葛 敏 王元琮 寧麗華 胡夢(mèng)梅 石 習(xí) 趙 涵

江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究所 / 江蘇省農(nóng)業(yè)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇南京 210014

氮素(nitrogen, N)是植物生長(zhǎng)發(fā)育需求量最大的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素, 也是促進(jìn)作物增產(chǎn)的最關(guān)鍵因素之一[1-2]。玉米是我國(guó)重要的糧食、飼料和生物能源作物, 對(duì)我國(guó)的糧食安全具有舉足輕重的戰(zhàn)略作用。玉米的產(chǎn)量對(duì)氮肥施用量依賴度極高, 農(nóng)戶往往通過大量施加氮肥以保障玉米產(chǎn)量[3]。然而, 氮肥過度施加, 不僅增加生產(chǎn)成本, 造成資源浪費(fèi), 還引發(fā)水體富營(yíng)養(yǎng)化和土壤酸化等環(huán)境問題[4]。因此,為了農(nóng)業(yè)的綠色發(fā)展, 研究玉米氮素高效利用機(jī)制并挖掘其中重要的調(diào)控基因, 具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)現(xiàn)實(shí)意義, 有助于在保障作物高產(chǎn)的同時(shí)降低肥料的施用[5]。

玉米主要通過根部吸取土壤中以硝態(tài)氮(NO3-)為主的氮素, NO3-也可作為信號(hào)分子協(xié)同調(diào)控植物氮代謝途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá), 影響植株氮響應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育過程[6-7]。NO3-進(jìn)入根部細(xì)胞后由硝酸還原酶(nitrate reductase, NR)轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽(NO2-), 再由亞硝酸還原酶(nitrite reductase, NIR)將NO2-快速轉(zhuǎn)化成銨態(tài)氮(NH4+)。NH4+結(jié)合谷氨酸通過GS/GOGAT循環(huán)同化形成谷氨酰胺, 谷氨酰胺作為活躍的氨基供體參與到氮素的多種代謝過程[8]。

應(yīng)對(duì)不同氮素環(huán)境, 植物擁有多層感應(yīng)和適應(yīng)機(jī)制以響應(yīng)氮營(yíng)養(yǎng)元素的利用, 上述適應(yīng)性的反應(yīng)即為 “氮響應(yīng)”, 其包括植物形態(tài)和生理上的反應(yīng)。例如: 低氮環(huán)境下, 植株主根伸長(zhǎng)生長(zhǎng), 以促進(jìn)植株尋找更多氮源; 高氮環(huán)境下, 植株激發(fā)側(cè)根組織的萌發(fā)[9-10]。玉米根尖過渡區(qū)(root apex transition zone)的轉(zhuǎn)錄組和蛋白組學(xué)分析數(shù)據(jù)顯示, 氮響應(yīng)與植物激素的生物合成和信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān), 并表明玉米氮響應(yīng)的過程中伴隨著細(xì)胞骨架活化和細(xì)胞壁修飾[11]。

調(diào)控氮響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥中已有報(bào)道,例如 CCA1、LBD37/38/39、NLP7等[12-14], 上述轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控氮吸收和同化過程中的關(guān)鍵基因的表達(dá)來調(diào)控氮代謝過程。近期, Ge等[15]發(fā)現(xiàn)編碼玉米氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子 ZmNLP5基因, 該基因Mu插入突變體(zmnlp5)相對(duì)野生型植株(WT)氮響應(yīng)程度顯著下降, 同化產(chǎn)物的積累也顯著降低。并且ZmNLP5轉(zhuǎn)錄因子直接與亞硝酸還原酶基因(ZmNIR1.1)的啟動(dòng)子區(qū)域氮響應(yīng)元件(NRE)[16]結(jié)合并激活ZmNIR1.1的表達(dá)[17]。據(jù)研究報(bào)道, 亞硝酸鹽(NO2-)對(duì)根尖快速生長(zhǎng)的細(xì)胞具有細(xì)胞毒性[18], ZmNIR1.1是將 NO2-轉(zhuǎn)化為NH4+的關(guān)鍵酶。ZmNLP5轉(zhuǎn)錄因子是否參與調(diào)控玉米根部響應(yīng)不同氮素環(huán)境下的形態(tài)反應(yīng), 進(jìn)而影響地上部分氮素同化積累尚未明確, 鑒于此,本研究選取ZmNLP5基因的突變體和野生型為研究材料, 探究氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子 ZmNLP5對(duì)玉米根系生長(zhǎng)的影響及其生理機(jī)制, 為玉米氮高效育種有效利用ZmNLP5基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與處理方法

