近年來，中國沿海地區(qū)的艾滋病患者比例有所增加，尤其是同性戀人群已成為中國沿海城市艾滋病感染的高危人群。其中，同性戀人群中的HIV-1 病毒株亞型分布廣泛，突變率高。子類型包括在歐美流行的B 類型，以及在亞太地區(qū)的CRF01_AE 和CRF07_BC[1]。在感染了不同的亞型毒株后，一些患者會(huì)產(chǎn)生新的亞型，例如01B，01C 和07B CPX 毒株，這些毒株在中國沿海城市中很流行，而且艾滋病毒在男同性戀者中的傳播也很復(fù)雜[2]。目前，尚無關(guān)于福州流行株的分子特征和起源的報(bào)道。當(dāng)前的研究表明，HIV-1 基因的突變將存在于不同的病毒株亞型中，并且病毒基因重組的能力是HIV-1 病毒突變的基本原因。這也解釋了艾滋病在全球范圍內(nèi)難以控制的主要原因。CRF07_BC 在全國范圍內(nèi)引起暴發(fā)[3-4]，遺傳突變正變得越來越明顯，尤其是在感染了CRF07_BC 亞型的人群中，既有吸毒者又有高危男性[5]。目前流行株的全基因組序列變異和重排，但國內(nèi)主要流行株的基因組分析報(bào)道很少，特別是MSM 人群中CRF07_BC 亞型株全基因序列的進(jìn)化分析。同性戀人群中CRF07_BC 亞型的蛋白結(jié)構(gòu)和功能對(duì)該亞型的病毒傳播能力有影響，從而本研究對(duì)該亞型基因特征進(jìn)行研究[6-7]。男同人群中HIV 感染率不斷提高已引起世界的重視，關(guān)于性行為和感染相關(guān)性的調(diào)查正在深入。男同人群中HIV-1 不同基因型是否會(huì)引起世界流行也收受到的重點(diǎn)關(guān)注。通過基因進(jìn)化樹分析，追溯病毒的起源并分析該亞型的暴發(fā)和主要傳播方式，為HIV-1 在男同人群中的流行和暴發(fā)提供預(yù)警作用，為HIV-1 的防控提供科學(xué)依據(jù)[8]。本研究的重點(diǎn)是對(duì)福州地區(qū)的HIV-1 的整個(gè)基因組的測序，對(duì)福州地區(qū)HIV-1 新重組毒株的基因特征的分析。并男同性戀的主要亞型CRF_07BC 的起源和流行趨勢判斷。從而對(duì)新流行毒株的病毒爆發(fā)趨勢進(jìn)行預(yù)防措施。

1 材料與方法

1.1 CRF07_BC 型血清標(biāo)本中獲得cDNA

收集2011 年1 月—2016 年12 月95 份福州疾病預(yù)防控制中心HIV-1 確診患者血清標(biāo)本，用日本TAKARA 公司的病毒RNA提取試劑盒；通過美國Invitrogen 公司的RNA 的反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。以下是本研究采用的反轉(zhuǎn)錄引物序列：3’端引物：R3.B3R（5’-ACTACTTGAAGCACTCAAGGCAAGCTTTATTG-3）。

1.2 env 基因擴(kuò)增與進(jìn)化樹分析

Env 的基因片段的擴(kuò)增，是通過日本TAKARA 公司的Taq 聚合酶，采用槽式PCR 法進(jìn)行擴(kuò)增。

第一輪PCR：

Primer-F：5’-TAGAGCCCTGGAACCATCCAGGAAG-3’

Primer-R：5’-TAGCCCSTCCAGTCCCCCCTTTTCTTTT-3’

第二輪PCR：

Primer-F：5’-CACCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGA AG-3’

Primer-R：5’AGCTGGATCCGTCTCGAGATACTGCTCCCAC-3’

1.3 基因組測序與進(jìn)化樹分析

福州地區(qū)HIV-1 病毒的全基因組[9]可以通過不同軟件分析病毒基因的重組位點(diǎn)，其中BEAST v1.10、MEGA5.0、和 SimPlot_v3.5.1 三種生物軟件用于新重組株的進(jìn)化樹分析，以及病毒基因進(jìn)化和追溯起源的分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

測序結(jié)果采用SPSS 版本17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRF07_BC 亞型HIV-1 的env 基因的進(jìn)化樹分析

