馬歡歡 方啟迪 丁元昊 池華斌 張獻龍 閔 玲

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 / 作物遺傳改良國家重點實驗室, 湖北武漢 430070

在1991年, Coen和Meyerowitz[1]根據(jù)擬南芥的花發(fā)育機制提出了經(jīng)典的 ABC模型, 后又衍生到ABCDE模型[2]。在ABC模型中, Coen將擬南芥的花器官從外至內(nèi)分成萼片(Sepal)、花瓣(Petal)、雄蕊(Stamen)和心皮(Carpal) 4輪, 其中A類基因單獨調(diào)控第1輪(萼片)的發(fā)育; A+B共同參與第2輪(花瓣)的發(fā)育; 第3輪(雄蕊)的發(fā)育由B+C共同調(diào)控; 而C類基因單獨參與第4輪(心皮)的發(fā)育。而A類基因與C類基因具有相互拮抗的作用[3]。當(dāng)突變AP1基因時, C類基因沒有出現(xiàn)異位表達, 但當(dāng)AP2基因突變或缺失時, C類基因功能便會從第3、4輪延伸到第1、2輪花器官, 因此說明A、C類基因相互拮抗主要是通過AP2來實現(xiàn)的[3]。相較于經(jīng)典的ABC模型, 四因子模型似乎為更多研究者所認同。四因子模型就是將花器官發(fā)育的4輪分別用4個基因編碼的蛋白所組成的四聚體表示, 第1輪的萼片發(fā)育由2個SEP蛋白和2個AP1蛋白所組成的四聚體表示;花瓣則由1個AP1蛋白和1個SEP蛋白以及2個B類基因 PI和 AP3的蛋白來表示; 第 3輪的雄蕊由AP3、PI、AG、SEP 4種蛋白的四聚體來表示; 心皮則由2個AG蛋白和2個SEP蛋白來表示。SEP蛋白是ABCDE模型中涉及所有花器官發(fā)育的E類基因的蛋白, 而其他蛋白則是由每一輪所對應(yīng)的調(diào)控基因的蛋白組成。雖然四因子蛋白模型能更適用于所有物種, 但經(jīng)典的ABC模型仍然是人們研究植物花器官發(fā)育的重要參考依據(jù)。

MADS-box基因是在植物花器官發(fā)育和信號傳導(dǎo)中起著重要作用的一類轉(zhuǎn)錄因子, 其廣泛存在于動植物以及真菌中。依據(jù)種類劃分, 研究者將MADS-box基因分成 I型和 II型兩大類[3]。其中MADS-box I型基因就是ARG80/SRF類群, 這類基因主要存在于動物和真菌中, 植物中也有少量此類群基因; 另外MADS-box II型基因主要是植物中的MIKC和動物、酵母中的MEF2。也就是說植物中的MADS-box基因絕大部分是屬于MADS-box II型基因類群[4]。I型MADS-box通常只含有一個高度保守的MADS (M)結(jié)構(gòu)域而沒有其他結(jié)構(gòu), 并且I型一般只有 1～2個外顯子來編碼 MADS結(jié)構(gòu)域[5], 所以 I型MADS-box基因又稱為M型MADS。I型基因又可進一步分為 Mα、Mβ、Mγ、Mδ這4個亞族。相較于I型MADS-box基因, II型基因一般含有7個外顯子和6個內(nèi)含子[6], 編碼較復(fù)雜的結(jié)構(gòu)域。除了有典型的結(jié)構(gòu)域之外, 還有 Intervening (I)區(qū)、Keratin-like (K)區(qū)和 C-terminal (C)區(qū), 因此 II型MADS-box基因也稱為MIKC型MADS-box基因[7]。而根據(jù) I區(qū)的序列的不同, 植物中的 II型基因又可分為MIKC*和MIKCC2種類型[8]。

