氮肥運(yùn)籌可以提高玉米的產(chǎn)量和氮肥利用率[2-4]。因此,研究玉米高效利用氮肥機(jī)制, 提高氮素的利用效率具有重要意義。玉米中氮素的利用效率受玉米生長發(fā)育過程中氮素的吸收、同化和再分配過程等的控制, 是許多生理生化反應(yīng)過程相互作用的結(jié)果[5-6]。不同基因型玉米品種的氮素吸收與轉(zhuǎn)移效率上存在著較大差異, 其中綠熟品種的氮素轉(zhuǎn)移效率較低,氮素利用效率較低[7-8]。乙烯作為一種常見的植物激素, 在植物生長發(fā)育及應(yīng)對脅迫防御反應(yīng)中起重要調(diào)控作用, 且在植物吸收氮素過程中也發(fā)揮重要作用[9]。在玉米生產(chǎn)中, 乙烯可調(diào)控玉米根系建成與株型, 有效解決了由高密、不合理氮肥施用以及品種特性等導(dǎo)致群體質(zhì)量下降引起倒伏、產(chǎn)量降低等問題[10-11]。植株響應(yīng)不同氮素水平供給過程中乙烯信號也受到了調(diào)節(jié)[9]。研究表明, 外源添加ACC抑制了油菜根系伸長與氮素吸收, 且在油菜生長后期可調(diào)控植株氮素再利用能力[12-14]。在氮素充足的條件下, 乙烯利可以提高芥菜的氮素利用效率[15]。此外,乙烯利處理降低了夏玉米氮素吸收量和氮素吸收效率, 但提高了氮素利用效率和氮農(nóng)學(xué)效率, 并且乙烯利與氮肥在氮吸收量、氮吸收效率和氮農(nóng)學(xué)效率上有顯著的互作效應(yīng)[16]。但是, 玉米植株響應(yīng)氮素供給過程中, 乙烯調(diào)控植株生長與氮素吸收機(jī)制缺乏研究?；谟衩自谟酌缙趯Νh(huán)境脅迫反應(yīng)敏感[17],本研究通過比較研究不同氮素水平下不同基因型玉米幼苗間氮素積累差異, 分析乙烯信號表達(dá)與氮素吸收的關(guān)系, 結(jié)合外源添加乙烯合成前體 1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid,ACC), 分析乙烯對不同基因型玉米氮素吸收的調(diào)控效應(yīng)。研究結(jié)果將揭示乙烯對玉米氮素吸收的調(diào)控機(jī)制, 為乙烯在玉米生產(chǎn)中氮素高效利用中應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選用鄭單958、瑞福爾1號和德美亞3號3個玉米品種作為試驗材料。RNA快速提取試劑盒購買于艾德萊生物科技有限公司; 反轉(zhuǎn)錄使用TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒; 熒光定量染料為 TaKaRa公司TB Green Reagerts。試驗中使用的其他試劑是進(jìn)口或國產(chǎn)的分析純試劑。

1.2 試驗設(shè)計

試驗在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)光照培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行, 采用液體培養(yǎng)法。挑選大小均勻一致的玉米種子, 在室溫下用10%過氧化氫滅菌20 min, 用去離子水沖洗5遍后均勻播種在干凈濕潤的石英沙中。當(dāng)玉米幼苗長至一葉一心時, 挑選長勢一致的幼苗, 去掉胚乳后轉(zhuǎn)移至半營養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。營養(yǎng)液采用改良的 Hoagland營養(yǎng)液。以 KNO3為氮源, 氮素水平設(shè)置低氮0.05 mmol L-1NO3-(low nitrogen level, LN)和正常氮2 mmol L-1NO3-(sufficient nitrogen level,SN)處理。在移苗2 d后進(jìn)行ACC處理。ACC處理的濃度為1 μmol L-1, 氮素處理的同時添加ACC。完全隨機(jī)排列, 每個處理4個重復(fù)。營養(yǎng)液每2 d更換一次, 培養(yǎng)溫度為 28℃/22℃, 光照時間為 16 h, 濕度控制在大約70%～80%。

