劉爽，郭雪蓮，鄭榮波，范峰華

1. 云南省高原濕地保護(hù)修復(fù)與生態(tài)服務(wù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224 2. 西南林業(yè)大學(xué)，昆明 650224 3. 國(guó)家高原濕地研究中心，昆明 650224

納米材料是指任何一維幾何尺寸處于納米尺度(1～100 nm)，并具有特殊物理和化學(xué)性能的材料[1]。由于其特殊的物理化學(xué)性質(zhì)，如尺度效應(yīng)、表面界面效應(yīng)和量子隧道效應(yīng)，它們被廣泛使用[2-3]。納米二氧化鈦(TiO2-NPs)是最常見(jiàn)的納米金屬氧化物，在平時(shí)的生產(chǎn)應(yīng)用中無(wú)法避免地以各種途徑和方式流入到環(huán)境中[4]。研究表明，美國(guó)污泥中TiO2-NPs的含量約為137 mg·kg-1[5]，亞利桑那州污水中TiO2-NPs的含量為181～1 233 μg·L-1[6]。這些進(jìn)入環(huán)境系統(tǒng)的TiO2-NPs將通過(guò)富集影響生物活性，引起潛在的生物毒性和危害生態(tài)環(huán)境等。

由于TiO2-NPs的加入，引起活性氧含量變化，超氧陰離子自由基、羥自由基和過(guò)氧化氫自由基這些活性氧(ROS)通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)的生理活動(dòng)，對(duì)細(xì)胞和基因產(chǎn)生毒性作用[7-9]。目前，已有大量實(shí)驗(yàn)證明TiO2-NPs會(huì)對(duì)生物產(chǎn)生毒性效應(yīng)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞在不同濃度TiO2-NPs顆粒的作用下會(huì)發(fā)生基因突變、姐妹染色單體交換等異常現(xiàn)象，表明TiO2-NPs會(huì)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生基因毒性[10-12]。其他的一些研究表明，TiO2-NPs也會(huì)加速哺乳動(dòng)物的細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生細(xì)胞毒性[11-13]。植物是生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)者，在生態(tài)系統(tǒng)中的作用至關(guān)重要，同時(shí)也是動(dòng)物和人類的主要食物來(lái)源，是毒性物質(zhì)蓄積的起點(diǎn)[14]，植物的生長(zhǎng)生理活動(dòng)與納米顆粒的遷移轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[15]。目前，關(guān)于TiO2-NPs在生物毒性方面的研究主要集中在其對(duì)動(dòng)物的毒害效應(yīng)，對(duì)植物的研究主要為考察TiO2-NPs對(duì)植物生長(zhǎng)方面的影響，例如，王一翔[16]研究TiO2-NPs對(duì)三角褐指藻的毒性效應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)TiO2-NPs對(duì)三角褐指藻具有一定的生長(zhǎng)抑制作用；蘭麗貞等[17]研究環(huán)境中TiO2-NPs對(duì)擬南芥生長(zhǎng)及相關(guān)基因表達(dá)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)TiO2-NPs可以減緩擬南芥種子的萌發(fā)，抑制擬南芥生長(zhǎng)。而TiO2-NPs影響植物生長(zhǎng)的相關(guān)機(jī)理鮮見(jiàn)研究報(bào)導(dǎo)。

水生植物是水生生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分和主要初級(jí)生產(chǎn)者，在環(huán)境化學(xué)物質(zhì)的積累、代謝等過(guò)程中具有不可忽視的作用。浮萍作為一種漂浮水生植物，具有個(gè)體小、繁殖快和數(shù)量大等優(yōu)點(diǎn)，廣泛存在于水環(huán)境。TiO2-NPs暴露對(duì)浮萍的影響尚不清楚。本研究選取浮萍作為研究對(duì)象，研究TiO2-NPs對(duì)葉片數(shù)和葉面積、葉綠素含量和酶活性的影響。掌握TiO2-NPs對(duì)浮萍生長(zhǎng)和生理特征的影響，為納米顆粒對(duì)水生植物毒理研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料1.1.1 納米材料