AG(AGAMOUS)基因是MIKCC型MADS-box基因[8],AG基因主要參與調(diào)控雄蕊和雌蕊的發(fā)育、控制花分生組織終止、調(diào)控胚珠發(fā)育和抑制 A類基因[2,9-11]。在櫻花中,AG基因功能的喪失會形成重瓣的花型, 推測極有可能影響了AG基因的原位表達[12]。梅花的AG突變體則會引起花瓣顏色的改變而不改變花型[13]。OsMADS3是水稻AG基因的同源基因,由于其異位表達導(dǎo)致漿片被同源轉(zhuǎn)化成雄蕊[14]; 番茄AG基因TAG1, 其反義RNA的轉(zhuǎn)基因植物出現(xiàn)雄蕊變成花瓣的現(xiàn)象, 有義RNA的轉(zhuǎn)基因植物中觀察到互補表型, 即第 1輪萼片被轉(zhuǎn)化為成熟的果皮葉,而雄蕊代替了第2輪花瓣[15]。因此, 在植物中C類的AG基因通常參與雄蕊和心皮的發(fā)育, 但也會影響花器官形態(tài)和果實發(fā)育。

棉花作為我國重要的經(jīng)濟作物, 除了作為重要的天然紡織材料外, 也是我國國民經(jīng)濟的重要組成部分。在棉花生長過程中, 棉花花器官的發(fā)育直接影響著棉花的產(chǎn)量和纖維品質(zhì)。因此, 本研究選取MADS-box基因家族中對花器官的發(fā)育具有調(diào)控作用的 AG亞族基因進行探究。首先通過同源序列比對獲得了棉花中與擬南芥AG具有較高同源性的GhMADS7基因。通過棉花遺傳轉(zhuǎn)化, 獲得了GhMADS7的轉(zhuǎn)基因干涉材料, 在干涉材料中棉花花瓣發(fā)育受阻。組織切片發(fā)現(xiàn),GhMADS7干涉材料花瓣維管束皺縮, 表達分析表明,GhMADS7干涉材料中調(diào)控花器官發(fā)育的 A和 B類基因的表達上調(diào),而參與花瓣發(fā)育的基因多屬于A和B類基因, 因此我們推測GhMADS7可能通過抑制A和B類基因正調(diào)控棉花花瓣發(fā)育。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)基因受體材料為陸地棉(Gossypium hirsutumL.) ‘YZ1’, 由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室棉花組提供。

1.2 載體和菌株

TA克隆載體為 pGEM-Teasy (Promega公司),pDONER221為 BP反應(yīng)入門載體, 購于 Invitrogen公司, 用于GhMADS7遺傳轉(zhuǎn)化的RNA干涉載體基于 Hellsgate4載體構(gòu)建。用于載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌為TOP10, 根瘤農(nóng)桿菌為GV3101。

1.3 主要酶類和試劑

RNA提取試劑盒購于Sigma公司, BP重組酶購于Invitrogen, 限制性內(nèi)切酶購于NEB公司, DNA抽提、質(zhì)粒提取以及PCR純化試劑盒購于北京天根生物科技有限公司, 反轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV Reverse Transcriptase購于Promega公司, qRT-PCR試劑購于ABI公司。載體構(gòu)建過程中所用的抗生素有氨芐青霉素、慶大霉素、卡那霉素、利福平等, 均購自Sigma公司。

1.4 MADS-box基因分析

本研究中陸地棉基因序列來源于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)的數(shù)據(jù)庫(https://www.cottongen.org/); 擬南芥基因數(shù)據(jù)來源于 TAIR數(shù)據(jù)庫(http://www.arabidopsis.org/); 水稻、楊樹和可可的序列均來自于phytozome數(shù)據(jù)庫(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)。DNAMAN軟件(version 9)用于序列比對分析,MEGA軟件(version 6.06)用于基因家族進化分析,Genesis軟件(version 1.7.6)用于基因表達譜分析。

1.5 GhMADS7基因的獲得及序列分析

將擬南芥的 AtAG蛋白序列置于由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)提交的陸地棉TM-1數(shù)據(jù)庫(https://www.cottongen.org/)中 BLAST, 獲得 10個同源基因, 其中GhMADS7和GhMADS98為同源基因?qū)? 通過與擬南芥AtAG基因的同源性比對發(fā)現(xiàn),GhMADS7與擬南芥中的AtAG基因的蛋白序列具有64%的同源性。選取其中的GhMADS7進行后續(xù)試驗。

