冷明昊 張衛(wèi)華 陳東 廖銀平

骨質(zhì)疏松癥是一種常見(jiàn)的骨骼疾病，由低骨量和骨組織結(jié)構(gòu)惡化引起，影響著數(shù)百萬(wàn)人，其中80%為絕經(jīng)后婦女[1]。紅曲由紅曲霉發(fā)酵而成，含有洛伐他汀和其他活性成分[2]，被認(rèn)為在治療冠心病、糖尿病、骨質(zhì)疏松癥等方面發(fā)揮作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)紅曲可以促進(jìn)骨形成和增加骨密度[4]，可能與AMPK激活促進(jìn)BMP2表達(dá)調(diào)節(jié)骨形成和分化有關(guān)[5]。本研究觀(guān)察紅曲對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠體質(zhì)量、骨密度和骨代謝指標(biāo)的影響，旨在研究紅曲對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的改善作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡SPF級(jí)的雌性Wistar SD大鼠(48只，體質(zhì)量220～240 g)，由武漢科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，自由飲食飲水，給予12 h(光)/12 h(暗)的周期循環(huán)。

1.2 藥品和試劑

紅曲購(gòu)自浙江桐君堂中藥飲片有限公司，雌激素購(gòu)自華北制藥股份有限公司；10%水合氯醛溶液購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；血清骨代謝標(biāo)志物ALP、TRAP、OC、PICP ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；GAPDH抗體購(gòu)自上海閃晶分子生物科技有限公司；AMPK和BMP2抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。

1.3 方法

1.3.1藥物配制 將紅曲溶解于75%乙醇中，超聲處理30 s，60 ℃水浴蒸發(fā)，配制母液濃度為0.1，0.2，0.4 g/mL紅曲水提液。配制結(jié)合雌激素水溶液濃度為6.25 μg/mL。

1.3.2動(dòng)物分組及造模 所有的動(dòng)物適應(yīng)7 d后，將8周齡的雌性SD大鼠隨機(jī)分為6組(n=8)，包括假手術(shù)組、去卵巢組、雌激素組和紅曲低、中、高劑量組。其中模型組、雌激素組和紅曲低、中、高劑量組大鼠分別用10%水合氯醛全身麻醉，在無(wú)菌條件下進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除手術(shù)，假手術(shù)組僅打開(kāi)腹腔，不切除卵巢。

1.3.3藥物治療 造模手術(shù)后恢復(fù)4周，再對(duì)雌激素和紅曲組造模成功的大鼠每天給予雌激素(25 μg/kg)和紅曲低、中和高劑量(1.56，3.12，6.24 g/kg)灌胃治療，假手術(shù)組和模型組每天給予等量的0.9%的生理鹽水，連續(xù)灌胃12周。實(shí)驗(yàn)期間每隔4周對(duì)小鼠稱(chēng)重1次。

1.3.4大鼠樣本的收集

末次治療后1天處死大鼠，取各組大鼠L5椎體及左右側(cè)的股骨、脛骨，剔除掉周?chē)浌墙M織，再浸泡在10%甲醛溶液中低溫保存，用來(lái)進(jìn)行骨密度分析和蘇木精-伊紅(HE)染色，同時(shí)經(jīng)眼球采集血樣檢測(cè)血清骨代謝參數(shù)。

1.3.5骨密度檢測(cè)

將浸泡在10%甲醛里的大鼠股骨標(biāo)本取出，采用雙能X線(xiàn)骨密度分析儀掃描和測(cè)量骨密度。這些數(shù)值由Encore 2006軟件包自動(dòng)計(jì)算。

1.3.6脛骨組織HE染色

取大鼠右側(cè)脛骨在10%福爾馬林固定，以10% EDTA脫鈣，嵌入在石蠟，切成5 μm部分。切片經(jīng)脫蠟，常規(guī)HE染色，光鏡下觀(guān)察。

1.3.7血清骨代謝標(biāo)志物檢測(cè) 血清骨代謝標(biāo)志物ALP，TRAP，OC，PICP水平均通過(guò)ELISA試劑盒檢測(cè)。所有步驟均按照ELISA檢測(cè)試劑盒制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定，最后在酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)吸光度，記錄數(shù)值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)換算出標(biāo)志物的含量。