本實(shí)驗(yàn)選取的TiO2-NPs有3種晶型，即銳鈦礦型、金紅石型和P25混合型。本實(shí)驗(yàn)采用的TiO2-NPs購(gòu)于阿拉丁試劑官網(wǎng)，平均粒徑為21 nm；銳鈦礦型，平均粒徑10～25 nm，親水；金紅石型，25 nm，親水。

1.1.2 浮萍(Lemnaminor)

漂浮植物，褶皺對(duì)稱，綠色表面，背面通常淡黃色、或帶綠白色、或?yàn)樽仙?，近圓形、倒卵形或倒卵狀橢圓形；北方和南方省份均有分布，生于稻田、池塘或其他靜水中，經(jīng)常與紫萍(Spirodelapolyrrhiza)混合，在水面上形成一個(gè)漂浮群落。

1.2 研究方法

浮萍(Lemnaminor)采集于昆明市撈魚(yú)河濕地公園。

預(yù)培養(yǎng)：首先用0.05%的NaClO溶液浸泡5 min，然后用去離子水徹底清洗，再加入1/2 STEINBERG總營(yíng)養(yǎng)液(表1)，培養(yǎng)15 d(恒溫培養(yǎng)箱內(nèi))。pH為5.5±0.2，晝夜溫度比為25 ℃∶25 ℃，晝夜時(shí)長(zhǎng)比為12 h∶12 h，光照度為200 μE·m-2·s-1，相對(duì)濕度為65%。

培養(yǎng)：稱取3種不同晶型的TiO2-NPs各0.2 g分別移入2 L的容量瓶中，用已經(jīng)配好的營(yíng)養(yǎng)液定容，作為儲(chǔ)備液備用。超聲45 min后稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度(0、25、50、75和100 mg·L-1，分為記為對(duì)照組、T25、T50、T75和T100)，再超聲45 min (200 V，50 kHz)，隨后準(zhǔn)確量取300 mL倒入750 mL的培養(yǎng)容器中，每個(gè)濃度分別設(shè)3個(gè)平行組。挑選健康且大小一致的浮萍4株(12葉)放至培養(yǎng)容器中，培養(yǎng)條件與預(yù)培養(yǎng)條件相同，每天攪動(dòng)3次，每次均勻攪拌至培養(yǎng)液無(wú)沉淀物質(zhì)，每24 h更換一次培養(yǎng)液，共培養(yǎng)7 d。測(cè)定葉面積、葉片數(shù)、葉綠素含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過(guò)氧化物酶(POD)活性和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性。

1.3 實(shí)驗(yàn)測(cè)定1.3.1 葉面積和葉片數(shù)的測(cè)定

葉片數(shù)測(cè)定：將單反相機(jī)保持同一高度、同一焦距，每24 h對(duì)浮萍進(jìn)行拍照，分別計(jì)數(shù)對(duì)照組和處理組的葉片數(shù)。葉面積測(cè)定采用Image J 軟件分析。

1.3.2 葉綠素含量的測(cè)定

待培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后取樣(約取葉片0.1 g，加入2 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF))后在4 ℃下避光提取24 h，然后進(jìn)行離心取上清液，以DMF為對(duì)照測(cè)定其在波長(zhǎng)為647 nm和664.5 nm的吸光度(OD)值[18]。葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量計(jì)算公式如下：

m葉綠素a=[12.7×OOD664.5]-[2.79×OOD647]

(1)

m葉綠素b=[20.7×OOD647]-[4.62×OOD664.5]

(2)

m總?cè)~綠素=17.9×OOD647+8.08×OOD664.5

(3)

1.3.3 酶活性測(cè)定

SOD活性測(cè)定采用NBT光還原法[19]：SOD活性(U·g-1·h-1)=(A0-As)×Vt×60/A0×0.5×mFW×Vs×t

(4)

POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[20]：POD活性(μg·g-1·min-1)=(X-X0)×Vt/mFW×Vs×t

(5)

CAT活性測(cè)定采用紫外線吸收法[17]：CAT活性(U·g-1·min-1)=0.1×Vs×t×mFW

(6)

式中：mFW為樣品鮮質(zhì)量(g)；A0為對(duì)照組吸光度；As為實(shí)驗(yàn)組吸光度；Vt為提取液總體積(mL)；Vs為測(cè)定用提取液體積；t為顯色反應(yīng)時(shí)間；X為測(cè)定管四鄰甲氧基苯酚的含量；X0為對(duì)照管四鄰甲氧基苯酚的含量。

表1 STEINBERG全營(yíng)養(yǎng)液成分Table 1 STEINBERG total nutrient contents

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 20對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析、雙因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)，采用Origin 2018制圖。

2 結(jié)果(Results)

2.1 TiO2-NPs輸入對(duì)浮萍生長(zhǎng)的影響

TiO2-NPs輸入對(duì)浮萍葉片數(shù)的影響如圖1(a)所示，T75銳鈦礦型處理組浮萍葉片數(shù)顯著增加(P<0.05)；T25、T50和T75金紅石型處理組浮萍葉片數(shù)均顯著增加(P<0.05)；不同濃度P25混合型處理組浮萍葉片數(shù)均顯著增加(P<0.05)。T25和T50處理組浮萍葉片數(shù)表現(xiàn)為金紅石型和P25混合型高于銳鈦礦型(P<0.05)，T75處理組浮萍葉片數(shù)表現(xiàn)為金紅石型<銳鈦礦型

TiO2-NPs輸入對(duì)浮萍葉面積的影響如圖1(b)所示，不同濃度銳鈦礦型處理組浮萍葉面積均無(wú)顯著變化(P>0.05)；T25和T100金紅石型處理組浮萍葉面積均顯著降低(P<0.05)；P25混合型在T75處理組浮萍葉面積顯著增加(P<0.05)。T75處理組浮萍葉面積表現(xiàn)為P25混合型高于金紅石型和銳鈦礦型(P<0.05)，T100處理組浮萍葉面積表現(xiàn)為金紅石型<銳鈦礦型

TiO2-NPs濃度和晶型均顯著影響浮萍葉片數(shù)和葉面積(P<0.01)；濃度和晶型交互作用顯著影響浮萍葉片數(shù)(P<0.01)(表2)，對(duì)浮萍葉面積影響不顯著(P>0.05)。

2.2 TiO2-NPs輸入對(duì)浮萍葉綠素含量的影響

TiO2-NPs輸入對(duì)浮萍葉綠素a含量的影響如圖2(a)所示，T25銳鈦礦型處理組浮萍葉綠素a含量顯著降低(P<0.05)，T75和T100金紅石型處理組浮萍葉綠素a含量均顯著增加(P<0.05)，不同濃度P25混合型處理組浮萍葉綠素a含量均顯著增加(P<0.05)。T25和T100處理組浮萍葉綠素a含量均表現(xiàn)為銳鈦礦型<金紅石型

TiO2-NPs輸入對(duì)浮萍葉綠素b含量的影響如圖2(b)所示，T25和T50銳鈦礦型處理組浮萍葉綠素b含量均顯著下降(P<0.05)，而T75和T100金紅石型處理組浮萍葉綠素b含量均顯著下降(P<0.05)，不同濃度P25混合型處理組浮萍葉綠素b含量均無(wú)顯著變化(P>0.05)。T25和T50處理組浮萍葉綠素b含量均表現(xiàn)為銳鈦礦型低于金紅石型和P25混合型(P<0.05)，T100處理組浮萍葉綠素b含量表現(xiàn)為銳鈦礦型>P25混合型>金紅石型(P<0.05)。