1.6 GhMADS7基因RNAi載體構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化

通過BP重組反應(yīng)構(gòu)建GhMADS7基因RNAi抑制表達載體[16]。設(shè)計GhMADS7基因含有aatB接頭的引物, 以‘YZ1’花藥的 cDNA為模板進行擴增, 反應(yīng)體系包含 cDNA模板 2 μL、10× EasyTaqbuffer 2 μL、dNTP 0.3 μL、EasyTaq0.2 μL、正反向引物各 0.25 μL、ddH2O 15 μL。TA 克隆反應(yīng)體系包含 2×Rapid Ligation buffer 2.5 μL、T4 DNA Ligase 0.5 μL、pGEM-TEasy 1 μL、PCR 產(chǎn)物 1 μL。獲得克隆后送華大基因測序驗證。以陽性克隆的質(zhì)粒為模板, 用帶aatB接頭的引物, 在高保真酶的作用下再次進行擴增, 進行 BP反應(yīng) 4℃過夜, 反應(yīng)體系包含 BP Clonase TMII 酶混合物 0.5 μL、PCR 產(chǎn)物 2 μL、pDONER221 質(zhì)粒 1 μL、TE buffer 1.5 μL。反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài), 挑單克隆檢測陽性, 對陽性單克隆提取質(zhì)粒, 分別用XholI和XbalI兩種限制性核酸內(nèi)切酶進行酶切檢測, 酶切檢測體系包含Cutsmart buffer 2 μL、XholI 0.5μL、XbalI 0.5 μL、重組質(zhì)粒12 μL、ddH2O 5 μL。將酶切檢測正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GV3101保存?zhèn)溆谩Ｃ藁ㄟz傳轉(zhuǎn)化體系以陸地棉‘YZ1’下胚軸為轉(zhuǎn)化受體, 遺傳轉(zhuǎn)化及植物再生過程具體操作參照文獻[17]。

1.7 轉(zhuǎn)基因材料的分子鑒定

1.7.1 轉(zhuǎn)基因植株陽性鑒定 取適量的植株幼嫩葉片, 利用改良的CTAB法抽提棉花總DNA[17], 將得到的DNA稀釋成100 ng μL-1后作為模板, 以NPTII引物進行PCR擴增, PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳, 根據(jù)有無條帶及條帶大小判斷植株是否為轉(zhuǎn)基因陽性植株。

1.7.2 轉(zhuǎn)基因植株拷貝數(shù)鑒定 取適量轉(zhuǎn)基因陽性植株的幼嫩葉片, 采用植物基因組DNA抽提試劑盒(TIANGEN, China)提取基因組 DNA。利用Southern雜交檢測轉(zhuǎn)基因植株拷貝數(shù), 具體操作步驟見文獻[17]。

1.8 RNA提取及qRT-PCR分析

通過游標(biāo)卡尺量取‘YZ1’花蕾長度, 將其劃分為 5個發(fā)育時期, 即 F＜9 mm、F9～14 mm、F14～19 mm、F＞19 mm和F0 (開花當(dāng)天的花蕾), 將同一發(fā)育時期的花瓣、花藥、柱頭和胚珠進行組織分離, 立即放入液氮中, 保存于-80℃, 用于 RNA 提取及基因組織表達分析。

分別取適量分離出的YZ1和轉(zhuǎn)基因陽性植株的早期花蕾用于轉(zhuǎn)基因植株基因表達量及A和B類基因表達量檢測。所獲得的樣品采用改良的異硫氰酸胍法提取總 RNA[18], 微量分光光度計(NanoDrop2000, USA)檢測 RNA 濃度, 后電泳檢測RNA質(zhì)量。每份材料使用3 μg RNA進行反轉(zhuǎn)錄, 即取3 μg RNA于0.5 mL無RNA酶離心管中, 加入1 μL oligo dT, 用 DEPC 水補充體積至 15 μL, 并簡單離心。將上述混合體系置PCR儀中, 設(shè)置程序為70℃10 min, 之后冰上冷卻10 min。向混合物中加入: 5 μL 5×MLV buffer、1 μL RNasin、1 μL M-MLV RTase、1.25 μL 10 mmol L-1dNTP 和 1.75 μL DEPC 水。充分混合后, 于PCR儀中42℃反應(yīng)60 min, 然后70℃反應(yīng)7 min, 反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物放置于20℃保存。

反轉(zhuǎn)的cDNA樣品稀釋100倍作為表達量檢測的模板。以持家基因GhUBQ7(Gh_A11G011460)為內(nèi)參,通過qRT-PCR檢測目的基因的表達量, 反應(yīng)體系包含7 μL 稀釋的 cDNA 模板、7 μL SYBR Green Master Mix Reagent (Bio-Rad公司)、正反引物各0.5 μL。qRT-PCR所用儀器為ABI-Prism 7500 (Applied Biosystems, USA),反應(yīng)程序為95 ℃ 6 0 s; 95 ℃ 1 5 s, 60 ℃ 4 0s, 40個循環(huán)。