1.3.8Western Blot 用100 μL裂解緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，pH7.4，150 mmol/L NaCl，0.5% Igepal，0.1% 十二烷基硫酸鈉，10 μg/mL苯甲基磺酰氟，10 μg/mL亮抑酶肽，10 μg/mL胃酶抑素，和10 μg/mL熱活化原釩酸鈉)從骨組織中提取骨蛋白。獲得細(xì)胞裂解物并進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別在4 ℃條件下孵育鼠抗AMPK及BMP2抗體(1∶1 000)和GAPDH抗體(1∶2 000)過(guò)夜。次日回收一抗，室溫孵育二抗(鼠抗)1.5 h，1×TBST洗膜，用ECL檢測(cè)反應(yīng)條帶。GAPDH作為內(nèi)參。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 紅曲對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠體質(zhì)量的影響

如圖1所示，各組大鼠初期的體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但隨著造模與治療時(shí)間變化，與假手術(shù)組相比，去卵巢組大鼠體質(zhì)量顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。同時(shí)相比于去卵巢組，雌激素組預(yù)防了大鼠體質(zhì)量的增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，紅曲各劑量組大鼠體質(zhì)量均下降，但紅曲中劑量組效果最顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。因此，紅曲可以預(yù)防去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠體質(zhì)量的增加。

圖1 紅曲對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠體質(zhì)量的影響

2.2 紅曲增加去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度

如圖2所示，與假手術(shù)組相比，去卵巢組股骨的骨密度明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。但與去卵巢組相比，雌激素組明顯抑制了去卵巢引起的骨密度降低，而紅曲各劑量組也出現(xiàn)與雌激素組相似的效果，其中紅曲中劑量組效果最顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。這些結(jié)果表明紅曲對(duì)去卵巢引起的骨丟失具有顯著的保護(hù)作用。

圖2 紅曲對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響

2.3 紅曲改善去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨形態(tài)

對(duì)大鼠股骨組織使用HE染色檢查股骨近端組織學(xué)改變，如圖3所示，假手術(shù)組大鼠骨排列整齊，骨小梁正常，體積大、豐滿(mǎn)，呈網(wǎng)狀。而相比于假手術(shù)組，去卵巢組大鼠股骨近端小梁變薄，空骨陷窩數(shù)量增加，體積增大。與去卵巢組大鼠相比，紅曲各劑量組大鼠股骨近端小梁厚度及總骨量明顯增加，其中紅曲中劑量組增加最顯著。

圖3 紅曲對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨形態(tài)的影響(黃色箭頭是成骨細(xì)胞)

2.4 紅曲對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝生化指標(biāo)的影響

探究了紅曲對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝生化指標(biāo)的影響，ELISA結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，去卵巢組大鼠血清中ALP，TRAP，OC及PICP水平升高；同時(shí)與去卵巢組相比，雌激素組顯著抑制了ALP，TRAP，OC及PICP水平的升高，而紅曲組表現(xiàn)出與雌激素組相似的效果，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4a-d，P<0.05)。因此，紅曲對(duì)去卵巢引起的骨質(zhì)疏松大鼠的骨代謝和骨形成有保護(hù)作用。

圖4 紅曲對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝生化指標(biāo)的影響

2.5 紅曲激活A(yù)MPK信號(hào)通路、促進(jìn)BMP2表達(dá)

為進(jìn)一步探討紅曲保護(hù)去卵巢引起的骨質(zhì)疏松的分子機(jī)制，采用Western Blot方法檢測(cè)各組大鼠骨組織中AMPK和BMP2的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：相對(duì)于假手術(shù)組，去卵巢組大鼠骨組織中AMPK和BMP2蛋白表達(dá)下調(diào)，而相對(duì)于去卵巢組，雌激素組AMPK被激活，顯著上調(diào)了BMP2蛋白表達(dá)，紅曲各劑量組AMPK也被激活并上調(diào)BMP2蛋白表達(dá)，其中紅曲中劑量組上調(diào)最顯著。因此，紅曲可能通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)通路來(lái)上調(diào)BMP2表達(dá)，進(jìn)而改善了去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松。

圖5 紅曲激活A(yù)MPK信號(hào)通路并上調(diào)BMP2表達(dá)

