姚佳瑜 于吉祥 王志琴 劉立軍 周 娟 張偉楊,*楊建昌,*

1江蘇省作物遺傳生理重點實驗室 / 江蘇省作物栽培生理重點實驗室 / 揚州大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 江蘇揚州225009; 2江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心 / 揚州大學(xué), 江蘇揚州225009

水稻是世界上最重要的糧食作物之一, 全球約有50%以上的人口以稻米為主食[1-2]。為保障糧食安全, 我國一直將提高單位面積水稻產(chǎn)量作為稻作技術(shù)的一個重要目標(biāo)[3-4]。每穗穎花數(shù)是決定水稻產(chǎn)量的重要因素之一, 且具有較大的變異性和可調(diào)性。因此, 增加每穗穎花數(shù)是提高水稻產(chǎn)量的重要途徑[5-8]。然而, 穎花退化現(xiàn)象在水稻生產(chǎn)中普遍存在,尤其是現(xiàn)代培育的一些大穗型品種的穎花退化率更為嚴(yán)重, 嚴(yán)重制約水稻產(chǎn)量潛力的發(fā)揮[7]。因此, 如何減少穎花退化既是重要的科學(xué)問題, 也是高產(chǎn)技術(shù)栽培實踐需要經(jīng)常面對的重要技術(shù)問題[7-8]。多年來, 國內(nèi)外學(xué)者從農(nóng)藝學(xué)、生理學(xué)和遺傳學(xué)等方面對水稻穎花退化現(xiàn)象進(jìn)行了大量研究[9-12], 但其機制仍不清楚。

油菜素甾醇(brassinosteroids, BRs)是繼生長素、赤霉素、細(xì)胞分裂素、脫落酸和乙烯之后發(fā)現(xiàn)的第六大類植物激素, 主要由油菜素內(nèi)酯(brassinolid,BL)和油菜素甾酮(castasterone, CS)及其衍生物組成,普遍存在于植物界, 廣泛參與調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育過程[13-15]。BRs應(yīng)用在農(nóng)業(yè)上, 可以增加作物生長發(fā)育速度及種子活力, 促進(jìn)水稻等作物分蘗、增加營養(yǎng)體收獲量, 提高坐果率, 促進(jìn)果實肥大, 提高結(jié)實率, 提高籽粒質(zhì)量, 增強作物抵抗生物和非生物脅迫等[13-15]。當(dāng)植物缺乏 BRs時, 會造成植株矮小、種子數(shù)減少并且大量不育、粒重變小[15-21]。水稻穎花發(fā)育狀況既受基因(內(nèi)因)控制, 也受營養(yǎng)因素等外因調(diào)節(jié)。在所有營養(yǎng)因素中, 氮素是影響作物產(chǎn)量的最重要因素之一, 合理的氮肥運籌可以減少穎花退化[6,22]。但關(guān)于水稻內(nèi)源BRs是否以及如何對施氮量作出響應(yīng), 進(jìn)而調(diào)控穎花退化？目前尚不清楚。

與所有需氧有機體一樣, 植物在正常呼吸、光合作用、固氮和環(huán)境脅迫應(yīng)激反應(yīng)等代謝過程中均會產(chǎn)生活性氧物質(zhì)(reactive oxygen species, ROS),其過量積累通常會引起氧化脅迫, 從而造成細(xì)胞受損甚至死亡, 如過氧化氫(H2O2)過量積累會破壞細(xì)胞膜完整性而導(dǎo)致細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death, PCD), 該過程和水稻穎花退化和敗育密切相關(guān)[9-10,23]。此外, 眾多的研究表明, BRs可以激活抗氧化系統(tǒng)活性進(jìn)而增強植物的抗逆性[10,23]。BRs是否以通過調(diào)控ROS的水平來介導(dǎo)施氮量對水稻穎花退化的影響？研究報道甚少。鑒此, 本研究較為系統(tǒng)地觀察了在不同施氮量條件下水稻減數(shù)分裂期幼穗中內(nèi)源BRs含量和ROS的變化特點及其與穎花退化的關(guān)系, 旨在闡明水稻內(nèi)源 BRs對施氮量的響應(yīng)特點及其對穎花退化的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料和栽培概況