1.3 測定內(nèi)容與方法

1.3.1 干物質(zhì)積累量 在氮素處理以及 ACC處理后的第 7天, 在處理的每個組合中隨機(jī)挑選 8株幼苗, 用去離子水洗凈表面雜質(zhì)以及殘留的營養(yǎng)液后吸干表面水分, 用剪刀將單株分為地上部和地下部。地上地下部分別裝入牛皮紙袋中, 放入105℃烘箱殺青20 min, 之后放入65℃烘箱烘干至恒重, 稱量記干重(g)。

1.3.2 全氮含量 將 1.3.1中烘干稱重完畢的樣品研磨粉碎過45目篩。樣品按照凱氏定氮法進(jìn)行全氮測定, 具體方法參考Bremner和Mulvaney[18]。樣品全氮含量(mg) = 樣品氮濃度(mg g-1)×樣品干重(g)。

1.3.3 葉綠素含量 取氮素處理 5 d后的葉片,剪碎后混勻, 用天平準(zhǔn)確稱取 0.2 g后放入液氮中,然后用提前預(yù)冷的 95%乙醇研磨, 用濾紙過濾到50 mL離心管, 定容至25 mL。取過濾后的溶液用紫外/可見光分光光度計雙波長(665 nm和 649 nm)測量模式進(jìn)行測定。根據(jù)測量的吸光值計算葉綠素a和葉綠素b的濃度。Ca= 13.95A665-6.88A649;Cb=24.96A649-7.32A665;CT=Ca+Cb。

1.3.4 可溶性蛋白含量 取玉米幼苗氮素處理3 d后的新葉和胚根, 用去離子水沖洗后用吸水紙擦干, 用剪刀剪碎, 每個樣品取0.2 g, 每個處理取3個重復(fù)。采用考馬斯亮藍(lán)G-250法進(jìn)行可溶性蛋白測量。

1.3.5 乙烯釋放速率 在ACC處理6 d后對玉米幼苗進(jìn)行取樣, 分別取不同處理下的玉米幼苗地上部和地下部分, 立即將其放入 8 mL青霉素小瓶中,然后在小瓶中放入去離子水浸泡過的濾紙保持濕潤,蓋上蓋子并用封口膜封住, 密閉室溫黑暗下放置2 h。然后取已抽真空的12 mL真空集氣瓶, 用排水法將青霉素小瓶中氣體全部收集。取出樣品并稱取鮮重。用Shimadzu GC-2010氣相色譜儀測定乙烯含量。乙烯釋放速率(nmol h-1g-1FW) =A×a×V÷T÷M, 其中,A為乙烯峰面積;a為乙烯標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率, 值為0.0236 nmol mL-1;V為容器體積(mL);T為密閉孵育時間(h);M為樣品鮮重(g)。

1.3.6 基因表達(dá)量測定 取玉米幼苗氮素與ACC處理 12 h后的根尖, 將樣品立即置于液氮中,后保存在-80℃冰箱中。采用艾德萊生物科技有限公司植物RNA快速提取試劑盒進(jìn)行玉米總RNA的提取, 置于-80℃冰箱中保存。采用TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物稀釋10倍作為模板 cDNA。使用 TaKaRa公司 TB Green Reagerts熒光染料, 采用ABI-7500 fast PCR儀進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。以ZmUbiquitin為內(nèi)參, 測定相關(guān)基因的表達(dá)量(表1)。反應(yīng)體系為15 μL, 含TB Green 7.5 μL, 正向和反向引物各 0.3 μL, ddH2O 5.1 μL, ROX Reference Dye II 0.3 μL, cDNA模板 1.5 μL。采用兩步法PCR反應(yīng)程序。根據(jù)樣品的特定熒光閾值下的 Ct值, 利用 2-ΔΔCt計算方法計算得到不同樣品的基因相對表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