ZmNLP5基因突變體材料zmnlp5(編號(hào)為UFMu-01175, http://www.maizegdb.org/uniformmu)和野生型材料玉米自交系W22由美國(guó)玉米遺傳資源聯(lián)合存儲(chǔ)中心-UniformMu轉(zhuǎn)座子資源庫(Maize Genetics Cooperation Stock Center UniformMu Transposon Resource)提供。

足氮(sufficient N, SN)和低氮(deficient N, DN)營(yíng)養(yǎng)液處理: 將zmnlp5突變體和野生型材料水培培養(yǎng)于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院設(shè)施大棚(江蘇南京)。根據(jù)Schlüter等[19]研究結(jié)果設(shè)置SN和DN兩種氮素濃度處理, 其中基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)液為改良Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(5 mmol L-1CaCl2, 2 mmol L-1MgSO4, 0.05 mmol L-1EDTA-Fe-Na Salt, 0.5 mmol L-1KH2PO4, 50 μmol L-1H3BO4, 10 μmol L-1MnCl2, 1 μmol L-1ZnSO4,0.3 μmol L-1CuSO4, 0.5 μmol L-1Na2MoO4), SN和DN營(yíng)養(yǎng)液是分別在基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)液中分別添加15 mmol L-1和0.15 mmol L-1KNO3(KCl補(bǔ)齊鉀離子濃度), 營(yíng)養(yǎng)液2 d更換1次, 常規(guī)管理。

不同濃度亞硝酸鹽處理: 利用低氮營(yíng)養(yǎng)液對(duì)zmnlp5突變體和野生型材料水培培養(yǎng)7 d, 然后分別用含有0、0.5、1、2和5 mmol L-1KNO2的低氮營(yíng)養(yǎng)液對(duì)上述材料處理7 d, 培養(yǎng)條件與足氮和低氮營(yíng)養(yǎng)液處理相同。

1.2 基因mRNA表達(dá)量分析

將野生型材料于足氮營(yíng)養(yǎng)液水培培養(yǎng)21 d后,對(duì)其根部組織進(jìn)行分段取樣: 根尖區(qū)域(根尖0～4 cm)、中部區(qū)域(4～10 cm)和上部區(qū)域(余下部分)。樣品液氮研碎后利用RNA Isolation System (Promega)試劑盒提取總RNA, 利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script RT Reagent Kit (TaKaRa)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以得到的cDNA為模板, 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(qPCR)對(duì)ZmNLP5基因在玉米根部不同部位中的mRNA表達(dá)量進(jìn)行分析。玉米持家基因ZmUPF1(GRMZM2G 163444)為內(nèi)參基因[20], 每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3 蛋白含量檢測(cè)

利用蛋白質(zhì)免疫印記技術(shù)(Western blot, WB),對(duì)野生型材料根部根尖區(qū)域、中部區(qū)域和上部區(qū)域組織中ZmNLP5蛋白含量進(jìn)行檢測(cè)。樣品液氮研碎后利用Plant Nuclei Isolation/Extraction Kit (Sigma)試劑盒提取總蛋白, 蛋白濃度利用BCA Protein Assay Kit (Beyotime)試劑盒進(jìn)行定量分析。以野生型根部不同區(qū)域總蛋白為樣品, 利用SDS-PAGE對(duì)總蛋白進(jìn)行分離, 分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(0.2 μm,Millipore, USA)。然后對(duì)附著分離蛋白的PVDF膜進(jìn)行封閉, 及初級(jí)抗體和次級(jí)抗體的孵育。最后利用BeyoECL Plus (Beyotime)對(duì)化學(xué)發(fā)光進(jìn)行檢測(cè)。ZmNLP5特異性的抗體(上海英基生物科技有限公司ABclonal technology制備, 兔源為實(shí)驗(yàn)級(jí)日本大耳白兔)的稀釋比例為1∶1000, 標(biāo)簽抗體UDPGP(Agrisera)的稀釋比例為1∶2000, 次級(jí)抗體(羊抗兔)的稀釋比例為1∶3000。

1.4 亞硝酸鹽含量測(cè)定

將研究材料不同組織部位的樣品進(jìn)行取樣后,利用亞硝酸鹽測(cè)定試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)對(duì)樣品中的亞硝酸含量進(jìn)行檢測(cè), 每個(gè)樣品 3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 足氮和低氮環(huán)境下zmnlp5突變體根長(zhǎng)分析