圖1 TiO2-NPs對(duì)浮萍生長(zhǎng)的影響注：T25、T50、T75和T100表示25、50、75和100 mg·L-1 TiO2-NPs；大寫字母表示不同晶型TiO2-NPs處理組的差異顯著性，小寫字母 表示不同濃度TiO2-NPs處理組的差異顯著性；不同字母表示其統(tǒng)計(jì)差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，下同。Fig. 1 The effect of TiO2-NPs on the growth of Lemna minorNote: T25, T50, T75 and T100 stand for 25, 50, 75 and 100 mg·L-1 TiO2-NPs; the uppercase letters indicate the significance of the difference in the treatment of different crystalline TiO2-NPs, and the lowercase letters indicate the significance of the difference in the treatment of different concentrations of TiO2-NPs; different letters indicate that the statistical difference has reached a significant level (P<0.05); the same below.

圖2 TiO2-NPs對(duì)浮萍葉綠素含量的影響Fig. 2 The effect of TiO2-NPs on chlorophyll of Lemna minor

表2 TiO2-NPs對(duì)浮萍生長(zhǎng)和生理指標(biāo)影響的雙因素方差分析Table 2 Two-factor analysis of variance on the influence of TiO2-NPs concentration and crystal type on the growth and physiological indexes of Lemna minor

TiO2-NPs輸入對(duì)浮萍總?cè)~綠素含量的影響如圖2(c)所示，T25和T50銳鈦礦型處理組浮萍總?cè)~綠素含量均顯著降低(P<0.05)。T25、T50和T100金紅石型處理組浮萍總?cè)~綠素含量均顯著下降(P<0.05)。P25混合型在T25處理組浮萍總?cè)~綠素含量顯著增加(P<0.05)。T25和T50處理組浮萍總?cè)~綠素含量均表現(xiàn)為P25混合型高于銳鈦礦型和金紅石型(P<0.05)，T100處理組浮萍總?cè)~綠素含量表現(xiàn)為金紅石型<銳鈦礦型

TiO2-NPs濃度、晶型、濃度和晶型交互作用均顯著影響浮萍葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量(P<0.05)。

2.3 TiO2-NPs對(duì)浮萍抗氧化酶活性的影響

TiO2-NPs輸入對(duì)浮萍SOD酶活性的影響如圖3(a)所示，不同濃度銳鈦礦型處理組浮萍SOD活性均顯著增加(P<0.05)。T50和T100金紅石型處理組浮萍SOD活性均顯著增加(P<0.05)。P25混合型在T50處理組浮萍SOD活性顯著增加(P<0.05)。不同濃度處理組浮萍SOD活性表現(xiàn)為3種晶型均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

TiO2-NPs輸入對(duì)浮萍POD酶活性的影響如圖3(b)所示，不同濃度銳鈦礦型和P25混合型處理組浮萍POD活性均顯著增加(P<0.05)。T50、T75和T100金紅石型處理組浮萍POD活性均顯著增加(P<0.05)。T50和T100處理組浮萍POD活性表現(xiàn)為銳鈦礦型高于金紅石型和P25混合型(P<0.05)，T75處理組浮萍POD活性表現(xiàn)為P25混合型高于銳鈦礦型和金紅石型(P<0.05)。

TiO2-NPs輸入對(duì)浮萍CAT酶活性的影響如圖3(c)所示，T75銳鈦礦型處理組浮萍CAT活性顯著增加(P<0.05)。T25金紅石型處理組浮萍CAT活性顯著下降(P<0.05)，T50金紅石型處理組浮萍CAT活性顯著增加(P<0.05)。P25混合型在T50處理組浮萍CAT活性顯著下降(P<0.05)。T25和T75處理組浮萍CAT活性表現(xiàn)為銳鈦礦型高于金紅石型和P25混合型(P<0.05)，T50處理組浮萍CAT活性表現(xiàn)為金紅石型高于銳鈦礦型和P25混合型(P<0.05)。