1.4 統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與圖表制作, 處理后的數(shù)據(jù)采用R x64 3.6.2進(jìn)行統(tǒng)計分析,圖中不同小寫字母表示不同品種不同處理間差異達(dá)到顯著性水平(P≤ 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ACC處理對不同基因型玉米植株干物質(zhì)積累和根冠比的調(diào)控

LN處理抑制不同基因型玉米植株地下部和地上部干物質(zhì)的積累(圖1-A, B), 但鄭單 958無論在LN或SN條件下植株地上部和地下部生物量均高于德美亞3號和瑞福爾1號。而且, ACC處理抑制LN和 SN培養(yǎng)條件下不同基因型玉米植株地上與地下部干物質(zhì)積累。此外, 與SN比較, LN處理顯著增加了不同基因型玉米植株根冠比(圖1-C)。ACC處理均提高了LN或SN條件下不同基因型玉米植株根冠比。

2.2 ACC處理對不同基因型玉米植株氮素積累的調(diào)控

LN處理顯著降低不同基因型玉米植株地上和地下部氮素的積累, 而且德美亞 3號和瑞福爾 1號植株在LN和SN條件下的氮素積累量均顯著低于鄭單958 (圖2)。ACC處理顯著降低了LN和SN條件下不同基因型植株地上和地下部的氮素積累。

2.3 ACC處理對不同基因型玉米葉片可溶性蛋白和葉綠素含量的調(diào)控

與SN比較, LN處理顯著降低了不同基因型玉米植株葉片可溶性蛋白和葉綠素含量(圖3), 其中鄭單 958葉片中可溶性蛋白和葉綠素含量均顯著高于其他2個品種, 而且德美亞3號在LN條件下葉片葉綠素含量下降最大, 表明其比其他2個品種對氮素更為敏感。在SN條件下, ACC處理顯著促進(jìn)了各基因型葉片可溶性蛋白和葉綠素積累。與其相反, 在LN條件下, ACC處理顯著降低了各基因型葉片可溶性蛋白和葉綠素積累, 其中福爾 1號和德美亞 3號葉片可溶性蛋白和葉綠素含量降低幅度大于鄭單958。

2.4 ACC對不同基因型玉米植株乙烯釋放速率調(diào)控

與SN比較, LN處理顯著降低了不同基因型玉米植株葉片乙烯釋放量速率(圖4)。ACC處理顯著促進(jìn)LN和SN條件下不同基因型植株葉片乙烯釋速率,并且德美亞3號和瑞福爾1號植株受ACC處理調(diào)控影響較大。

2.5 ACC對不同基因型玉米植株乙烯合成限速酶表達(dá)的調(diào)控

與SN比較, LN處理顯著抑制不同基因型玉米植株根系中ZmACO15與ZmACS7的表達(dá)(圖5)。同時, 在LN條件下, ACC處理促進(jìn)了不同基因型玉米植株根系中ZmACO15與ZmACS7的表達(dá), 相反, 在SN條件下, ACC處理抑制不同基因型玉米根中ZmACO15與ZmACS7的表達(dá)。另外, 在 LN或 SN條件下, 瑞福爾1號和德美亞3號與鄭單958相比,根中ZmACO15與ZmACS7的表達(dá)較低。

2.6 ACC對不同基因型玉米植株硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的調(diào)控

LN處理顯著影響硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá), 其中LN處理顯著誘導(dǎo)ZmNRT2.1在不同基因型玉米根中的表達(dá), 但對ZmNRT1.1a表達(dá)影響較小(圖6)。與鄭單 958相比, 瑞福爾 1號和德美亞 3號根中ZmNRT2.1的表達(dá)受硝酸鹽誘導(dǎo)較小。在 LN條件下, ACC促進(jìn)不同基因型玉米根中ZmNRT2.1的表達(dá), 相反, 在 SN條件下, ACC抑制其根中ZmNRT2.1的表達(dá)。與ZmNRT2.1不同, 硝酸鹽與ACC處理對ZmNRT1.1a在不同基因型玉米根中的表達(dá)影響較小。