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是是最常見(jiàn)的骨骼疾病之一，目前全世界約有2億人受到影響[6]。骨質(zhì)疏松癥分為原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥和繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥。另外，原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥又分為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、老年骨質(zhì)疏松癥和特發(fā)性骨質(zhì)疏松癥[7]。其發(fā)病率隨著人口老齡化和預(yù)期壽命的增加而顯著增加，15.5%的患者在50～59歲之間，81%的患者在80～89歲之間，骨質(zhì)疏松癥在世界各地的老年人中越來(lái)越普遍[8]。其中女性在絕經(jīng)后更容易患骨質(zhì)疏松癥，這是由于雌激素缺乏導(dǎo)致的骨代謝加速，從而增加了骨折的風(fēng)險(xiǎn)[9-10]。目前，治療骨質(zhì)疏松的藥物具有一定的局限性，因此，尋找有效治療或改善骨質(zhì)疏松癥的藥物是非常迫切的。

紅曲是從大米中提取的一種物質(zhì)，用一種叫紅曲霉的酵母發(fā)酵，作為一種傳統(tǒng)藥物在中國(guó)和其他亞洲國(guó)家使用了幾個(gè)世紀(jì)，對(duì)肥胖、胰島素抵抗、高脂血癥和非酒精性脂肪性肝炎有一定作用[11]，還被用作食用色素、添加劑和防腐劑[12]。此外，有研究還發(fā)現(xiàn)紅曲可以促進(jìn)骨形成[4]，但其中的分子機(jī)制并不明確，同時(shí)，目前對(duì)紅曲的研究并不廣泛，因?yàn)樯胁磺宄硐氲膭┝亢烷L(zhǎng)期安全性。因此，本研究通過(guò)建立去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型，再進(jìn)行紅曲低、中、高劑量灌胃治療來(lái)探究不同劑量紅曲對(duì)骨質(zhì)疏松癥的影響。筆者通過(guò)骨密度和骨代謝生化指標(biāo)ALP，TRAP，OC，PICP來(lái)評(píng)估是否造模成功。TRAP是了解骨吸收和破骨細(xì)胞活性的良好標(biāo)志物，骨質(zhì)疏松癥患者可表現(xiàn)出TRAP升高[13]，而ALP，OC和PICP都是骨形成的標(biāo)志物[14]。研究結(jié)果顯示：相比于假手術(shù)組，去卵巢組大鼠骨密度降低，骨代謝生化指標(biāo)ALP，TRAP，OC，PICP顯著升高。這一結(jié)果與國(guó)內(nèi)外同類(lèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，說(shuō)明去卵巢大鼠模型可作為雌激素減少引起骨密度降低的骨質(zhì)疏松癥的實(shí)驗(yàn)研究。造模成功后經(jīng)不同劑量紅曲灌胃治療，發(fā)現(xiàn)相比于去卵巢組，紅曲各劑量組可以顯著改善去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的表型，包括抑制大鼠體質(zhì)量的增多，抑制骨密度的降低進(jìn)而保護(hù)骨丟失和骨形成，還對(duì)骨小梁的形態(tài)和排列有顯著的改善作用，同時(shí)抑制骨代謝生化指標(biāo)ALP，TRAP，OC及PICP的升高。以上系列變化在紅曲中劑量組最為顯著。因此，紅曲可改善卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的表型。

AMPK即AMP依賴(lài)的蛋白激酶，是生物能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和重編程代謝中發(fā)揮著重要作用，還與細(xì)胞自噬和細(xì)胞極性等過(guò)程有關(guān)[15]。有報(bào)道指出AMPK在體內(nèi)外被激活均可調(diào)節(jié)骨形成和骨量，還可通過(guò)調(diào)節(jié)BMP2的表達(dá)對(duì)成骨細(xì)胞的分化和骨骼發(fā)育有重要作用[16-19]。然而紅曲是否可通過(guò)激活A(yù)MPK促進(jìn)BMP2表達(dá)來(lái)改善去卵巢引起的骨質(zhì)疏松尚不清楚。因此，筆者進(jìn)一步檢測(cè)AMPK和BMP2在各組大鼠骨組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)相比于假手術(shù)組，去卵巢組AMPK和BMP2表達(dá)降低；而相比于去卵巢組，紅曲各劑量組AMPK被激活，同時(shí)BMP2表達(dá)被上調(diào)。其中紅曲中劑量組的變化最顯著。因此，紅曲改善去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的表型可能是通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)通路，進(jìn)一步促進(jìn)BMP2表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，紅曲對(duì)去卵巢大鼠的骨質(zhì)疏松癥具有改善作用，尤其是中劑量組，表現(xiàn)在抑制大鼠體質(zhì)量增加、骨密度降低和骨代謝生化指標(biāo)ALP，TRAP，OC及PICP含量的升高，這一系列變化可能是通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)通路并上調(diào)BMP2表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。