1.9 棉花花器官石蠟切片

通過對田間材料的表型考察發(fā)現(xiàn), 在常溫條件下, 轉(zhuǎn)基因陽性植株花蕾在5～6 mm和7～8 mm長度左右出現(xiàn)表型。對出現(xiàn)表型之前的各個時期的花蕾按1 mm長度為單位進行劃分, 后經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、修塊、切片、脫蠟、染色、封片等步驟后可置于顯微鏡(Zeiss HAL 100)下觀察, 其具體操作過程參照文獻[18-19]。

表1 本試驗所用引物及用途Table 1 Sequence and purpose of the primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 MIKCC型MADS-box基因家族進化樹分析

利用擬南芥中的39條MIKCC型MADS-box基因序列, 于棉花數(shù)據(jù)庫中進行Blast, 獲得76條棉花的同源序列。后與單子葉模式植物水稻和雙子葉模式植物擬南芥的蛋白序列共同利用 MEGA6.1軟件對其進行Construct/Test Neighbor-Joining Tree分析,其中紅色字體為陸地棉中 MIKCC型 MADS-box基因。MIKCC型基因可分為SPE、AGL6、AP1/FUL、AGL12、AG、AGL15、AGL17、SVP、PI/AP3、BS、TM3、SOC和FLC共13個亞族[20]。本研究中共在陸地棉中獲得11個亞族, 不包含F(xiàn)LC和TM3 2個亞族(圖1-A)。本研究重點關(guān)注AG亞族, 其是一類參與花器官生長發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子(紫色區(qū)域標(biāo)識),在陸地棉中共篩選出10個MIKCC型MADS-box的AG 亞族基因, 分別是GhMADS2、GhMADS3、GhMADS4、GhMADS5、GhMADS7、GhMADS10、GhMADS76、GhMADS98、GhMADS99、GhMADS100(圖1-A)。對陸地棉AG亞族與擬南芥AtAG基因單獨繪畫進化樹發(fā)現(xiàn),GhMADS7和GhMADS98與擬南芥中的AtAG基因親緣關(guān)系較近(圖1-B), 故選取GhMADS7和GhMADS98進行后續(xù)分析。

2.2 GhMADS7和 GhMADS98基因序列及表達模式分析

通過對GhMADS7和GhMADS98的CDS序列分析發(fā)現(xiàn),GhMADS7/98的 CDS序列全長均包含 705個堿基, 編碼 234個氨基酸的蛋白。將 GhMADS7和GhMADS98蛋白序列于DNAMAN軟件中進行序列比對分析發(fā)現(xiàn),GhMADS7和GhMADS98基因的蛋白序列具有99%的相似度(圖2-A), 后將GhMADS7和GhMADS98于NCBI網(wǎng)站中進行BLASP以對其保守結(jié)構(gòu)域進行分析發(fā)現(xiàn), GhMADS7和GhMADS98具有 MADS-box基因家族代表性的MADS結(jié)構(gòu)域以及區(qū)分I型和II型MADS-box基因的 K-box結(jié)構(gòu)域(圖2-A, B), 說明GhMADS7和GhMADS98確為II型MADS-box基因成員。本研究在陸地棉各組織表達譜數(shù)據(jù)庫[21]中獲得的GhMADS7和GhMADS98的表達模式信息表明, 同屬于AG亞族的GhMADS7和GhMADS98兩者有著完全一樣的表達模式, 即在陸地棉的柱頭、胚珠和10 DPA種子中相對表達量較高, 其中在胚珠中表達最高(圖2-C)。另外, 這2個基因的ID號顯示GhMADS7(Gh_D04G0341)和GhMADS98(Gh_A05G3267)分別位于陸地棉的A和D亞基因組。結(jié)合蛋白序列、進化分析和表達分析結(jié)果表明,GhMADS7和GhMADS98極有可能為陸地棉中位于A和D亞基因組的同源基因, 因此我們選取了GhMADS7進行進一步試驗。