為了探究氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子ZmNLP5在不同氮素環(huán)境下對(duì)玉米根長(zhǎng)的影響, 我們對(duì)足氮(SN)和低氮(DN)水培營(yíng)養(yǎng)液中生長(zhǎng)21 d的野生型(WT)和ZmNLP5基因突變體(zmnlp5)幼苗的根長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示, SN條件下, WT和zmnlp5突變體材料的根長(zhǎng)分別為(142.333±2.517) mm和(145.000±3.606) mm(圖1-A, B), 經(jīng)單因素方差分析SN條件下WT和zmnlp5材料根長(zhǎng)沒有顯著差異。然而, 低氮條件下zmnlp5植株根長(zhǎng)顯著短于野生型材料[zmnlp5為(166.667±8.622) mm, WT為(218.333±7.095) mm,P≤0.01, 圖1-A, B], 降低了23.66%。以上結(jié)果表明,低氮環(huán)境下,zmnlp5突變體植株響應(yīng)低氮環(huán)境根部伸長(zhǎng)生長(zhǎng)受到抑制。氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子ZmNLP5對(duì)玉米根部的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)有影響。

2.2 ZmNLP5在玉米根部不同區(qū)域的表達(dá)量分析

為了探究ZmNLP5在根部作用部位, 我們對(duì)野生型根部組織進(jìn)行分段取樣, 分為上部區(qū)域(Upper)、中部區(qū)域(Middle)和根尖區(qū)域(Tip)。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(qPCR)和蛋白質(zhì)免疫印記技術(shù)(Western blot, WB)對(duì)ZmNLP5基因的mRNA表達(dá)量和蛋白含量進(jìn)行分析。結(jié)果表明:ZmNLP5基因mRNA在根尖區(qū)域積累量最高, 顯著高于根的中部和上部區(qū)域(P≤0.05, 圖2-A), ZmNLP5蛋白也主要在根尖區(qū)域檢測(cè)到, 根中部和上部區(qū)域未檢測(cè)到可見的ZmNLP5蛋白信號(hào)(圖2-B)。上述結(jié)果表明,ZmNLP5主要在根部組織的根尖區(qū)域表達(dá), 表達(dá)部位可能與該基因的功能相關(guān)。

2.3 不同濃度的亞硝酸鹽處理下zmnlp5突變體根長(zhǎng)變化分析

上述結(jié)果表明: ZmNLP5主要在根尖區(qū)域表達(dá),前期研究證明ZmNLP5能激活亞硝酸還原酶ZmNIR1.1基因的表達(dá)[17]。由于氮素同化過程中ZmNIR1.1是將亞硝酸鹽(NO2-)還原為銨鹽(NH4+)的關(guān)鍵酶, 并且亞硝酸鹽對(duì)根尖區(qū)域快速生長(zhǎng)的細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒性[18]。因此, 推測(cè)低氮環(huán)境下zmnlp5突變體根部伸長(zhǎng)生長(zhǎng)受到抑制可能是由于,zmnlp5突變體中ZmNLP5功能喪失導(dǎo)致ZmNIR1.1表達(dá)量降低, 根尖NO2-未能快速還原為銨鹽NH4+, 而積累在根尖區(qū)域。

為了驗(yàn)證這一假設(shè), 我們首先對(duì)不同亞硝酸鹽濃度(0、0.5、1、2和5 mmol L-1KNO2)處理下, 突變體和野生型植株根長(zhǎng)進(jìn)行分析。結(jié)果表明: 在亞硝酸鹽濃度達(dá)到2 mmol L-1之前, WT和zmnlp5之間的根長(zhǎng)沒有顯著差異; 但當(dāng)亞硝酸鹽的濃度高于2 mmol L-1時(shí),zmnlp5突變體植株根長(zhǎng)相對(duì)野生型材料顯著降低(P≤0.05, 圖3-A, B), 亞硝酸鹽的濃度為2 mmol L-1和5 mmol L-1時(shí), 根長(zhǎng)分別降低18.46%和18.48% (圖3-B)。上述結(jié)果說明當(dāng)亞硝酸鹽濃度達(dá)到一定程度時(shí), 對(duì)zmnlp5突變體的根部的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)將產(chǎn)生抑制作用。

2.4 不同濃度的亞硝酸鹽處理下zmnlp5突變體根尖區(qū)域亞硝酸鹽含量分析

為了研究zmnlp5突變體根部伸長(zhǎng)生長(zhǎng)受到抑制是否與根尖區(qū)域亞硝酸鹽積累相關(guān), 我們對(duì)不同亞硝酸鹽濃度(0、0.5、1、2和5 mmol L-1KNO2)處理下, 突變體和野生型植株根尖區(qū)域的亞硝酸鹽含量進(jìn)行了分析。結(jié)果表明, 當(dāng)亞硝酸鹽的濃度高于2 mmol L-1時(shí),zmnlp5突變體植株根尖比WT中積累更多的亞硝酸鹽(P≤0.01)。當(dāng)亞硝酸鹽的濃度為2 mmol L-1和5 mmol L-1時(shí), 相對(duì)野生型材料,zmnlp5突變體植株根尖亞硝酸鹽積累量分別增加52.30%和79.03% (圖4)。上述結(jié)果一定程度驗(yàn)證了我們的假設(shè), 亞硝酸鹽在zmnlp5突變體根尖區(qū)域積累,當(dāng)積累到達(dá)一定濃度對(duì)根尖細(xì)胞產(chǎn)生毒性, 根部的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)受到抑制。

