邸靜鑫，王 穎，金頌峰

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽110847）

近年來，我國每年至少新發(fā)心肌梗死患者50萬例［1］，其發(fā)展迅速、十分危急，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量甚至可以導(dǎo)致死亡，并且發(fā)病人群逐漸由中老年人轉(zhuǎn)向中青年，已嚴(yán)重危害我國居民的生命健康［2］。所以探索出一種方便、持續(xù)、有效的治療方案已在臨床中引起高度重視。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化可以引起心肌缺血，而心肌梗死是心肌缺血的最嚴(yán)重表現(xiàn)，因此改善缺血癥狀可以有效治療心肌梗死。前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)［3］，針刺療法可以有效上調(diào)大鼠心肌細(xì)胞中瞬時(shí)外向鉀離子通道相關(guān)蛋白表達(dá)，從而改善心肌的缺血狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)對心肌梗死的治療作用。目前，蟲類藥物已被越來越廣泛的應(yīng)用與在心肌梗死的治療中［4～6］。因此，本研究擬在前期工作基礎(chǔ)上，將針刺療法與以蟲類藥為主的蹊徑通脈湯相結(jié)合，觀察其對心肌梗死大鼠瞬時(shí)外向鉀離子通道相關(guān)蛋白的持續(xù)表達(dá)情況，并探討其療持續(xù)效情況及可能的持續(xù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

130只健康雄性SD大鼠，體質(zhì)呈（250±25）g，倫理批號：21000092018010，實(shí)驗(yàn)過程均嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理規(guī)范化操作［長生生物，許可證號：SCXH（遼）2015-0001，使用編號：SYXK（遼）2013-0009］。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑

蹊徑通脈湯：水蛭15 g、蜈蚣2條、白僵蠶15 g、土鱉蟲25 g、降香20 g、麥冬25 g、石菖蒲30 g、牛膝20 g、茯苓25 g、丹參30 g、當(dāng)歸25 g、川芎25 g、甘草5 g，由遼寧省中醫(yī)院制成含生藥5.5 g/mL的中藥濃縮液。阿司匹林腸溶片（Bayer，國藥準(zhǔn)字J20171021），單硝酸異山梨酯（Lu?nan，國藥準(zhǔn)字H10940039），異丙腎上腺素（SIGMA，I5627-5G）。高脂飼料［科澳協(xié)力，許可證號：SCXK（京）2019-0001］。

1.3 主要儀器

心電監(jiān)護(hù)儀（HP）；生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（泰盟科技，BL-420S）；針灸針（Hwato，0.18 mm×25 mm）；超低溫冰箱（SANYO）；EPS300 電泳儀（天能科技）；SHA-B型恒溫水浴振蕩器（常州國華儀器設(shè)備廠）；蛋白電泳及轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（GE）；酶標(biāo)儀（MD）；凝膠成像分析系統(tǒng)（Al?pha）等。

1.4 分組與造模［7］

所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。隨機(jī)抽取20只作為對照組，普通喂養(yǎng)，其余大鼠建立心肌梗死模型。具體造模方法如下：除對照組外，其余大鼠高脂飲食喂養(yǎng)，每只15 g/d。3周后，所有大鼠以10%的水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉。仰臥位固定大鼠，用生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)描記大鼠正常狀態(tài)下的Ⅱ?qū)?lián)心電圖。然后除對照組外，其余大鼠注射鹽酸異丙腎上腺素（85 mg/kg），對照組注射等量生理鹽水。24 h后再次注射并進(jìn)行心電圖描記。當(dāng)心電圖出現(xiàn)T波由正變負(fù)或雙相，并伴有ST段明顯抬高、QRS波增寬、竇性心動(dòng)過速、前期收縮等現(xiàn)象，即為造模成功。將造模成功的80只大鼠隨機(jī)分為模型組、針?biāo)幗Y(jié)合組、針刺組、西藥組，20只/組。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

根據(jù)等計(jì)量比值表參照臨床70 kg體重患者日服量進(jìn)行折算［8］，共計(jì)給藥15 d。（1）針?biāo)幗Y(jié)合組：每日灌服蹊徑通脈湯19.35 g·kg-1·d-1，并在心俞、內(nèi)關(guān)、足三里三穴以平補(bǔ)平瀉手法30°刺入皮下2 mm。大鼠穩(wěn)定后施以2～20 Hz疏密波電針，以前肢出現(xiàn)與電針頻率一致的輕微顫動(dòng)為宜，15 min/次，每日一次，共計(jì)15 d。（2）針刺組：每日灌服等量生理鹽水，針刺方法同針?biāo)幗Y(jié)合組。（3）西藥組：每日灌服阿司匹林9.00 mg/kg、單硝酸異山梨酯3.6 mg/kg，進(jìn)行等時(shí)長綁縛。（4）對照組與模型組：每日灌服等量生理鹽水，進(jìn)行等時(shí)長綁縛。