2.3 GhMADS7基因表達模式分析

GhMADS7基因?qū)儆?MIKCC型 MADS-box基因家族AG亞族, 在植物中可能與花器官發(fā)育相關(guān), 因此我們將陸地棉品種‘YZ1’的花蕾依據(jù)長度分成F＜9 mm、F9～14 mm、F14～19 mm、F＞19 mm和 F0 (開花當(dāng)天花蕾) 5個發(fā)育時期。并且將同一時期的花瓣(Petal)、花藥(Anther)、柱頭(Stigma)和胚珠(Ovule)進行組織分離, 以檢測GhMADS7基因在陸地棉‘YZ1’不同發(fā)育時期的主要花器官中的表達變化。組織表達模式結(jié)果顯示,GhMADS7基因在‘YZ1’開花當(dāng)天花蕾的花瓣中呈現(xiàn)高量表達(圖3-A); 在花藥中,GhMADS7主要是在早中期(即在F＜9 mm和F9～14 mm時期)花蕾中高量表達, 后期花藥中幾乎不表達(圖3-B); 在柱頭中,GhMADS7的表達量在花蕾長度為 F9～14 mm和 F0開花當(dāng)天 2個時期具有較高量表達(圖3-C);GhMADS7的表達量除了在花蕾發(fā)育早期(即F＜9 mm時期)的胚珠中未檢測到表達外, 在其他時期的胚珠中表達量較高且不同時期間沒有明顯差異(圖3-D)。因此, 我們推測GhMADS7基因在調(diào)控棉花花器官發(fā)育過程中對不同組織的調(diào)控作用具有時期差異性。

2.4 降低GhMADS7的表達導(dǎo)致花瓣發(fā)育延緩

為進一步研究GhMADS7在陸地棉中的生物學(xué)功能, 本研究對GhMADS73′ UTR 252 bp進行了干涉載體的構(gòu)建, 并遺傳轉(zhuǎn)化陸地棉‘YZ1’。利用qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn), 5個干涉株系iGhMADS7-3、iGhMADS7-17、iGhMADS7-20、iGhMADS27、iGhMADS32相較于野生型‘YZ1’而言, 表達量均具有明顯的下調(diào), 其中iGhMADS7-27和iGhMADS7-32的表達水平的下調(diào)最明顯(圖4-A)。本研究選取表達量檢測符合要求的轉(zhuǎn)基因株系幼嫩的葉片進行DNA提取, 并進行基因插入拷貝數(shù)檢測, Southern雜交檢測的結(jié)果顯示, 選取的 5個轉(zhuǎn)基因株系除iGhMADS7-3之外均為單拷貝(圖4-B)。后續(xù)選取單拷貝且表達量低的iGhMADS7-27進行試驗。

我們將花蕾按以 1 mm為界限進行長度劃分,選取了 1～2 mm、2～3 mm、3～4 mm、4～5 mm、5～6 mm、6～7 mm、7～8 mm共7個時期進行花蕾縱切面觀察。與野生型‘YZ1’相比,iGhMADS7-27出現(xiàn)花瓣發(fā)育延緩的表型最開始出現(xiàn)在花蕾長度為 5～6 mm時期, 并隨著花蕾的生長表型越來越明顯(圖5)。

為了解抑制GhMADS7轉(zhuǎn)基因植株與野生型‘YZ1’植株的花瓣在細胞水平的變化情況, 本研究選取野生型‘YZ1’和iGhMADS7-27的轉(zhuǎn)基因植株的花蕾進行石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn), ‘YZ1’從2～3 mm花蕾開始花瓣維管束形成區(qū)細胞排列整齊有序, 一直到花蕾長度為5～6 mm時, 野生型‘YZ1’花瓣的維管束雛形形成, 并在花蕾長度為6～7 mm和7～8 mm時期花瓣維管束逐漸膨大生長; 而抑制GhMADS7的轉(zhuǎn)基因株系iGhMADS7-27的花瓣維管束從2～3 mm時期至 7～8 mm 時期始終呈現(xiàn)排列緊湊皺縮的現(xiàn)象。但在相同長度的野生型和iGhMADS7-27花蕾中花瓣薄壁組織細胞層數(shù)保持一致(圖6)。在花瓣中, 維管束的作用主要是輸送養(yǎng)分和提供支撐, 因而推測抑制GhMADS7轉(zhuǎn)基因植株iGhMADS7-27的維管束的皺縮可能會影響花瓣的正常生長發(fā)育,從而導(dǎo)致干涉GhMADS7植株的花瓣發(fā)育在花蕾長度為6～7 mm和7～8 mm時出現(xiàn)明顯延緩生長的表型。

