李玲，李宗州，路娜

（1.河南省職工醫(yī)院 檢驗(yàn)科，河南 鄭州450000；2.河南省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南 鄭州450000）

冠心病是指因冠狀動(dòng)脈血管粥樣硬化病變引起血管腔狹窄、阻塞，造成心肌缺血缺氧、壞死而導(dǎo)致的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病[1]。世界衛(wèi)生組織將冠心病分為無(wú)癥狀心肌缺血、心絞痛、心肌梗死、缺血性心力衰竭、猝死5種類(lèi)型?，F(xiàn)代臨床常分為穩(wěn)定性冠心?。⊿table coronary heart disease，S CAD）與急性冠狀動(dòng)脈綜合征（Acute coronary syndrome，ACS）[2]。冠心病是由免疫、遺傳、環(huán)境等多種因素相互作用導(dǎo)致的一種炎性疾病，與季節(jié)變化、大量吸煙飲酒、情緒暴怒、暴食有關(guān)，常呈急性發(fā)作。表現(xiàn)為胸痛、休克、發(fā)紺、盜汗，嚴(yán)重者可發(fā)生猝死。冠心病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,常見(jiàn)有血栓形成學(xué)說(shuō)、脂肪浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)、內(nèi)皮損傷學(xué)說(shuō)、炎癥及免疫學(xué)說(shuō)，其中血管內(nèi)皮損傷學(xué)說(shuō)是被公認(rèn)且形成較久的冠心病發(fā)病學(xué)說(shuō)[3]。有研究顯示微小核糖核酸（micro ribonucleic acid，miRNA）與冠心病發(fā)生有緊密聯(lián)系[4]。miRNA是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼小分子RNA，種類(lèi)繁多,可調(diào)控細(xì)胞增殖分化及凋亡過(guò)程[5]。本研究通過(guò)觀察冠心病患者血漿中miRNA水平,探究miRNA與冠心病患者凝血功能關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年7月-2018年12月本院收治冠心病患者84例作為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影檢查診斷為冠心??；⑵年齡18~75歲；⑶至少一支冠狀動(dòng)脈狹窄程度>50%；⑷無(wú)血緣關(guān)系。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴伴有惡性腫瘤；⑵嚴(yán)重肝腎功能障礙；⑶近1月內(nèi)有輸血史；⑷感染及血液系統(tǒng)疾??；⑸妊娠及哺乳期婦女。另選取同期于我院體檢合格健康者80例作為對(duì)照組。觀察組年齡32~71歲,平均52.35±5.28歲，男性54例，女性30例。對(duì)照組年齡34~65歲,平均49.51±4.17歲，男性43例,女性37例。根據(jù)觀察組冠心病不同類(lèi)型，分為SACD組53例，ACS組31例。觀察組與對(duì)照組年齡、性別基礎(chǔ)資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有受試者及家屬對(duì)研究?jī)?nèi)容充分知曉，并自愿簽署知情同意。

1.2方法

1.2.1 標(biāo)本采集與凝血功能指標(biāo)測(cè)定 觀察組入院第二天清晨空腹抽取靜脈血5ml，對(duì)照組于體檢當(dāng)日抽取同等量靜脈血。采用枸櫞酸鈉抗凝。經(jīng)低溫離心分離血漿，保存于-80℃冰箱中。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELIS A)檢測(cè)血管性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）、凝血酶-抗凝血酶Ⅲ復(fù)合物（Thrombin antithrombinⅢ,TAT）、血漿纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)g）、D-二聚體（D-dimers）、P-選擇素（P-selectin）水平。

1.2.2 血漿miRNA提取與測(cè)定 將血漿從冰箱中取出后置于室溫下融解，轉(zhuǎn)移至干凈不含RNA酶EP試管中待測(cè)。使用miRNA試劑盒（北京百泰克，型號(hào)：RP5301）提取血漿中miRNA。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。具體步驟：⑴向EP試管中加入Trizol試劑，混勻置于室溫下5min，加入200μl氯仿，混勻后置于室溫3min，4℃離心15min，吸取上清液至新EP試管。⑵加入異丙醇，混勻，-20℃下孵育30min，4℃離心10min，棄去上清液。⑶洗滌沉淀，4℃離心5min，置于真空5～10min，至不完全干燥狀態(tài)，加入焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水30μl溶解沉淀，保存于-80℃冰箱備用。

采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)miRNA。檢測(cè)原理：熒光定量PCR指通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記示蹤，監(jiān)控實(shí)時(shí)反應(yīng)過(guò)程，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件計(jì)算待測(cè)標(biāo)本濃度[6]。PCR反應(yīng)條件：95℃變性5s，60℃退火30s,延伸循環(huán)40次。測(cè)定前采用美國(guó)Bio-RadPCR儀（型號(hào)：C1000）將提取好的miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃60min，95℃3min。逆轉(zhuǎn)錄完成后，使用美國(guó)ABI公司實(shí)時(shí)定量PCR儀（型號(hào)：ABI7500）檢測(cè)miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335的Ct值。CT值指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，與標(biāo)本起始濃度呈負(fù)相關(guān)。