1.6 標(biāo)本采集

采集前夜禁食處理。腹主動(dòng)脈取血，離心取上清液?20℃保存。取血完畢后立即處死大鼠，迅速分離心臟組織，?80℃超低溫冰箱保存。

1.7 ELISA 法檢測人堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bF?GF）蛋白含量

按照要求稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，加樣于酶標(biāo)板上預(yù)設(shè)的各標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣品孔中。蓋封板膜混勻，37℃溫育60 min。揭去封板膜，棄去各孔中液體后加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復(fù)5次，拍干。每孔加入顯色劑A、B各50 μL，震蕩混勻，37℃避光顯色10 min。各孔中加入終止液50 μL。利用酶標(biāo)儀450 nm波長下依序測量各孔的OD值。計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品OD值計(jì)算出對應(yīng)的樣品濃度。

1.8 Western Blot 法檢測大鼠Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3、KChIP2蛋白表達(dá)量

用冰生理鹽水沖洗干凈心臟組織，將其盡量剪碎后與裂解液按1∶1 000比例混合，使其充分裂解后，以12 000 r/min，4℃離心10 min。Broadford蛋白濃度測定法測定蛋白濃度，配置凝膠進(jìn)行電泳。將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到膜上，封閉1 h。剪下目標(biāo)蛋白，加入一抗，37℃水浴震蕩1 h后4℃過夜。同樣方法孵育二抗，洗膜。通過成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，以目標(biāo)條帶和內(nèi)參條帶灰度值的比值反映各蛋白表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠情況

（1）治療開始前：除20只空白組大鼠外，共計(jì)造模成功80只，隨機(jī)分組，20只/組。（2）治療結(jié)束時(shí)：模型組存活18只，其余組無大鼠死亡。此時(shí)處死各組一半數(shù)量的大鼠取樣，其余繼續(xù)正常飼養(yǎng)30 d。（3）治療結(jié)束30 d后：空白組10只，模型組6只，西藥組7只，針刺組8只，針?biāo)幗Y(jié)合組9只。

2.2 各組治療結(jié)束及30 d后bFGF蛋白含量比較

（1）治療結(jié)束時(shí)：相比對照組，其余4組bFGF蛋白含量升高（P＜0.05）；相比模型組，各治療組bFGF蛋白含量升高（P＜0.05），相比西藥組、針刺組，針?biāo)幗Y(jié)合組升高更明顯（P＜0.05）。（2）治療結(jié)束30 d后：相比對照組，其余4組bFGF蛋白含量升高（P＜0.05）；相比模型組，各治療組bFGF蛋白含量升高（P＜0.05）；相比治療結(jié)束時(shí)，治療結(jié)束30 d后各治療組bFGF蛋白表達(dá)雖有些許回落（P＜0.05），但仍高于此時(shí)的模型組（P＜0.05），其中針?biāo)幗Y(jié)合組回落最小（P＜0.05）。見表1。

表1 各組治療結(jié)束及30 d 后bFGF 蛋白含量比較（ng/L，±s）Tab 1 bFGF protein content of rats in each group at the end of treatment and 30 days after treatment（ng/L，±s）

表1 各組治療結(jié)束及30 d 后bFGF 蛋白含量比較（ng/L，±s）Tab 1 bFGF protein content of rats in each group at the end of treatment and 30 days after treatment（ng/L，±s）

注：治療結(jié)束30 d 后樣本含量發(fā)生變化，此時(shí)對照組大鼠數(shù)量仍為10，模型組為6，西藥組為7，針刺組為8，針?biāo)幗Y(jié)合組為9。與同期對照組比較，*P ＜0.05；與同期模型組比較，#P ＜0.05；與同期西藥組、針刺組比較，▲P ＜0.05；與同組治療結(jié)束時(shí)比較，▼P ＜0.05。以下同。

30 d 后1.855±0.095 1.922±0.146*1.923±0.107*#▼1.955±0.130*#▼2.001±0.157*#▼▲12.332＜0.001組 別 n 結(jié)束時(shí)對照組 10 1.891±0.120模型組 9 1.999±1.190*西藥組 10 2.010±0.116*#針刺組 10 2.043±0.157*#針?biāo)幗Y(jié)合組 10 2.085±0.199*#▲F 10.193 P＜0.001