2.5 2種氮環(huán)境下玉米根部不同區(qū)域亞硝酸鹽含量分析

為了進(jìn)一步研究不同的氮素環(huán)境下, 植株根長(zhǎng)和根尖亞硝酸鹽含量之間的關(guān)系, 我們對(duì)足氮(SN)和低氮(DN)條件下, 野生型(WT)和zmnlp5突變體材料根部不同區(qū)域的亞硝酸鹽含量進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明: SN條件下, 野生型和zmnlp5突變體材料根上部(Upper)和中部(Middle)區(qū)域亞硝酸鹽含量無顯著差異,zmnlp5突變體根尖區(qū)域(Tip)亞硝酸鹽含量顯著高于WT, 增加了9.24% (P≤0.05)。DN條件下,zmnlp5突變體材料根中部區(qū)域亞硝酸鹽含量顯著低于野生型材料(P≤0.05), 降低了 73.08%; 根尖區(qū)域亞硝酸鹽含量顯著高于野生型材料(P≤0.05), 增加了28.50%。上述結(jié)果說明, 2種氮環(huán)境下,zmnlp5突變體較野生型材料在植株根尖區(qū)域均積累了更多的亞硝酸鹽。

3 討論

氮素是作物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)元素, 研究作物氮素高效利用機(jī)制并挖掘利用其中重要的調(diào)控基因, 對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展具有重要意義。玉米作為三大糧食作物之一, 其產(chǎn)量的高低對(duì)氮肥的依賴性極高, 但氮肥過度施加, 又會(huì)引發(fā)資源浪費(fèi)和環(huán)境污染等一系列問題。因此, 如何提高玉米氮素利用效率已成為亟待解決的重要科學(xué)問題[21]。前期通過遺傳和生理生化分析發(fā)現(xiàn), 低氮環(huán)境下, 玉米氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子ZmNLP5對(duì)氮素的吸收利用具有促進(jìn)作用[17], 但調(diào)控機(jī)制仍未解明。根系是作物吸收營(yíng)養(yǎng)元素的主要器官, 也是最先感知外界氮素濃度變化的重要器官。不同氮素環(huán)境下, 為響應(yīng)氮營(yíng)養(yǎng)元素的利用, 植株根系形態(tài)也會(huì)發(fā)生適應(yīng)性的改變。例如, 根部伸長(zhǎng)生長(zhǎng)已被定義為植物適應(yīng)低氮環(huán)境的典型形態(tài)反應(yīng)[9]。

玉米根系吸收以硝態(tài)氮(NO3-)為主的氮素, 亞硝酸鹽是硝酸鹽還原成銨的中間產(chǎn)物。高濃度的亞硝酸鹽對(duì)植物細(xì)胞的生長(zhǎng)有不利影響, 尤其在快速生長(zhǎng)的細(xì)胞中, 例如細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)生長(zhǎng)活躍的根尖細(xì)胞中[18]。亞硝酸鹽還原為銨是由亞硝酸還原酶(NIR)催化的, 模式植物煙草中發(fā)現(xiàn)NIR活性降低導(dǎo)致高濃度的亞硝酸鹽積累并抑制植物生長(zhǎng)[22]。模式植物擬南芥中, 已證明根尖中亞硝酸鹽的過度積累會(huì)導(dǎo)致根部生長(zhǎng)發(fā)育受阻, 根長(zhǎng)變短[18]。本研究中,ZmNLP5優(yōu)先在根尖區(qū)域表達(dá)(圖2),zmnlp5突變體中由于ZmNLP5功能喪失導(dǎo)致其根部ZmNIR1.1表達(dá)量顯著降低[17]。根尖NO2-未能快速還原為NH4+,使得zmnlp5突變植物根尖處亞硝酸鹽積累量上調(diào)(圖5)。低氮條件下, 在zmnlp5突變體植株根尖處亞硝酸鹽過度積累與發(fā)育遲緩的根部生長(zhǎng)響應(yīng)同時(shí)出現(xiàn)。由于亞硝酸鹽對(duì)根尖快速生長(zhǎng)的細(xì)胞具有細(xì)胞毒性, 因此我們推測(cè)低氮條件下zmnlp5突變體的根部發(fā)育遲緩部分原因是由zmnlp5突變體根尖中亞硝酸鹽過量積累引起的。此外, 即使zmnlp5突變體植物在根尖累積了更多的亞硝酸鹽, 但在低氮條件下,它們?cè)诟恐胁康睦鄯e量卻比WT少。這可能是由于zmnlp5突變植株根部伸長(zhǎng)生長(zhǎng)受到抑制, 因此從縮短的根部中部區(qū)域獲取氮素的效率降低, 因?yàn)楦课蘸屯癄I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的關(guān)鍵區(qū)域?yàn)槌墒靺^(qū)[23]。由于根的中間區(qū)域主要由成熟細(xì)胞組成, 因此它們對(duì)亞硝酸鹽的細(xì)胞毒性較不敏感。因此, 即使根的中間區(qū)域在 WT中積累更多的亞硝酸鹽, 它對(duì)根生長(zhǎng)的抑制作用也比對(duì)根的快速分裂和伸長(zhǎng)的尖端區(qū)域要小得多。

