張亞利，陳倩，戴彥成，2，張紫薇，唐志鵬

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海中醫(yī)藥大學(xué)脾胃病研究所，上海 200032；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200082

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種常見(jiàn)的消化系統(tǒng)疾病，屬炎性腸病范疇。研究顯示，UC可影響患者骨骼及鈣鹽的沉積[1-3]。近年來(lái)，UC 并發(fā)骨質(zhì)疏松癥研究備受關(guān)注[4-5]。骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量低下、骨微結(jié)構(gòu)破壞為特征的全身性骨病，表現(xiàn)為骨脆性增加、易骨折，是UC 患者常見(jiàn)腸道外表現(xiàn)之一[6]。骨重建對(duì)維持骨骼完整性具有重要作用，其由成骨細(xì)胞骨形成和破骨細(xì)胞骨吸收共同協(xié)調(diào)完成，破骨細(xì)胞異常導(dǎo)致這種內(nèi)穩(wěn)態(tài)被打破。骨質(zhì)疏松細(xì)胞學(xué)特征為破骨細(xì)胞的破骨活性強(qiáng)于成骨細(xì)胞的成骨活性，導(dǎo)致骨質(zhì)逐漸被吸收。因此，破骨細(xì)胞凋亡直接影響骨吸收，從而影響骨重建過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松癥中破骨細(xì)胞凋亡受到抑制[7-9]。前期臨床研究表明，健脾清腸方治療UC 取得較好療效[10-12]。健脾清腸補(bǔ)腎方是在健脾清腸方基礎(chǔ)上的拓展方，本實(shí)驗(yàn)從破骨細(xì)胞凋亡機(jī)制入手，觀察健脾清腸補(bǔ)腎方藥物血清對(duì)成熟破骨細(xì)胞凋亡的影響，探討其治療UC并發(fā)骨質(zhì)疏松癥發(fā)揮藥效的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物

健脾清腸補(bǔ)腎方（黃芪30 g，黨參15 g，益智仁12 g，補(bǔ)骨脂9 g，馬齒莧30 g，甘草6 g，木香6 g，地榆15 g），飲片由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中藥房提供。浸泡飲片，煎煮2 次，過(guò)濾藥液，濃縮后濃度為含原藥材1.23 g/mL，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2 細(xì)胞

RAW264.7 細(xì)胞株來(lái)源于Abelson 鼠科白血病病毒誘導(dǎo)腫瘤，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。

1.3 動(dòng)物

雄性SD 大鼠，SPF 級(jí)，6 周齡，體質(zhì)量（200±10）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（滬）2013-0017。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF 級(jí)動(dòng)物房，溫度（23±3）℃，相對(duì)濕度35%～45%，光照12 h，自由攝食飲水。

1.4 主要試劑與儀器

核因子-κB 受體活化因子配基（RANKL）、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF），R&D 公司，批號(hào)分別為315-11、315-02；Bcl-2 抗體、Bax 抗體，CST 公司，批號(hào)分別為2876、2772；TRAP 染色試劑盒，Sigma公司，批號(hào)387A；Annexin V-FITC 和碘化丙啶凋亡檢測(cè)試劑盒，BD 公司，批號(hào)556420。低溫離心機(jī)（Eppendorf 公司，5804R 型），Accuri C6 流式細(xì)胞儀（Becton-Dickinson），純水儀（Heal Force 公司），垂直電泳儀（Bio-Rad 公司，PowerPac 型），全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)（G：Box Chemi XT4，Syngene 公司）。

1.5 藥物血清制備

將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為2 組，每組5 只。健脾清腸補(bǔ)腎方組大鼠按15 mL/kg 給予健脾清腸補(bǔ)腎方煎劑灌胃，空白對(duì)照組給予等體積蒸餾水灌胃，2 次/d，連續(xù)3 d。末次給藥后1 h，乙醚麻醉，腹主動(dòng)脈取血，無(wú)菌離心管收集，4 ℃靜置2 h，4 ℃、3000 r/min 離心15 min，混勻合并同組大鼠藥物血清，56 ℃恒溫水浴滅活30 min，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾除菌，凍存管分裝，置于-80 ℃冰箱貯存?zhèn)溆?。配制成終濃度分別為2.5%、5%、10%的健脾清腸補(bǔ)腎方藥物血清培養(yǎng)液[終濃度（%）＝加入血清體積÷總體積×100%]，即低、中、高劑量健脾清腸補(bǔ)腎方。

1.6 RAW264.7 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

將RAW264.7 細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，使用DMEM 完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、100 U/L 青-鏈霉素和2.5 mg/mL 兩性霉素B）培養(yǎng)，每1～2 d 更換1 次培養(yǎng)液。待細(xì)胞融合至70%，用細(xì)胞刮將貼壁的RAW264.7 細(xì)胞刮下，離心后取新鮮培養(yǎng)液重懸，輕柔吹打均勻，細(xì)胞按1∶4 傳代。