2.3 各組治療結(jié)束及30 d 后Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3、KChIP2 蛋白含量比較

（1）治療結(jié)束時(shí)：相比對照組，其余4 組Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3、KChIP2 蛋白含量降低（P＜0.05）；相比模型組，各治療組Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3、KChIP2蛋白含量升高（P＜0.05），相比西藥組、針刺組，針?biāo)幗Y(jié)合組升高更明顯（P＜0.05）。（2）治療結(jié)束30 d后：相 比 對 照 組，其 余4 組Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3、KChIP2 蛋白含量降低（P＜0.05）；相比模型組，各治療組Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3、KChIP2 蛋白含量升高（P＜0.05）；相比治療結(jié)束時(shí)各治療組，治療結(jié)束30 d 后的各治療組Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3、KChIP2 蛋白表達(dá)雖有些許回落（P＜0.05），但仍高于此時(shí)的模型組（P＜0.05），其中針?biāo)幗Y(jié)合組回落最小（P＜0.05）。見表2～5，圖1～4。

表2 各組治療結(jié)束及30 d 后Kv1.4 蛋白含量比較（ng/L，±s）Tab 2 Kv1.4 protein content of rats in each group at the end of treatment and 30 days after treatment（ng/L，±s）

表2 各組治療結(jié)束及30 d 后Kv1.4 蛋白含量比較（ng/L，±s）Tab 2 Kv1.4 protein content of rats in each group at the end of treatment and 30 days after treatment（ng/L，±s）

組別 n 結(jié)束時(shí)對照組 10 1.695±0.101模型組 9 0.350±0.071*西藥組 10 0.951±0.134*#針刺組 10 1.132±0.134*#針?biāo)幗Y(jié)合組 10 1.314±0.093*#▲F 16.620 P＜0.001 30 d 后1.693±0.115 0.348±0.086*0.946±0.126*#▼1.129±0.113*#▼1.313±0.076*#▼▲18.253＜0.001

圖1 各組治療結(jié)束及30 d 后Kv1.4 蛋白條帶Fig 1 Kv1.4 protein band of rats in each group at the end of treatment and 30 days after treatment

表3 各組治療結(jié)束及30 d 后Kv4.2 蛋白含量比較（ng/L，±s）Tab 3 Kv4.2 protein content of rats in each group at the end of treatment and 30 days after treatment（ng/L，±s）

表3 各組治療結(jié)束及30 d 后Kv4.2 蛋白含量比較（ng/L，±s）Tab 3 Kv4.2 protein content of rats in each group at the end of treatment and 30 days after treatment（ng/L，±s）

組 別 n 結(jié)束時(shí)對照組 10 1.304±0.101模型組 9 0.484±0.122*西藥組 10 0.766±0.128*#針刺組 10 0.778±0.115*#針?biāo)幗Y(jié)合組 10 0.919±0.139*#▲F 15.382 P＜0.001 30 d 后1.300±0.154 0.481±0.117*0.760±0.143*#▼0.775±0.178*#▼0.917±0.149*#▼▲17.273＜0.001

圖2 各組治療結(jié)束及30 d 后Kv4.2 蛋白條帶Fig 2 Kv4.2 protein band of rats in each group at the end of treatment and 30 days after treatment

表4 各組治療結(jié)束及30 d 后Kv4.3 蛋白含量（ng/L，±s）Tab 4 Kv4.3 protein content of rats in each group at the end of treatment and 30 days after treatment（ng/L，±s）

表4 各組治療結(jié)束及30 d 后Kv4.3 蛋白含量（ng/L，±s）Tab 4 Kv4.3 protein content of rats in each group at the end of treatment and 30 days after treatment（ng/L，±s）

組別 n 結(jié)束時(shí)對照組 10 3.060±0.272模型組 9 0.941±0.119*西藥組 10 1.512±0.116*#針刺組 10 1.661±0.179*#針?biāo)幗Y(jié)合組 10 2.004±0.114*#▲F 24.664 P＜0.001 30 d 后3.056±0.152 0.935±0.121*1.506±0.128*#▼1.657±0.134*#▼2.003±0.106*#▼▲26.041＜0.001

圖3 各組治療結(jié)束及30 d 后Kv4.3 蛋白條帶Fig 3 Kv4.3 protein band of rats in each group at the end of treatment and 30 days after treatment

表5 各組治療結(jié)束及30 d 后KChIP2 蛋白含量（ng/L，±s）Tab 5 KChIP2 protein content of rats in each group at the end of treatment and 30 days after treatment（ng/L，±s）