試驗于2015年和2016年水稻生長季(5月至10月)在揚州大學(xué)江蘇省作物栽培生理重點實驗室實驗農(nóng)場開展。供試品種為當(dāng)?shù)厣a(chǎn)中廣泛應(yīng)用且穎花退化率不同的2個水稻品種: 常規(guī)秈稻品種揚稻6號(YD-6)和秈-粳雜交超級稻品種甬優(yōu) 2640(YY-2640)。在當(dāng)?shù)厣a(chǎn)中, YD-6的每穗穎花數(shù)通常在 160～190之間, YY-2640的每穗穎花數(shù)通常在250以上(全生育期施純氮240～300 kg hm-2)。5月11日至12日大田播種育秧, 30 d秧齡移栽于盆缽(高 30 cm, 直徑25 cm, 容積14.72 L), 內(nèi)裝過篩大田表層沙壤土, 含有機質(zhì) 2.02%, 堿解氮101.5 mg kg-1, 速效磷含量為34.2 mg kg-1, 速效鉀含量為68.1 mg kg-1。田間管理同當(dāng)?shù)馗弋a(chǎn)栽培技術(shù)進(jìn)行。各品種在8月10日至15日開始抽穗, 于10月5日至6日收獲。

1.2 實驗設(shè)計

每個品種分別設(shè)置 3個施氮水平: 每盆施尿素低氮2 g (low amount of nitrogen application, LN)、中氮4 g (moderate amount of nitrogen application, MN)和高氮6 g (high amount of nitrogen application, HN),按照基肥(移栽前1 d) 40%: 分蘗肥(移栽后7 d) 20%:促花肥(穗分化始期) 20%: ?；ǚ?穎花分化期)20%施用。播種前一次性施過磷酸鈣(含P2O513.5%)折合純磷0.42 g每盆和氯化鉀(含K2O 52%)折合純鉀0.42 g每盆。每個處理80盆。根據(jù)劍葉與倒二葉的葉耳間距和幼穗鏡檢相結(jié)合的方法來判斷幼穗的分化階段[24-25]。

1.3 取樣與測定

在分蘗早期每個處理選擇長勢一致的主莖 400個, 掛上紙牌。于花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂盛期(劍葉與倒二葉的葉耳間距為零時[24-25]) (穎花退化主要發(fā)生在該時期[6,10]), 取各處理 50個長勢一致的, 掛牌主莖幼穗并逐一檢查穗分化階段, 用于測定幼穗中氮含量、BRs含量、H2O2含量和總抗氧化能力(T-AOC)水平。當(dāng)90%的穗抽出時, 各處理取100個, 掛牌主莖穗考查每穗穎花現(xiàn)存數(shù)和退化數(shù)(白化萎縮的穎花為退化穎花)。穎花分化數(shù)為其現(xiàn)存數(shù)和退化數(shù)的總和。

穎花退化率(%) = 穎花退化數(shù)/穎花分化數(shù)×100

成熟期收獲完整的10盆, 考查每盆穗數(shù)、每穗穎花數(shù)、結(jié)實率和千粒重; 另外, 收獲完整的10盆用于考查實產(chǎn)。

1.4 稻穗含氮量測定

將在花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期盛期所取的稻穗烘干后粉碎過篩, 用FOSS公司的Kjeltec 8400全自動凱氏定氮儀測定稻穗含氮量。