1.7 破骨細(xì)胞誘導(dǎo)及鑒定

細(xì)胞經(jīng)計(jì)數(shù)，將RAW264.7 細(xì)胞按1×104個(gè)/cm2的濃度接種于培養(yǎng)板，加入100 ng/mL RANKL 和10 ng/mL M-CSF 共同誘導(dǎo)其分化。培養(yǎng)6 d 后，破骨細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色鑒定。加入臨時(shí)配制的TRAP 染色液，將培養(yǎng)板置于37 ℃恒溫箱，避光孵育1 h；再用蘇木精復(fù)染3 min，PBS 沖洗3 次，倒置相差顯微鏡下觀察及拍片。光鏡觀察TRAP 陽(yáng)性多核（≥3 個(gè)）破骨細(xì)胞。

1.8 Annexin V/PI 雙染色法檢測(cè)破骨細(xì)胞凋亡

將破骨細(xì)胞接種于6 孔板，健脾清腸補(bǔ)腎方藥物血清（2.5%、5%、10%）對(duì)誘導(dǎo)分化成熟的破骨細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，正常血清培養(yǎng)為空白對(duì)照。按不同培養(yǎng)條件分別加入培養(yǎng)液培養(yǎng)2 d；將6 孔板中每孔細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至15 mL 離心管，每孔再加入400 μL 胰蛋白酶消化3 min，1 mL 完全培養(yǎng)液終止消化，500 μL培養(yǎng)液洗孔1 次；將消化的細(xì)胞加入同一離心管，2000 r/min 離心5 min，棄上清液，用1 mL 預(yù)冷無(wú)菌PBS 洗細(xì)胞沉淀1 次，用PBS 輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL；取100 μL 細(xì)胞懸液，加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻；室溫避光孵育15 min。加入5 μL 碘化丙啶（PI）染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置5 min；加300 μL 結(jié)合液；用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，Annexin V-FITC 為綠色熒光，PI 為紅色熒光。

1.9 Western blot 檢測(cè)破骨細(xì)胞Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)

按不同培養(yǎng)條件（空白對(duì)照組和健脾清腸補(bǔ)腎方低、中、高劑量組）培養(yǎng)細(xì)胞2 d；取干預(yù)后2×106個(gè)破骨細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，PBS 清洗2 次；培養(yǎng)皿中加入100 μL 預(yù)冷的蛋白裂解液，置冰上10～20 min；細(xì)胞刮刮下細(xì)胞收集至EP 管，4 ℃、12 000 r/min 離心5 min，吸取上清液至另一新離心管；取少量上清液，用Bradford 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量；每個(gè)樣品上樣20 μg，經(jīng)SDS-PAGE 分離后，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入TBST 稀釋的Bcl-2 和Bax 一抗（1∶1000），4 ℃孵育過(guò)夜；TBST 洗膜后加入1∶2000 稀釋的二抗，室溫?fù)u床上孵育2 h；TBST 洗膜；將PVDF 膜放入凝膠成像儀中調(diào)整位置和焦距，于PVDF 膜正面的目的條帶上滴加ECL 發(fā)光劑（試劑A 液與試劑B 液等體積混勻），動(dòng)態(tài)集成5～15 min 并拍照，用Gel-Pro 分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行定位和分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS26.0 和GraphPad Prism8.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以表示，對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，對(duì)符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)用方差分析，進(jìn)行多組間比較，組間比較用LSD-t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 破骨細(xì)胞觀察及鑒定結(jié)果

RAW264.7 細(xì)胞剛貼壁時(shí)呈類圓形；第2 日可見(jiàn)伸出的偽足、單核，極少數(shù)有2 個(gè)核；第3 日可見(jiàn)細(xì)胞開(kāi)始發(fā)生融合，逐漸形成空泡樣多核巨噬細(xì)胞；第5 日細(xì)胞可融合形成破骨樣細(xì)胞。RAW264.7 細(xì)胞經(jīng)RNAKL＋M-CSF 聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)4 d，可見(jiàn)少量TRAP染色陽(yáng)性細(xì)胞，類圓形，體積比單核細(xì)胞大數(shù)倍；培養(yǎng)6 d，TRAP 染色陽(yáng)性的細(xì)胞形狀不規(guī)則，多核（≥3 個(gè)），體積大，直徑可達(dá)50～100 μm，有偽足，可見(jiàn)囊泡，鏡下細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，胞漿中TRAP 活性部位呈深紅色顆粒。見(jiàn)圖1。

2.2 健脾清腸補(bǔ)腎方對(duì)破骨細(xì)胞凋亡的影響

通過(guò)Annexin V/PI 雙染色法染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，空白對(duì)照組破骨細(xì)胞早期凋亡率和總凋亡率分別為5.17%、6.68%，與空白對(duì)照組比較，健脾清腸補(bǔ)腎方各劑量組破骨細(xì)胞凋亡率均明顯升高（P＜0.05），其中健脾清腸補(bǔ)腎方高劑量組最顯著，分別為15.21%、17.82%。見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 破骨細(xì)胞Annexin V/PI 雙標(biāo)記法流式細(xì)胞圖