2.5 干涉GhMADS7轉(zhuǎn)基因植株激活A(yù)、B類基因表達

在擬南芥的花器官發(fā)育形態(tài)的ABCDE模型中,不同的花器官發(fā)育進程由不同類型基因調(diào)控[1]。而屬于 C類基因的GhMADS7基因, 若參照擬南芥的花器官發(fā)育調(diào)控機理, 應(yīng)參與雄蕊和心皮的生長發(fā)育, 在GhMADS7-RNAi的轉(zhuǎn)基因材料中卻出現(xiàn)花瓣發(fā)育延緩的表型?；ò甑陌l(fā)育大多是由 A、B類基因共同參與調(diào)控, 因此本研究在 GhMADS7-RNAi的轉(zhuǎn)基因材料中檢測了陸地棉中的A類和B類基因的表達。結(jié)果表明, 在抑制GhMADS7轉(zhuǎn)基因植株中,A 類基因中的GhMADS41、GhMADS42、GhMADS43、GhMADS72、GhMADS73、GhMADS74和GhMADS89在出現(xiàn)明顯表型之前的＜5 mm的花蕾中有明顯的上調(diào), 且上調(diào)的趨勢在花蕾長度為 6～7 mm 時最為明顯(圖7-A)。同時, B 類基因中的GhMADS12、GhMADS51、GhMADS52、GhMADS53、GhMADS59和GhMADS87的表達量同樣在6～7 mm時期呈明顯上調(diào)趨勢(圖7-B)。說明在抑制GhMADS7轉(zhuǎn)基因植株的花器官生長發(fā)育過程中, 當(dāng)花蕾長度為6～7 mm時, 控制花瓣發(fā)育的A、B類基因發(fā)生明顯的上調(diào)表達, 我們推測或許是由于抑制GhMADS7基因?qū)е铝嘶ò臧l(fā)育延緩, 從而激活了調(diào)控花瓣發(fā)育的A、B類基因的表達。

3 討論

MADS-box基因家族作為一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子, 通過與其他蛋白因子相結(jié)合參與植物的生長發(fā)育過程。GhMADS7的序列分析表明,GhMADS7具有MADS-box基因家族代表性的MADS結(jié)構(gòu)域和高度保守的 K結(jié)構(gòu)域, 屬于 MIKCC型的MADS家族基因(圖2)。GhMADS7與擬南芥AtAG基因同源性較高,AtAG在擬南芥中參與雄蕊和心皮的發(fā)育,AtAG功能的喪失會導(dǎo)致雄蕊和心皮轉(zhuǎn)變成萼片和花瓣[22]。超表達茶樹CsAG會導(dǎo)致出現(xiàn)花瓣缺失, 增厚的萼片上出現(xiàn)柱頭和胚珠的現(xiàn)象[23]。在低溫引起的月季花朵重瓣化研究中發(fā)現(xiàn)RhAG基因在月季重瓣中具有重要作用[24]。在紫薇重瓣花研究中發(fā)現(xiàn),與單瓣大花紫薇相比, 重瓣大花紫薇中 C類基因LsAG1和LsAG2在花發(fā)育前期出現(xiàn)明顯的上調(diào)表達[25]。山茶花AG類同源基因CjAG1基因主要對內(nèi)輪器官起調(diào)控作用并能引起花瓣向雄蕊, 萼片向心皮演變[26]。因此我們推測GhMADS7可能同樣參與棉花雄蕊和心皮的發(fā)育。通過觀察GhMADS7干涉植株發(fā)現(xiàn), 其出現(xiàn)花瓣發(fā)育延緩的表型, 且進一步分析表明, 花瓣出現(xiàn)發(fā)育延緩的時期是在花蕾長度為5～6 mm (圖5), 并隨著花蕾的生長表型越來越明顯。在石蠟切片中發(fā)現(xiàn)干涉系植株花瓣的表皮細胞和薄壁組織中未發(fā)現(xiàn)與對照組有明顯差異的現(xiàn)象,但維管束從 2～3 mm 開始就表現(xiàn)為明顯的收縮, 不能正常延伸(圖6)。在夏槿中, 轉(zhuǎn)化嵌合了AG阻遏物(AGSRDX)載體的植株會形成多余的維管束[27]。說明GhMADS7基因確實可能在花瓣的生長發(fā)育過程中起作用, 且可能與花瓣中的維管束的形成有關(guān)。