表5 各組治療結(jié)束及30 d 后KChIP2 蛋白含量（ng/L，±s）Tab 5 KChIP2 protein content of rats in each group at the end of treatment and 30 days after treatment（ng/L，±s）

組別 n 結(jié)束時(shí)對照組 10 1.734±0.130模型組 9 0.464±0.145*西藥組 10 0.747±0.128*#針刺組 10 0.940±0.135*#針?biāo)幗Y(jié)合組 10 1.237±0.240*#▲F 19.254 P＜0.001 30 d 后1.731±0.112 0.462±0.125*0.741±0.112*#▼0.936±0.115*#▼1.236±0.138*#▼▲24.723＜0.001

圖4 治療結(jié)束及治療結(jié)束30 d 后各組大鼠KChIP2 蛋白帶Fig 4 KChIP2 protein band of rats in each group at the end of treatment and 30 days after treatment

3 討論

心肌梗死是臨床上常見的危重疾病，是冠心病最主要的致死因素之一，其通常是在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的基礎(chǔ)上，發(fā)生冠脈供血減少或中斷，使相應(yīng)的心肌嚴(yán)重且持久缺血而引起［9］。因此，在心肌梗死的治療中，改善冠狀動(dòng)脈的血流供應(yīng)尤為重要。心肌梗死的發(fā)病癥狀與中醫(yī)學(xué)的“胸痹”、“真心痛”極為相似，其主要表現(xiàn)為胸部悶痛、甚則胸痛徹背、短氣喘息不得臥，多由勞累、飽餐、寒冷及情緒激動(dòng)等誘發(fā)［10］。中醫(yī)認(rèn)為“胸痹”、“真心痛”多由嗜食肥甘，損傷脾胃，使脾失健運(yùn)，胃失和降，水濕不化，可生痰濁。痰濁阻滯，致使經(jīng)絡(luò)瘀滯不通，氣血凝滯，不通則痛，出現(xiàn)心胸憋悶疼痛。這與高血脂誘發(fā)的動(dòng)脈粥樣硬化病理形態(tài)相似，因此本實(shí)驗(yàn)選擇痰瘀互結(jié)型心肌梗死模型，通過高脂喂養(yǎng)大鼠改變其飲食習(xí)慣，當(dāng)脂代謝紊亂后，再用異丙腎上腺素誘導(dǎo)模擬臨床心肌梗死發(fā)病過程制備心肌梗死模型［7］。

心肌梗死的主要病機(jī)為痰瘀互結(jié)、心脈痹阻，從而確立治療原則為祛瘀化痰、通絡(luò)宣痹。本實(shí)驗(yàn)擬在前期研究基礎(chǔ)上，選取心俞、內(nèi)關(guān)、足三里，與蹊徑通脈湯結(jié)合應(yīng)用，共同激發(fā)機(jī)體功能，保護(hù)心肌細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)對心肌梗死良好而持久的治療作用。心俞作為心的背俞穴，心臟經(jīng)氣轉(zhuǎn)輸之地，具有寧心定志、養(yǎng)血安神之功，可直接調(diào)節(jié)心功能，為臨床中廣泛應(yīng)用的治療心臟疾病的要穴［11］。內(nèi)關(guān)是心包經(jīng)的絡(luò)穴、八脈交會穴，可寧心安神、理氣止痛，改善心肌缺血、增強(qiáng)心功能，有效緩解心肌梗死的重度疼痛癥狀［12］。足三里作為胃經(jīng)合穴，可調(diào)和氣血、健脾和胃、加強(qiáng)正氣抗邪能力，提高心血管腔壁壓力感受器敏感性、改善心臟供血情況［13］。三穴合用，共奏活血化瘀、理氣祛痰、通絡(luò)止痛的功效。蹊徑通脈湯中丹參、當(dāng)歸活血化瘀，主入血分，并以水蛭、土鱉蟲活血通絡(luò)，白僵蠶、蜈蚣化痰散結(jié)，此四味功用互補(bǔ)，力專效宏。葉天士在《臨證指南醫(yī)案》指出“藉蟲蟻血中搜剔以攻通邪結(jié)”，表明蟲類藥長于活血化瘀、疏絡(luò)逐邪，對心肌梗死有顯著功效。川芎升發(fā)清氣，降香降泄?jié)釟?，一升一降，使清曠之區(qū)得以復(fù)原。由于蟲類藥猛烈有毒、其性多燥，故以麥冬滋陰潤燥。石菖蒲化痰開竅，茯苓健脾滲濕，甘草調(diào)和諸藥。藥理方面，丹參［14］與當(dāng)歸［15］具有抗凝血及抗血小板聚集、抗動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)心肌的作用；白僵蠶與水蛭［16，17］可活化纖溶系統(tǒng)、水解纖維蛋白、抑制血栓的形成；蜈蚣［18］可有效抗心肌缺血、保護(hù)心肌及血管內(nèi)皮細(xì)胞；土鱉蟲［19］具有抗凝、保護(hù)血管內(nèi)皮的作用；川芎［20］可抑制血栓形成和血小板聚集，抗心肌缺血；降香［21］具有促進(jìn)心肌梗死后大鼠血管新生作用；全方于活血化瘀藥之中寓養(yǎng)血益陰理氣之品以調(diào)整臟腑，結(jié)合針刺療法以調(diào)整經(jīng)絡(luò)，二者結(jié)合則臟腑經(jīng)絡(luò)同治，扶正祛邪，攻補(bǔ)兼施，終獲佳效。