圖3 各組破骨細(xì)胞凋亡率比較（，n＝3）

2.3 健脾清腸補(bǔ)腎方對(duì)破骨細(xì)胞Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，健脾清腸補(bǔ)腎方各劑量組Bcl-2 蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)，Bax 蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)，Bcl-2/Bax 比值明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中健脾清腸補(bǔ)腎方高劑量組變化最顯著。見(jiàn)圖4、圖5。

圖4 各組破骨細(xì)胞Bcl-2、Bax、Bcl-2/Bax 水平比較（，n＝3）

圖5 各組破骨細(xì)胞Bcl-2 和Bax 蛋白免疫印跡圖

3 討論

UC 并發(fā)骨質(zhì)疏松癥可歸屬中醫(yī)學(xué)“骨痹”范疇，感受外邪、飲食不節(jié)、情志失調(diào)及稟賦不足時(shí)，易致脾腎損傷，脾虛運(yùn)化無(wú)力，痰濕內(nèi)生，日久化熱，致濕熱、痰濁、瘀毒內(nèi)生，與氣血搏結(jié)，壅滯于腸道；腎虛則精虧，骨無(wú)所養(yǎng)。脾腎虧虛是UC 并發(fā)骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，濕熱蘊(yùn)結(jié)腸道是其重要病機(jī)。健脾清腸補(bǔ)腎方是本課題組針對(duì)UC 并發(fā)骨質(zhì)疏松癥創(chuàng)立的臨床協(xié)定方劑，是在前期研究健脾清腸方基礎(chǔ)上的拓展方，為健脾清腸方去白及、黃連，加益智仁、補(bǔ)骨脂，由黃芪、黨參、益智仁、補(bǔ)骨脂、地榆、馬齒莧、木香、甘草8 味藥組成。方中黃芪、黨參、益智仁、補(bǔ)骨脂健脾補(bǔ)腎，地榆、馬齒莧清熱涼血止痢，木香行氣止痛，甘草調(diào)和諸藥。全方標(biāo)本兼治，共奏健脾清腸補(bǔ)腎之功。

正常成年人體內(nèi)骨轉(zhuǎn)換需通過(guò)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化、激活及凋亡保持平衡。骨質(zhì)疏松癥通常表現(xiàn)為骨質(zhì)量和骨密度的降低，以及骨組織微結(jié)構(gòu)的改變。

細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡，是由英國(guó)阿伯丁大學(xué)病理學(xué)家Kerr 等[13]1972 年首次提出，其廣泛存在于多細(xì)胞生物的各種器官和組織中。線粒體凋亡通路是經(jīng)典的細(xì)胞凋亡途徑之一。線粒體是細(xì)胞產(chǎn)生能量的重要細(xì)胞器，是細(xì)胞氧化磷酸化和呼吸鏈的中心，也是細(xì)胞凋亡的調(diào)控中心。死亡受體介導(dǎo)的信號(hào)、生長(zhǎng)因子抑制劑等許多因素均能使線粒體功能損傷，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。健脾清腸補(bǔ)腎方藥物血清加入破骨細(xì)胞后，各劑量組破骨細(xì)胞凋亡率較空白對(duì)照組均顯著升高，且與藥物濃度呈正相關(guān)。提示健脾清腸補(bǔ)腎方可促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡，高濃度健脾清腸補(bǔ)腎方藥物血清作用最顯著。

Bcl-2 家族是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控因子，由促凋亡和抗凋亡成員協(xié)同發(fā)揮作用。Bcl-2 可能通過(guò)干擾細(xì)胞色素C 的釋放從而阻斷Caspase 的激活，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生；Bax 即Bcl-2 相關(guān)的X 蛋白，是Bcl-2家族中促凋亡的重要蛋白之一。Bcl-2 可與Bax 形成異二聚體。正常情況下，Bcl-2 和Bax 在細(xì)胞內(nèi)保持相對(duì)平衡。當(dāng)Bcl-2 相對(duì)含量高于Bax 時(shí)，促進(jìn)Bcl-2/Bax 異二聚體的形成，抑制細(xì)胞凋亡；當(dāng)Bax相對(duì)含量高于Bcl-2 時(shí)，則抑制Bcl-2/Bax 異二聚體的形成，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14-16]。因此，這2 種蛋白在異二聚體中所占比例可影響對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)，健脾清腸補(bǔ)腎方藥物血清可提高破骨細(xì)胞凋亡率，其機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)Bcl-2 蛋白的表達(dá)、上調(diào)Bax 蛋白的表達(dá)而導(dǎo)致Bcl-2/Bax 比值下降，從而促進(jìn)細(xì)胞色素C 等促細(xì)胞凋亡因子向細(xì)胞質(zhì)釋放而發(fā)揮作用。健脾清腸補(bǔ)腎方低、中、高劑量組均可促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡，其中以健脾清腸補(bǔ)腎方高劑量組最明顯。

綜上，健脾清腸補(bǔ)腎方藥物血清可促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過(guò)線粒體凋亡途徑而發(fā)揮作用，通過(guò)下調(diào)Bcl-2 蛋白的表達(dá)，上調(diào)Bax 蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡。健脾清腸補(bǔ)腎方各劑量組均可促進(jìn)成熟破骨細(xì)胞凋亡，其中以健脾清腸補(bǔ)腎方高劑量組最明顯。