3 討論

3.1 ACC對不同基因型玉米幼苗響應(yīng)氮素供給過程中形態(tài)建成的調(diào)控

3個玉米品種在LN條件下第7天地上部和地下部干重明顯降低, 但根冠比增加。前人研究表明, 玉米植株響應(yīng)氮脅迫的典型反應(yīng)是通過增加根部表面積和減少地上部的生長方式來提高同化物從地上部到地下部的轉(zhuǎn)運(yùn), 從而顯著增加根冠比[19]。ACC處理顯著降低 3個品種地上部和地下部的干重, 乙烯可以降低玉米株高, 這與表型是相符合的。與鄭單958相比, ACC處理7 d后, 瑞福爾1號和德美亞3號在 LN條件下葉片先出現(xiàn)黃化早衰表型。這一結(jié)果表明鄭單958較瑞福爾1號和德美亞3號耐低氮脅迫, 瑞福爾1號和德美亞3號在LN條件下對乙烯更敏感。

3.2 乙烯對不同基因型玉米品種響應(yīng)低氮脅迫過程中氮素積累與生理生化指標(biāo)調(diào)控

外源添加ACC處理會顯著提高3個玉米品種在LN和SN下的葉片乙烯釋放量, 乙烯可以加速葉片衰老, 這與表型也是相一致的。葉綠素降解和蛋白質(zhì)含量的降低是植物衰老的典型特征。LN處理會顯著降低玉米幼苗地上部和地下部的氮素積累量、葉片葉綠素含量和可溶性蛋白含量。葉綠素的合成與氮的再利用和氮的同化相關(guān), 而且處在營養(yǎng)生長階段的植物, 在氮脅迫的條件下會將營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物由老葉向新葉轉(zhuǎn)移[20-21], 因此老葉葉片中的葉綠素含量在 LN條件下會降低。與瑞福爾1號和德美亞3號相比, 鄭單958在LN條件下, 葉片葉綠素含量較高, 耐低氮脅迫, 這與表型相一致。外源添加ACC處理通過降低 LN下葉片葉綠素含量, 加速玉米葉片的衰老。但是在SN條件下添加ACC處理提高葉片中葉綠素含量, ACC處理抑制玉米生長, 提高單位葉面積內(nèi)葉綠素的含量。通過測定葉片可溶性蛋白含量發(fā)現(xiàn), LN處理顯著降低3個品種葉片可溶性蛋白的含量, 植物通過大量減少體內(nèi)最豐富的蛋白質(zhì)來減少氮的消耗[20]。在LN條件下, 鄭單958葉片可溶性蛋白含量顯著高于瑞福爾1號和德美亞3號, 這與鄭單958較其他2個品種耐低氮的表型相一致。外源添加ACC處理通過降低葉片中可溶性蛋白含量加快玉米葉片的衰老。ACC處理顯著升高3個品種地上部氮濃度, 但會降低地上部和地下部的全氮含量, 氮濃度升高但含量降低, 這與ACC處理顯著降低植株干重有關(guān)。

3.3 乙烯對不同基因型玉米品種響應(yīng)氮素脅迫過程乙烯合成關(guān)鍵基因及硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)調(diào)控