花瓣的發(fā)育大多是由 A、B類基因共同參與調(diào)控。我們通過檢測A、B類基因的表達量發(fā)現(xiàn), 在花蕾長度為6～7 mm時, 花瓣中的A、B類基因表達量有明顯的上調(diào)(圖7)。這種現(xiàn)象可能是由于抑制GhMADS7基因?qū)е铝嘶ò臧l(fā)育延緩, 從而激活了調(diào)控花瓣發(fā)育的A、B類基因的表達。

前人從陸地棉中克隆出與擬南芥 AG蛋白具有62%同源性的 GhMADS3 (AY083173), 研究發(fā)現(xiàn),在煙草中異位表達GhMADS3會導(dǎo)致煙草萼片轉(zhuǎn)變成心皮, 花瓣轉(zhuǎn)變成雄蕊, 表明GhMADS3在花發(fā)育中具有與擬南芥AtAG相似的作用[28]。通過在NCBI網(wǎng)站上進行 BLASTP發(fā)現(xiàn), 其研究的基因與本研究中進化分析所用的GhMADS3(Gh_A10G2220)有98%的相似度, 且本研究中GhMADS3與AtAG同源性為67%, 高于GhMADS7與擬南芥AG基因的同源性(64%, 圖8),GhMADS3與GhMADS7同為C類基因, 猜測GhMADS3與AtAG的功能更為相似。在研究水稻C類基因OsMADS3和OsMADS58時發(fā)現(xiàn), 分別干涉這 2個基因會出現(xiàn)完全不同的花器官發(fā)育表型, 表明由 AG調(diào)控的功能已經(jīng)被劃分為旁系基因OsMADS3和OsMADS58, 研究還發(fā)現(xiàn),OSMADS3和OSMADS58共同調(diào)節(jié)雄蕊的特征, 但OSMADS3發(fā)揮著更關(guān)鍵性的作用[29]。水稻中一種 B類基因OsMADS16可能與 C類基因OSMADS3和OsMADS58共同作用以決定花器官的形成, 但OSMADS3和OSMADS58與OsMADS16互不影響表達[30]。在毛茛科C類MADS-box基因研究中發(fā)現(xiàn)了花瓣起源于雄蕊的有利證據(jù), 并且推測 C類基因在花瓣的形成中也發(fā)揮了部分作用[31]。C類基因的后續(xù)復(fù)制導(dǎo)致了旁系同源基因亞功能化同時又保持了部分功能冗余[32]。因此我們推測雖然GhMADS7與擬南芥AG基因具有 64%的同源性, 但其可能正調(diào)控花瓣發(fā)育過程, 具體調(diào)控機制有待進一步研究。

4 結(jié)論

本研究克隆了 1個 AG亞家族 MIKCC型的MADS-box家族基因GhMADS7, 其在花瓣、花藥、柱頭、胚珠等花器官中都有表達, 且在‘YZ1’開花當(dāng)天花蕾的花瓣中呈現(xiàn)高量表達; 以‘YZ1’為遺傳背景對GhMADS7基因進行RNAi干涉后發(fā)現(xiàn), 其花蕾在 5～6 mm 時期開始出現(xiàn)花瓣發(fā)育延緩的表型; 且石蠟切片顯示轉(zhuǎn)基因株系iGhMADS7-27的花瓣維管束從2～3 mm時期至7～8 mm時期始終呈現(xiàn)排列緊湊皺縮的現(xiàn)象; 通過探究GhMADS7-RNAi轉(zhuǎn)基因株系中 A、B類基因的表達量發(fā)現(xiàn), 在花蕾長度為 6～7 mm時A、B類基因表達量明顯上調(diào)。對比前人研究結(jié)果,GhMADS3在煙草中的異位表達后出現(xiàn)的表型與擬南芥AtAG在花發(fā)育過程中的功能相似。推測GhMADS3在花發(fā)育中擔(dān)當(dāng)C類基因的功能, 而本研究結(jié)果證實GhMADS7確與花瓣發(fā)育有關(guān), 其調(diào)控機制還需進一步研究。

附表1 用于進化樹分析的78條MADS蛋白序列基因號Table S1 Gene ID of 76 MADS protein sequence for phylogenetic tree analysis