福州地區(qū)的HIV-1 病毒的env 基因序列進(jìn)化分析結(jié)果表明46份核酸陽性中CRF_07BC 亞型18 株。本研究通過18 株CRF07_BC 亞型病毒株的env 基因序列進(jìn)化樹分析，結(jié)果表明福州地區(qū)的CRF07_BC 亞型主要來自印度C 亞型和緬甸的B'亞型重組而成的病毒株，傳入中國云南后通過河南和江西等地進(jìn)行二次傳播到福州地區(qū)，所以福州地區(qū)CRF07_BC 病毒與云南、河南和江西地區(qū)的HIV-1 代表株有較高同源性，序列相似度為95.1%～98.3%，見圖1。且在MS M，IDU 和其他的人群中流行的CRF07_BC 也與云南和河南等地的代表株同源性高，見圖1。

2.2 CRF07_BC 亞型病毒株的Diversity plot 分析

對(duì)CRF07_BC 亞型 的HIV 病毒株（BC.FJFZ.2016.MSM6）進(jìn)行全基因測序分析，結(jié)果表明全基因測序結(jié)果病毒株（BC.FJFZ.2016.MSM6）是由B 亞型和C 亞型的重組株，見圖2。圖2 對(duì)不同亞型的毒株用顏色代表，其中參考序列是中國最流行的HIV-1亞型。圖2 CRF07_BC 參考株（97CN54）和福建新重組株（BC.FJFZ.2013.MSM6）。其中福建地區(qū)HIV-1 病毒新重組株基因中有五個(gè)重組位點(diǎn)，BC.FJFZ.2016.MSM6 的原始?jí)A基主要來自C 亞型，而且在gag，pol 等基因的五個(gè)SNP 與CRF07_BC 參考株（97CN54）一致。

3 討論

盡管目前有許多關(guān)于HIV-1 突變的研究與報(bào)告[9]，本研究重點(diǎn)研究對(duì)象是福建沿海地區(qū)的福州，通過該地區(qū)的CRF07_BC 亞型的基因進(jìn)化進(jìn)行分析，研究結(jié)果表明福州地區(qū)的HIV-1患者的病毒同源性與男同和注射吸毒者同源性高。本研究結(jié)果也顯示福建MSM 人群中HIV-1 病毒的基因在變異，這也進(jìn)一步說明了，福州地區(qū)的CRF07_BC 亞型HIV-1 病毒不斷提高流行比例。

圖1 CRF07_BC 亞型病毒株的env 基因序列進(jìn)化樹分析

圖2 福州地區(qū)CRF07_BC（BC.FJFZ.2016.MSM6）的Diversity plot 分析

中國的HIV-1 病毒主要從20 世紀(jì)90 年代從緬甸等地區(qū)傳入云南[10]?；蜻M(jìn)化分析數(shù)據(jù)也表明了吸毒人群中CRF07_BC 和CRF08_BC 比例在不斷增加，說明該亞型已緬甸傳入中國。在中國，B 和C 亞型的重組形成新重組株，再并通過毒品傳播路徑擴(kuò)增至全國各地。近年來CRF07_BC 在我國的流行率較高，尤其是在年輕MSM 人群中一直處于上升趨勢，并且在部分地區(qū)已經(jīng)成為主要亞型。在該國各個(gè)地區(qū)進(jìn)行了福州男同性戀的流行和CRF07_BC 病毒的流行。結(jié)果表明，該新重組病毒株主要來自云南，河南和江西[11]。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)CRF07_BC 亞型HIV-1 進(jìn)入云南地區(qū)時(shí)，通過在IDU 患者中傳播，并通過MSM/ IDU 雙高危人群進(jìn)行二次傳播到福州。因此，MSM/ IDU 雙重高危人群在第二次HIV-1 流行病向全國各地蔓延中起關(guān)鍵作用。

BC.FJFZ.2016.MSM6 基因組進(jìn)化分析結(jié)果，目前福州地區(qū)主要流行的CRF07_BC 亞型與參考值株（97CN54）序列基本一致。由于福州地區(qū)人流復(fù)雜來自世界各地，今年通過不同方式傳播到了中國的其他發(fā)達(dá)地區(qū)[12]。因此，福州的CRF07_BC 向中國其他地區(qū)擴(kuò)散的方式復(fù)雜。HIV 的重組亞型多樣性性，且不同亞型的HIV-1 病毒傳播途徑和耐藥性也在改變。因此，及時(shí)對(duì)福州地區(qū)男同人群中HIV-1 亞型的變化以及識(shí)別新的CRF 和URF 病毒重組株進(jìn)行追蹤，從而有利于對(duì)福州地區(qū)HIV-1 男同人群中合理使用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物，開發(fā)新藥和開發(fā)疫苗提供依據(jù)。