高等植物中存在 2種硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng), 即高親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(high affinity transport system, HATS)和低親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(low affinity transport system,LATS)[22-23]。NRT2.1是 NRT2家族中負(fù)責(zé)高親和硝酸鹽吸收最重要的轉(zhuǎn)運(yùn)體, 在大多數(shù)情況下發(fā)揮吸收NO3-的功能。AtNRT2.1缺失突變體atnrt2.1中, 高親和硝酸鹽吸收活性顯著降低[24]。小麥TaNRT2.1和黃瓜CrNRT2.1同樣具有硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)功能[25-26]。ZmNRT2.1與玉米表皮吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)高親和力硝酸鹽這一過程有關(guān)[27]。乙烯通過調(diào)控AtNRT1.1或AtNRT2.1的表達(dá)影響根系發(fā)育與氮素吸收, 如乙烯信號突變體etr1-3和ein2-1中AtNRT1和AtNRT2.1的表達(dá)對氮素敏感性降低, 且乙烯負(fù)調(diào)控AtNRT2.1的表達(dá), 減少高親和 NO3-吸收[28-29]。ACO 和 ACS作為乙烯合成過程中的關(guān)鍵限速酶, 其基因表達(dá)量影響著植物產(chǎn)生乙烯水平。乙烯的合成主要由ACS調(diào)控, 同時ACO對乙烯的合成也起著調(diào)控作用, 乙烯處理導(dǎo)致乙烯合成增加[30]。前人研究發(fā)現(xiàn)植物在遇到環(huán)境脅迫時會下調(diào)或上調(diào) ACS基因的表達(dá)[31],當(dāng)在一些植物中添加乙烯合成前體 ACC, 也可以觀察到乙烯的產(chǎn)生明顯增加[32]。我們研究發(fā)現(xiàn), LN處理顯著抑制 3個玉米品種根中ZmACS7和ZmACO15的表達(dá), 抑制根系乙烯的釋放, 外源添加ACC處理促進(jìn)LN條件下3個品種根中ZmACS7和ZmACO15的表達(dá), 促進(jìn)乙烯的釋放。因此我們推測, ACC處理是否也可以通過調(diào)控玉米硝酸鹽ZmNRT2.1和ZmNRT1.1的表達(dá)影響根系氮素吸收？通過測定玉米硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn),LN處理顯著抑制3個玉米品種根中ZmNRT2.1的表達(dá), 鄭單958根中ZmNRT2.1表達(dá)顯著高于瑞福爾1號和德美亞3號, 這一結(jié)果與低氮下鄭單958較瑞福爾 1號和德美亞 3號耐低氮脅迫表型相一致。ACC處理促進(jìn)LN下3個品種根中ZmNRT2.1的表達(dá), 而且, 與瑞福爾 1號和德美亞 3號相比,ACC處理對LN條件下鄭單958根中ZmNRT2.1誘導(dǎo)較高, 這一結(jié)果與外源添加ACC促進(jìn)LN下瑞福爾1號和德美亞3號葉片早衰結(jié)果相一致。在LN下, 乙烯可能通過反饋調(diào)節(jié)ZmNRT2.1的表達(dá), 促進(jìn)根系硝酸鹽的吸收, 延緩玉米葉片的衰老。與NRT2.1不同,NRT1.1在擬南芥中為雙親和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。玉米中與AtNRT1.1同源的基因有 4個,ZmNRT1.1a具有吸收硝酸鹽功能, 且表達(dá)不受硝酸鹽的調(diào)控[28]。我們研究發(fā)現(xiàn), 硝酸鹽與 ACC處理對ZmNRT1.1a在 3個品種玉米根中的表達(dá)影響較小。以上結(jié)果表明, LN處理可能通過抑制乙烯合成,乙烯通過調(diào)控ZmNRT2.1表達(dá)影響不同基因型玉米品種響應(yīng)氮素過程中葉片的衰老。

4 結(jié)論

在LN條件下, 與鄭單958相比, 瑞福爾1號和德美亞 3號對氮素脅迫反應(yīng)更迅速, 早衰表型更明顯。外源添加ACC處理通過降低LN條件下葉片全氮含量、葉綠素含量以及可溶性蛋白含量加快瑞福爾1號和德美亞3號早衰表型。LN處理顯著抑制玉米根系乙烯合成關(guān)鍵酶ZmACS7和ZmACO15表達(dá),降低乙烯含量, 外源添加 ACC處理促進(jìn) LN下ZmACS7和ZmACO15表達(dá), 促進(jìn)乙烯合成。乙烯參與調(diào)控ZmNRT2.1的表達(dá)影響氮素吸收, LN條件下,鄭單958根系中ZmNRT2.1的表達(dá)量顯著高于瑞福爾1號和德美亞3號, 從而促進(jìn)氮素吸收, 延緩葉片衰老。LN條件下, ACC處理加速玉米葉片的衰老并調(diào)節(jié)了乙烯合成, 進(jìn)而調(diào)控ZmNRT2.1的表達(dá)調(diào)控氮素吸收。