1.5 油菜素甾醇(BRs)的提取與測定

稻穗中內(nèi)源 BRs的提取與純化參照 Ding等[26]的方法, 略作改進(jìn): 4～6 g鮮樣組織用液氮冷凍, 用研缽磨成細(xì)粉, 0.5～0.8 g粉末轉(zhuǎn)移到一個10 mL離心管內(nèi), 加乙腈(5 mL g-1)提取, -20°C冰箱中保存一夜待用。乙腈提取的樣品在4°C, 10,000 r min-1下離心10 min。收集上清液, 剩余殘渣用1 mL乙腈再次提取, 合并兩部分上清液, 在溫和的氮氣流中蒸干濃縮備用。根據(jù)Chen等[27]報道的方法, 進(jìn)行萃取、脫水和雙層固相萃取(DL/SPE), 收集萃取液并在溫和的氮氣流中蒸干濃縮。采用液質(zhì)聯(lián)用儀(LC-MS/MS, TSQ Vantage, Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA)的多級反應(yīng)模式(MRM)下進(jìn)行測定與分析。前人報道, 24-表油菜素甾酮(24-epicastasterone, 24-epiCS)和 28-高油菜素內(nèi)酯(28-homobrassinolide, 28-homoBL)是水稻體內(nèi)高生物活性且重要的 BRs[6,10,28], 因此本研究主要測定 24-epiCS和28-homoBL, 以pmol g-1DW (干重)表示其含量。

1.6 總抗氧化能力(T-AOC)和過氧化氫(H2O2)含量的測定

稻穗中T-AOC水平的測定, 參照T-AOC試劑盒生產(chǎn)商(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)制定的方法進(jìn)行測定與分析, 單位以U g-1DW表示。H2O2含量測定采用Rao等[29]報道的方法, 單位以μmol g-1DW表示。

1.7 化學(xué)調(diào)控物質(zhì)處理

供試品種為揚稻6號和甬優(yōu)2640, 栽培方法與生長條件同MN處理(2016年), 120盆重復(fù)。在分蘗早期將所有主莖掛上紙牌, 在花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂前期(劍葉的葉耳低于倒二葉的葉耳5 cm時)用1 mL注射器(針孔直徑0.33 mm, 美國BD公司生產(chǎn))往長勢一致的主莖幼穗中分別注射10 nmol L-124-epiCS(T1), 10 nmol L-128-homoBL (T2), 10 nmol L-1brassinazole (BRZ, 蕓薹素唑, BRs合成抑制劑) (T3),10 nmol L-124-epiCS + 10 nmol L-1BRZ (T4)。噴施的所有溶液中均含有0.1% (v/v)的乙醇和0.01% (v/v)Tween 20作為展開劑, 用含有 0.1% (v/v)的乙醇和0.01% (v/v) Tween 20的清水作為對照(CK)。每莖注射0.5 mL, 每處理120莖。為保證注射效果, 連續(xù)處理4 d, 注射操作對幼穗未見明顯傷害。在花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂盛期, 每處理取40個幼穗并逐一檢查穗分化階段, 用于測定 BRs含量、T-AOC水平和H2O2含量; 抽穗期取 40個稻穗考察穎花分化與退化狀況; 成熟期取 40個稻穗考察單穗產(chǎn)量構(gòu)成因素, 測定方法同上述。

1.8 數(shù)據(jù)處理與計算方法

數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010、SPSS 16.0和SAS(version 9.2, SAS Institute), 進(jìn)行統(tǒng)計分析, 用P＝0.05最小顯著極差法(LSD0.05)進(jìn)行平均數(shù)顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 穎花發(fā)育與產(chǎn)量

施氮量對穎花發(fā)育與產(chǎn)量的影響因品種而異。隨著施氮量的增加, 甬優(yōu)2640的穎花分化數(shù)和每穗穎花數(shù)顯著增加, 穎花退化率顯著降低。揚稻 6號在LN處理下穎花分化數(shù)和每穗穎花數(shù)最少, 在MN處理下最多; 穎花退化率在MN處理下最低, 在HN處理下最高(表1)。兩品種的產(chǎn)量在處理間的變化均表現(xiàn)為: MN處理的最高, LN處理的最低; HN處理的產(chǎn)量低于MN處理的重要原因是結(jié)實率和千粒重的降低。2年結(jié)果趨勢相同(表1)。

表1 不同施氮量處理對水稻穎花發(fā)育、產(chǎn)量和產(chǎn)量構(gòu)成因素的影響Table 1 Effects of different nitrogen rates on spikelet development, grain yield and yield components in rice