血液采集均由本院檢驗(yàn)科醫(yī)師操作,所有凝血功能相關(guān)因子與miRNA提取與檢測(cè)均由本院檢驗(yàn)科持有PCR上崗證書(shū)檢驗(yàn)醫(yī)師操作。

1.2.3 評(píng)價(jià)觀察組中的冠心病患者動(dòng)脈狹窄程度（Gensini）采用Gensini積分評(píng)價(jià)體系判斷觀察組患者三支主要冠狀動(dòng)脈及其分支狹窄程度[7]。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn):動(dòng)脈管腔狹窄≤25%積1分；25～50%積2分；50～75%積4分；75～90%積8分；90～99%積16分；100%積32分。以積分≤25為輕度狹窄（n=32）,26～49為中度狹窄（n=30）,50～100為重度狹窄（n=22）。積分均由冠心病患者主治醫(yī)師評(píng)定。

1.3 觀察指標(biāo)⑴SACD組、ACS組及對(duì)照組vWF、Fg、TAT、D-dimers、P-selectin水平。⑵SACD組、ACS組及對(duì)照組miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335的Ct值。⑶SACD組、ACS組及對(duì)照組miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335表達(dá)量。⑷不同動(dòng)脈狹窄程度患者miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335的Ct值。⑸不同動(dòng)脈狹窄程度患者miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335表達(dá)量。⑹miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335與凝血功能指標(biāo)及動(dòng)脈狹窄程度相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料組內(nèi)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以（±s）表示，相關(guān)性分析采用spearman分析法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組受試者vWF、Fg、TAT、D-dimers、P-selectin表達(dá)水平比較 SACD組與ACS組vWF、Fg、TAT、D-dimers、P-selectin表達(dá)水平比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)；SACD組與ACS組vWF、Fg、TAT、Ddimers、P-selectin表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.2 三組受試者miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335Ct值比較 SACD組與ACS組miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335Ct值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；SACD組與ACS組miRNA-96、miRNA-34a Ct值均明顯低于對(duì)照組（P<0.05）；SACD組與ACS組miRNA-335Ct值高于對(duì)照組（P<0.05），見(jiàn)表2。

表1 三組受試者vWF、Fg、TAT、D-dimers、P-selectin表達(dá)水平比較

表2 三組受試者miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335Ct值比較

2.3 三組受試者miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335表達(dá)量比較 SACD組與ACS組miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；SACD組與ACS組miRNA-96、miRNA-34a表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；SACD組與ACS組miRNA-335表達(dá)量均明顯低于對(duì)照組（P<0.05），見(jiàn)表3。

表3 三組受試者miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335表達(dá)量比較

2.4 不同動(dòng)脈狹窄程度患者miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335Ct值比較 輕度狹窄組miRNA-96、miRNA-34aCt值高于中度及重度狹窄組，miRNA-335Ct值低于中度及重度狹窄組(P<0.05)；中度狹窄組miRNA-96、miRNA-34aCt值高于重度狹窄組，miRNA-335Ct值低于輕度狹窄組（P<0.05），見(jiàn)表4。

表4 不同動(dòng)脈狹窄程度患者miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335Ct值比較

2.5 不同動(dòng)脈狹窄程度患者miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335表達(dá)量比較 輕度狹窄組miRNA-96、miRNA-34a表達(dá)量均低于重度狹窄組，mi RNA-335表達(dá)量高于中度及重度狹窄組(P<0.05)；中度狹窄組miRNA-96、miRNA-34a表達(dá)量低于重度狹窄組，miRNA-335表達(dá)量高于重度狹窄組（P<0.05），見(jiàn)表5。

表5 不同動(dòng)脈狹窄程度患者miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335表達(dá)量比較

2.6 miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335與凝血功能指標(biāo)動(dòng)脈狹窄程度相關(guān)性 spearman相關(guān)分析顯示,miRNA-96、miRNA-34a與vWF、Fg、TAT、TAT、D-dimers、P-selectin及動(dòng)脈狹窄程度呈正相關(guān)（P<0.05）；miRNA-335與vWF、Fg、TAT、TAT、Ddimers、P-selectin及動(dòng)脈狹窄程度呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），見(jiàn)表6。