TiO2-NPs濃度顯著影響浮萍SOD和POD活性(P<0.01)，顯著影響浮萍CAT活性(P<0.05)。TiO2-NPs晶型對(duì)浮萍SOD和CAT活性影響顯著(P<0.05)，對(duì)浮萍POD活性影響顯著(P<0.01)。濃度和晶型交互作用對(duì)浮萍SOD活性影響不顯著(P>0.05)，顯著影響浮萍POD和CAT活性(P<0.01)。

圖3 TiO2-NPs對(duì)浮萍酶活性的影響注：SOD表示超氧化物歧化酶；POD表示過(guò)氧化物酶；CAT表示過(guò)氧化氫酶。Fig. 3 The effect of TiO2-NPs on enzyme activity of Lemna minorNote: SOD stands for superoxide dismutase; POD stands for peroxidase; CAT stands for catalase.

3 討論(Discussion)

3.1 TiO2-NPs對(duì)浮萍生長(zhǎng)的影響分析

具有不同晶體結(jié)構(gòu)的同種納米材料生物毒性不同。納米顆粒的生物毒性與納米顆粒的顆粒尺寸、比表面積等存在一定關(guān)聯(lián)。一般認(rèn)為，相同納米顆粒的尺寸越小其生物毒性越強(qiáng)[21]。較小尺寸的納米材料可以直接穿透植物細(xì)胞壁，因?yàn)榧?xì)胞壁可能會(huì)限制>20 nm的納米材料通過(guò)[22]。本研究發(fā)現(xiàn)銳鈦礦型處理均對(duì)浮萍生長(zhǎng)產(chǎn)生了不同程度的抑制作用，而金紅石型和P25混合型處理對(duì)浮萍生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。在成婕等[23]的研究中，銳鈦礦型TiO2-NPs在10、20和40 mg·L-1處理下抑制了斜生柵藻的生長(zhǎng)，且文雙喜和王毅力[24]研究發(fā)現(xiàn)20 mg·L-1和100 mg·L-1銳鈦礦型TiO2-NPs均抑制了金魚(yú)藻的生長(zhǎng)，這與本研究結(jié)果一致。這可能是由于銳鈦礦型的粒徑小于金紅石型和P25混合型，較容易通過(guò)植物細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞，同時(shí)通過(guò)物理阻塞作用使植物細(xì)胞壁孔徑變小，從而影響植物細(xì)胞的正常生理功能，致使植物生長(zhǎng)受到抑制[25]。而金紅石型和P25混合型可能被浮萍細(xì)胞識(shí)別為生物大分子如蛋白質(zhì)[26]，從而不被細(xì)胞排斥，且促進(jìn)了植物生長(zhǎng)。李雅潔等[27]的研究表明，金紅石型TiO2-NPs在5 mg·L-1處理下對(duì)斜生柵藻生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用，可能是由于低濃度毒物的“刺激效應(yīng)”或稱“興奮效應(yīng)”所致[28-29]，對(duì)植物生長(zhǎng)產(chǎn)生促進(jìn)作用。