綜上所述, 我們提出不同氮素環(huán)境下 ZmNLP5參與調(diào)控玉米根部生長(zhǎng)的工作模型。充足氮(SN)條件下, 由于環(huán)境中有充足的氮素可以利用, 植株不必啟動(dòng)根部的進(jìn)一步伸長(zhǎng)生長(zhǎng), 此外, 足氮環(huán)境下根尖高濃度的亞硝酸鹽積累對(duì)抑制根部的進(jìn)一步伸長(zhǎng)生長(zhǎng)也有貢獻(xiàn)。因此, SN條件下, WT和zmnlp5突變體之間根長(zhǎng)無顯著差異。低氮(DN)條件下, 根系伸長(zhǎng)生長(zhǎng)是植物響應(yīng)低氮環(huán)境的典型形態(tài)反應(yīng)[9],WT植物的根系伸長(zhǎng)生長(zhǎng)得到增強(qiáng), 部分原因可能是: 由于氮饑餓時(shí)植株同化產(chǎn)生的亞硝酸鹽較少,并且有限的亞硝酸鹽通過 ZmNIR1.1進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為銨鹽, 使得根尖亞硝酸鹽積累量降低、根系生長(zhǎng)抑制得到緩解。但是, 在zmnlp5突變植物中, ZmNLP5功能的喪失導(dǎo)致其根部ZmNIR1.1表達(dá)量顯著降低[17],使得根尖區(qū)域亞硝酸鹽積累上調(diào), 根尖區(qū)域相對(duì)較高的亞硝酸鹽含量對(duì)其根部伸長(zhǎng)生長(zhǎng)具有一定的抑制作用。所以zmnlp5突變體植株中, 根部響應(yīng)低氮環(huán)境伸長(zhǎng)生長(zhǎng)這一形態(tài)學(xué)反應(yīng)受到阻礙。

本研究發(fā)現(xiàn), 玉米氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子 ZmNLP5的功能缺失, 將導(dǎo)致低氮環(huán)境下玉米根部生長(zhǎng)受阻,亞硝酸鹽在根尖區(qū)域過量積累可以部分解釋這一表型現(xiàn)象, 同時(shí), ZmNLP5也可能通過調(diào)控植物激素生物合成途徑相關(guān)基因影響植株根部發(fā)育, 這還需要后期相關(guān)實(shí)驗(yàn)來證明。前期研究發(fā)現(xiàn)低氮環(huán)境zmnlp5突變體氮素同化產(chǎn)物積累量較 WT顯著降低[17], 可能是由于突變體根系生長(zhǎng)受阻導(dǎo)致氮素吸收減少并最終影響氮同化產(chǎn)物積累降低。然而, 過量表達(dá)ZmNLP5是否能提高植株對(duì)氮素的吸收和利用仍未知, 后期還需利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)手段對(duì)基因的功能進(jìn)行更為深入的解析, 以期獲得提高玉米氮素利用率的候選基因。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)玉米氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子ZmNLP5主要在細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)活躍的根尖區(qū)域表達(dá)。亞硝酸鹽在根尖過量積累, 對(duì)玉米根部生長(zhǎng)具有不利影響。低氮條件下ZmNLP5功能缺失對(duì)植株響應(yīng)低氮環(huán)境根部伸長(zhǎng)生長(zhǎng)有影響, 這也最終會(huì)影響植株對(duì)氮素的吸收和同化利用能力。