表6 miRNA-96、miRNA-34a、miRNA-335與凝血功能指標(biāo)及動(dòng)脈狹窄程度相關(guān)性

3 結(jié)論

miRNA幾乎可參與冠心病患者所有血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞基因表達(dá)過(guò)程[8]。血管內(nèi)皮細(xì)胞具有維持血管內(nèi)皮完整性、抵御外界危險(xiǎn)因子的能力,動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞受損是冠心病患者動(dòng)脈粥樣硬化的首要因素[9,10]。有研究發(fā)現(xiàn)冠心病患者血漿中miRNA-96、miRNA-34a水平較其它心血管疾病患者明顯升高[11]。推測(cè)冠心病患者動(dòng)脈粥樣硬化與miRNA-96、miRNA-34a表達(dá)水平可能相關(guān)，降低其表達(dá)量可能可抑制動(dòng)脈粥樣硬化病變速度。miRNA-335位于7q32.2染色體上，與多種腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[12]。血液中miRNA具有不被RNA酶分解，濃度不受時(shí)間、溫度與酸堿度影響的優(yōu)勢(shì)[13]。近年來(lái)miRNA作為一種生物標(biāo)記示蹤物廣泛應(yīng)用于腫瘤及心血管疾病的臨床研究中[14]。

vWF是血液中一種凝血因子,在血管內(nèi)皮受損出血時(shí)，vWF能介導(dǎo)血小板凝血機(jī)制，促進(jìn)血栓形成。在病理狀態(tài)下,vWF異常升高時(shí)血栓大量增加，導(dǎo)致凝血功能發(fā)生異常。TAT是反映凝血系統(tǒng)激活與凝血酶生成的重要指標(biāo)，TAT升高常見(jiàn)于血液高凝狀態(tài)及血栓性疾病。Fg是纖維蛋白前體，在凝血過(guò)程中可促使血液凝固,其病理性升高會(huì)引起血栓、心肌梗死、惡性腫瘤。D-dimers是一種纖維蛋白降解產(chǎn)物，其含量與纖維蛋白呈正相關(guān)。Pselectin是血管內(nèi)皮細(xì)胞上的一種大分子糖蛋白，主要介導(dǎo)粒細(xì)胞、單核細(xì)胞與血小板粘附聚集作用，其含量升高會(huì)影響血小板粘附聚集功能，使血栓異常增多[15]。vWF、Fg、TAT、D-dimers及P-selectin表達(dá)水平異常升高常提示機(jī)體凝血功能障礙，均是臨床評(píng)估患者凝血功能常用指標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn)，SACD組與ACS組患者血漿中vWF、Fg、TAT、D-dimers及P-selectin表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組健康者，表明無(wú)論何種冠心病，患者都會(huì)出現(xiàn)凝血功能障礙情況。分析其原因，可能是由于冠心病發(fā)生時(shí)因冠狀動(dòng)脈血管阻塞,血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，血液凝血機(jī)制被破壞，出現(xiàn)各凝血相關(guān)指標(biāo)表達(dá)異常現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)，SACD組與ACS組患者miRNA-96、miRNA-34aCt值均明顯低于對(duì)照組，miRNA-335Ct值明顯高于對(duì)照組；SACD組與ACS組miRNA-96、miRNA-34a表達(dá)量均高于對(duì)照組，miRNA-335表達(dá)量低于對(duì)照組。且本研究發(fā)現(xiàn),動(dòng)脈血管管腔輕度狹窄組中miRNA-96與miRNA-34a表達(dá)量均低于重度狹窄組、miRNA-335表達(dá)量高于中度及重度狹窄組。表明冠心病患者miRNA-96與miRNA-34a表達(dá)量越低、miRNA-335表達(dá)量越高，冠心病患者病情越輕，反之病情越重。提示臨床治療時(shí)可能通過(guò)降低miRNA-96與miRNA-34a表達(dá)量、升高miRNA-335表達(dá)量，減輕冠心病患者動(dòng)脈狹窄程度。有研究顯示凝血功能強(qiáng)弱與冠心病血管意外嚴(yán)重程度密切相關(guān),冠心病患者動(dòng)脈狹窄程度越高,其凝血功能障礙情況越重[16]。spearman相關(guān)分析顯示,miRNA-96、mi RNA-34a表達(dá)水平與各凝血功能指標(biāo)水平及動(dòng)脈狹窄程度呈正相關(guān)，miRNA-335表達(dá)水平與各凝血功能指標(biāo)及動(dòng)脈狹窄程度呈負(fù)相關(guān)。表明高動(dòng)脈狹窄程度、高凝血功能指標(biāo)水平的冠心病患者miRNA-96與miRNA-34a表達(dá)水平越高，miRNA-335表達(dá)越低。

綜上所述，凝血功能指標(biāo)vWF、Fg、TAT、Ddimers及P-selectin水平異常升高表示凝血功能發(fā)生障礙,冠心病患者動(dòng)脈狹窄程度隨各凝血功能指標(biāo)水平升高而增大,不同動(dòng)脈狹窄程度冠心病患者各miRNA均出現(xiàn)表達(dá)異常情況。冠心病動(dòng)脈狹窄程度、凝血功能發(fā)生障礙與miRNA-96、miRNA-34a表達(dá)量呈正相關(guān),與miRNA-335表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。miRNA表達(dá)水平能作為臨床評(píng)估冠心病嚴(yán)重程度及凝血功能的輔助診斷指標(biāo),并為冠心病患者后續(xù)治療提供參考價(jià)值。