鉀離子通道，是心肌細(xì)胞膜上的一種重要通道，可控制心肌興奮性，參與心肌缺血時(shí)心肌梗死、心力衰竭等病變的發(fā)生與發(fā)展［22］。根據(jù)其蛋白跨膜結(jié)構(gòu)的不同，分為電壓門控鉀離子通道（Kv）和內(nèi)向整流鉀離子通道（Kir）［23］。哺乳動(dòng)物心肌動(dòng)作電位的振幅和持續(xù)時(shí)間在很大程度上是由Kv通道決定［24］。瞬時(shí)外向鉀離子通道作為Kv通道的一種，其通道蛋白主要是由Kv4.2基因編碼所構(gòu)成［25］。與Kv通道相互作用的蛋白質(zhì)KChIP2是KChIPs 家族在心肌細(xì)胞中唯一表達(dá)的家族成員，與Kv4.2有專一的結(jié)合特性［26］。當(dāng)瞬時(shí)外向鉀電流（Ito）被抑制時(shí)心肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程延長，出現(xiàn)心肌缺血癥狀，引起心肌梗死的發(fā)生［27］。Ito分為快速瞬時(shí)外向鉀電流（Ito.f）和慢速瞬時(shí)外向鉀電流（Ito.s）［28］。Kv4.3是Ito.f的主要成分［29］，Kv1.4是Ito.S的主要成分［30］。故Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3、KChIP2蛋白的表達(dá)與心肌缺血狀態(tài)的改善有密不可分的關(guān)系。bFGF，為人體內(nèi)最有效的促血管因子，不僅能促進(jìn)血管新生與心肌細(xì)胞再生，還能促進(jìn)微血管側(cè)支與動(dòng)脈性側(cè)支的生長［31］。心肌細(xì)胞在缺血狀態(tài)下能夠分泌bFGF，并刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生膠原酶和纖溶酶原激活物，降解基底膜，進(jìn)而誘導(dǎo)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞形成管腔樣結(jié)構(gòu)，對血管新生、擴(kuò)大血容量及側(cè)枝循環(huán)建立起重要作用［32］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：（1）治療結(jié)束時(shí)，相比模型組各治療組Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3、KChIP2及bFGF 蛋白含量升高（P＜0.05），其中針?biāo)幗Y(jié)合組升高最為顯著（P＜0.05），說明針刺結(jié)合蹊徑通脈湯具有更加明顯療效，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)控瞬時(shí)外向鉀離子通道相關(guān)蛋白、建立側(cè)枝循環(huán)實(shí)現(xiàn)；（2）治療結(jié)束30 d 后，相 比 模 型 組 各 治 療 組Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3、KChIP2及bFGF蛋白含量升高（P＜0.05），其中針?biāo)幗Y(jié)合組升高最為明顯（P＜0.05）），說明針刺結(jié)合蹊徑通脈湯此時(shí)仍然具有療效；（3）相比治療結(jié)束時(shí)的各治療組，治療結(jié)束30 d 后的各治療組Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3、KChIP2及bFGF蛋白表達(dá)雖有些許回落（P＜0.05），但仍高于此時(shí)的模型組（P＜0.05），其中針?biāo)幗Y(jié)合組回落最?。≒＜0.05），說明針刺結(jié)合蹊徑通脈湯具有更加持續(xù)良好的療效，可以持續(xù)改善心肌缺血狀態(tài)，有效擴(kuò)大血容量。

綜上所述，針刺結(jié)合蹊徑通脈湯對心肌梗死大鼠具有持續(xù)良好的療效，其作用機(jī)制可能是通過瞬時(shí)外向鉀離子通道，持續(xù)上調(diào)Kv1.4、Kv4.2、Kv4.3、KChIP2 及bFGF蛋白含量實(shí)現(xiàn)。