2.2 稻穗含氮量和BRs含量

2個品種減數(shù)分裂期稻穗含氮量均隨著施氮量的增加明顯增加(圖1-A, B)。減數(shù)分裂期稻穗中BRs(24-epiCS和 28-homoBL)的含量在處理間的變化因施氮量和品種的不同而異。甬優(yōu) 2640幼穗中24-epiCS和28-homoBL的含量隨施氮量的提高而顯著增加。揚稻6號幼穗中的24-epiCS和28-homoBL含量均在HN處理下最低, 在MN處理下最高(圖2-A～D)。相同氮處理下, 揚稻 6號的稻穗含氮量和 BRs含量均明顯高于甬優(yōu)2640 (圖1-A, B和圖2-A～D)。

2.3 稻穗中T-AOC水平和H2O2含量

減數(shù)分裂期稻穗中T-AOC水平在處理間的變化與BRs (24-epiCS和28-homoBL)的含量變化一致。揚稻6號幼穗中的T-AOC水平在HN處理下最低,在MN處理下最高, 甬優(yōu)2640幼穗中的T-AOC水平隨施氮量的增加而顯著提高(圖3-A, B)。與之相反的是, 揚稻6號幼穗中的H2O2含量在MN處理下最低, HN處理下最高(圖3-C, D), 而甬優(yōu)2640幼穗中的H2O2含量隨施氮量的增加而顯著降低(圖3-C, D)。相同氮處理下, 揚稻6號的稻穗中T-AOC水平顯著高于甬優(yōu)2640稻穗中的含量, 而揚稻6號的稻穗中H2O2含量顯著低于甬優(yōu)2640稻穗中的含量(圖3-A～D)。

2.4 相關(guān)分析

減數(shù)分裂期稻穗中 BRs (24-epiCS和28-homoBL)含量和 T-AOC水平均與稻穗含氮量呈開口向下的二次曲線函數(shù)關(guān)系:C=-59.5+152x-62.1x2, B = -146+338x-137x2和T=-137+332x-138x2(C代表24-epiCS含量,B代表28-homoBL含量,T代表T-AOC,x代表稻穗含氮量;R2= 0.666*～0.758**) (圖4-A～C)。稻穗中 H2O2含量和穎花退化率均與稻穗含氮量呈開口向上的二次曲線函數(shù)H= 59.7-83.9x+34.3x2和S= 41.5-52.4x+20.6x2(H代表H2O2含量,S代表穎花退化率;R2=0.746**～0.831**) (圖4-D, E)。此外, 稻穗中 T-AOC水平與BRs (24-epiCS和28-homoBL)含量顯著正相關(guān)(r= 0.974**～0.982**), 而稻穗中H2O2含量和穎花退化率均與BRs (24-epiCS和28-homoBL)含量顯著負(fù)相關(guān)(r= -0.956**～ -0.978**) (圖5-A～F)。

2.5 外源化學(xué)調(diào)控物質(zhì)對穎花退化的影響

與對照(CK)相比, 在減數(shù)分裂前期對稻穗施用外源BRs (24-epiCS或28-homoBL)處理, 可顯著增加幼穗中內(nèi)源BRs (24-epiCS或28-homoBL)含量和T-AOC水平, 顯著減少幼穗中H2O2含量, 使穎花退化率顯著降低, 每穗穎花數(shù)和結(jié)實率均顯著增加。施用BRZ (BRs合成抑制劑)則效果相反, 即幼穗中內(nèi)源BRs (24-epiCS或28-homoBL)含量和T-AOC水平顯著降低, 幼穗中 H2O2含量大幅增加, 穎花退化率顯著增加, 每穗穎花數(shù)和結(jié)實率均顯著降低。當(dāng)BRZ聯(lián)合 24-epiCS一起施用, 則可有效解除 BRZ對穎花發(fā)育與產(chǎn)量形成的抑制作用。外源化學(xué)調(diào)控物質(zhì)處理對粒重影響較小(表2和表3)。

3 討論

通常認(rèn)為, 水稻每穗粒數(shù)與穗發(fā)育期植株含氮量呈線性正相關(guān); 在水稻穗發(fā)育期施用氮肥能夠顯著影響穎花發(fā)育, 有效增加每穗穎花數(shù)[22,31-32]。因此,在水稻生產(chǎn)中通過施用氮素穗肥, 以增加每穗穎花數(shù)進(jìn)而提高產(chǎn)量[33-34]。本研究觀察到, 施氮量對降低穎花退化率的作用因水稻品種的類型差異而不同。對于每穗穎花分化數(shù)較少的品種揚稻6號而言,與LN或MN處理相比, HN處理下會顯著增加穎花退化率, 而對于每穗穎花分化數(shù)較多的品種甬優(yōu)2640而言, 與LN或MN處理相比, HN處理下能有效降低穎花退化率(表1)。這些結(jié)果表明, 穎花分化數(shù)較多的水稻品種可能比每穗穎花數(shù)較少的品種需要更高的氮素供應(yīng), 以減少穎花退化, 但施氮量過高, 特別是對穎花分化數(shù)較少的品種, 可能會增加水稻穎花退化。

不同穗型的水稻品種的穎花退化率對施氮量響應(yīng)差異的機制尚不清楚。已有研究表明, BRs在增加水稻穎花數(shù)量方面起著重要作用[6,10,35]。本研究觀察到, 不同施氮量可以調(diào)控減數(shù)分裂期稻穗中 BRs(24-epiCS和28-homoBL)含量, 且BRs (24-epiCS和28-homoBL)含量與穎花退化率顯著負(fù)相關(guān)(圖2-A～D 和圖5-E, F)。當(dāng)外源 BRs (24-epiCS或28-homoBL)施用于減數(shù)分裂期時期的稻穗, 可顯著增加稻穗內(nèi)源BRs (24-epiCS和28-homoBL)含量、有效減少穎花退化率, 顯著提高每穗粒數(shù)和產(chǎn)量。當(dāng)施用BRZ (BRs合成抑制劑)則效果相反, 且施用外源24-epiCS可有效解除 BRZ對穎花發(fā)育與產(chǎn)量形成的抑制作用(表2和表3)。這些結(jié)果表明, 在水稻幼穗發(fā)育期合理施用氮肥可有效提高稻穗中 BRs含量, 進(jìn)而顯著減少水稻穎花退化。

本研究觀察到穎花退化率和稻穗中 BRs(24-epiCS和 28-homoBL)含量顯著負(fù)相關(guān), 且它們均與稻穗含氮量呈二次多項式關(guān)系, 說明減數(shù)分裂期穗中 BRs含量越高, 穎花退化率越低; 當(dāng)減數(shù)分裂期稻穗的含氮量為1.25%時, BRs含量最高, 穎花退化率最低(圖4-A, B, E; 圖5-E, F)。這在一定程度上解釋了為什么與LN或MN相比, HN處理會使每穗穎花數(shù)較少的品種揚稻6號的穎花退化率明顯增加, 主要因為幼穗中過高的氮含量可能會降低 BRs(24-epiCS或 28-homoBL)含量; 但大穗型水稻品種甬優(yōu) 2640相對較大的生物量會對植株的氮素含量起稀釋作用, 因而在 HN條件下稻穗中的氮含量仍然相對適宜, 進(jìn)而增加稻穗 BRs含量, 減少穎花退化。這些結(jié)果表明, 水稻減數(shù)分裂期1.25%的稻穗含氮量可作為氮肥施用的一個重要標(biāo)準(zhǔn), 可有效提高幼穗 BRs水平, 減少穎花退化, 進(jìn)而提高水稻庫容與產(chǎn)量潛力。

關(guān)于BRs調(diào)控水稻穎花退化的機制, 以往的相關(guān)研究甚少。前人報道, 發(fā)育稻穗中產(chǎn)生或積累過多的 H2O2可以通過激發(fā)水稻幼穗中細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來誘導(dǎo)PCD, 進(jìn)而導(dǎo)致穎花退化[10,23,36-37]。本研究觀察到, 稻穗中的 H2O2含量與BRs (24-epiCS和 28-homoBL)含量顯著負(fù)相關(guān), 與穎花退化率顯著正相關(guān), 而幼穗中 T-AOC水平與H2O2含量變化趨勢相反(圖5-A～F)。對減數(shù)分裂期的稻穗外源施用BRs (24-epiCS或28-homoBL)可顯著提高稻穗中T-AOC水平, 降低H2O2含量, 進(jìn)而降低穎花退化率, 增加每穗穎花數(shù), 而施用 BRs合成抑制劑的效果則相反(表2和表3)。這些結(jié)果表明,適量施用氮肥或使減數(shù)分裂期稻穗含氮量為 1.25%時, 可以有效提高稻穗中 BRs含量, 增強抗氧化能力, 減輕減數(shù)分裂期間 ROS的對穎花細(xì)胞的傷害,保護(hù)分化的穎花免于退化。

值得注意的是, 在本研究中觀察到穎花退化率在品種間的差異大于氮肥處理間的差異(揚稻6號和甬優(yōu) 2640在氮肥處理間的穎花退化率分別介于7.49%～9.68%和11.8%～15.8%) (表1), 這一方面表明水稻穎花退化狀況在很大程度上受內(nèi)在遺傳力(內(nèi)因)的控制, 另一方面也說明氮素等外界營養(yǎng)因素(外因)在調(diào)控水稻穎花退化過程中也發(fā)揮著重要作用。本研究中穎花退化率在氮肥處理間差異較小的重要原因可能是由于在氮肥處理中不僅?；ǚ实氖┯昧坎煌? 前期的基肥、分蘗肥、促花肥的施用量均不同, 這導(dǎo)致不同的氮肥處理的有效穗數(shù)、分化穎花數(shù)也相差很大, 從而“稀釋”了?；ǚ时旧淼男?yīng)。此外, 在減數(shù)分裂期揚稻6號幼穗中的BRs含量顯著高于甬優(yōu)2640幼穗中的含量, 在同等施氮量的條件下這一現(xiàn)象尤為明顯, 這與兩品種間穎花退化率的差異狀況相反(表1和圖2-A～D)。從另一個方面證明了BRs對水稻穎花退化的調(diào)控作用。表明稻穗中具有較高的BRs水平可以作為減少水稻穎花退化的一項重要生理指標(biāo), 通過品種選育或合理的栽培措施增加稻穗的 BRs生物合成與積累, 可有效減少水稻穎花退化。這一發(fā)現(xiàn)對認(rèn)識水稻穎花退化機制、減少水稻穎花退化, 提高庫容和產(chǎn)量潛力均具有重要意義。BRs介導(dǎo)施氮量對水稻穎花退化的遺傳與分子機制值得進(jìn)一步深入探究。

表2 外源化學(xué)調(diào)控物質(zhì)對稻穗中油菜素甾醇(BRs)、總抗氧化能力(T-AOC)和過氧化氫(H2O2)水平的影響Table 2 Effects of chemical applications on the levels of brassinosteroids (BRs), hydrogen peroxide (H2O2), and total antioxidant capacity (T-AOC) of young panicles in rice

表3 外源化學(xué)調(diào)控物質(zhì)對水稻穎花分化與退化、每穗粒數(shù)、飽粒率和粒重的影響Table 3 Effects of applied chemical regulators on spikelet differentiation and degeneration, spikelet number per panicle, fully filled grains, and grain weight in rice

4 結(jié)論

增加水稻減數(shù)分裂期幼穗中的BRs含量可以有效降低穎花退化率。穗型較大的水稻品種比穗型較小的品種需要施用更多的氮肥以增加減數(shù)分裂期幼穗中 BRs水平, 進(jìn)而有效減少穎花退化。但氮肥施用量過多導(dǎo)致減數(shù)分裂期稻穗含氮量過高會不利于幼穗中 BRs含量的增加, 進(jìn)而增加穎花退化。當(dāng)水稻減數(shù)分裂期幼穗含氮量為 1.25%時, 可有效提高水稻幼穗中的 BRs水平, 從而減少穎花退化。BRs通過調(diào)節(jié)減數(shù)分裂期稻穗的抗氧化能力介導(dǎo)不同施氮量對水稻穎花退化的影響。