3.2 TiO2-NPs對(duì)浮萍葉綠素含量的影響分析

葉綠體是活性氧產(chǎn)生和積累的位點(diǎn)[30]，葉綠素是植物光合作用中吸收光能和傳遞光能的重要載體，對(duì)植物生長(zhǎng)起著十分重要的作用。當(dāng)植物暴露于納米材料氧化脅迫下，葉綠素a和葉綠素b的含量會(huì)降低[31-32]，本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度銳鈦礦型處理降低了浮萍葉綠素的含量。已有研究表明，銳鈦礦型TiO2-NPs在40 mg·L-1處理下降低了斜生柵藻葉綠素a的含量[23]，100 mg·L-1銳鈦礦型處理顯著降低普生輪藻葉綠素a含量[33]，這可能是TiO2-NPs脅迫直接破壞植物體內(nèi)生成的解毒物質(zhì)，形成大量的活性氧自由基，這些自由基直接把葉綠素作為靶分子，從而破壞植物生長(zhǎng)[34]。武鵬鵬[35]研究發(fā)現(xiàn)30 mg·L-1銳鈦礦型(10～25 nm)處理降低了斜生柵藻葉綠素a的含量，這與本研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著濃度的增加銳鈦礦型處理對(duì)浮萍葉綠素b含量抑制作用減弱，可能是濃度處理達(dá)到防御系統(tǒng)的刺激閾值時(shí)，藻體的防御機(jī)制啟動(dòng)，生成了相應(yīng)的解毒物質(zhì)[16]。銳鈦礦型TiO2-NPs比金紅石型TiO2-NPs有更強(qiáng)的毒性[36]，本研究中銳鈦礦型處理降低了浮萍葉綠素a含量，而金紅石型處理提高了浮萍葉綠素a的含量，且Hong等[37]的研究也顯示了金紅石型能加快希爾反應(yīng)FeCy的氧化還原過(guò)程，增加了葉綠體活性，這可能是因?yàn)門iO2-NPs進(jìn)入葉綠體，其氧化還原反應(yīng)會(huì)加速電子傳輸和氧的釋放。

3.3 TiO2-NPs對(duì)浮萍酶的影響分析

當(dāng)植物體內(nèi)的ROS積累到一定程度而沒(méi)有被及時(shí)清除時(shí)，ROS便會(huì)對(duì)植物體造成不可逆的損傷[38-39]。SOD、POD和CAT都是抗氧化酶，當(dāng)植物體內(nèi)受到氧化脅迫作用時(shí)，3種酶會(huì)通過(guò)協(xié)同作用一起清除植物體內(nèi)多余的ROS，減輕氧化脅迫影響[40]。本研究發(fā)現(xiàn)銳鈦礦型、金紅石型和P25混合型處理均導(dǎo)致浮萍SOD和POD的活性增強(qiáng)。這是因?yàn)門iO2-NPs刺激浮萍細(xì)胞產(chǎn)生了更多的ROS，SOD和POD活性受到相應(yīng)刺激而升高，消除過(guò)量的O2-，防止氧化損傷。高嫄[1]的研究結(jié)果表明，在濃度為50 mg·L-1的TiO2-NPs處理時(shí)，青萍(Lemnaminor)的SOD活性顯著升高，濃度為100 mg·L-1時(shí)，青萍SOD酶活性達(dá)到最大值，與本研究結(jié)果一致。王震宇等[41]的研究結(jié)果也表明，金紅石型TiO2-NPs可以使植物體內(nèi)ROS升高、SOD和POD活性增強(qiáng)。已有研究表明，當(dāng)生物體受到脅迫時(shí)，SOD活性增強(qiáng)，而CAT活性降低[42]。本研究中銳鈦礦型T50處理組導(dǎo)致浮萍CAT活性降低，在高嫄[1]的研究中也發(fā)現(xiàn)銳鈦礦型TiO2-NPs在50 mg·L-1處理下青萍CAT活性下降。本研究結(jié)果表明金紅石型和P25混合型處理均降低了浮萍的CAT活性。POD和CAT都是清除過(guò)氧化氫的酶，它們作為植物體內(nèi)抗氧化脅迫的第二層防線，POD已經(jīng)清除了過(guò)多的過(guò)氧化氫，減少了機(jī)體內(nèi)過(guò)氧化氫的含量，而CAT作用于過(guò)氧化氫的機(jī)理實(shí)質(zhì)上是過(guò)氧化氫的岐化，必須有2個(gè)過(guò)氧化氫分子先后與CAT相遇且碰撞在活性中心上才能發(fā)生反應(yīng)，所以導(dǎo)致了CAT活性降低?？寡趸傅幕钚圆环€(wěn)定，并隨培養(yǎng)時(shí)間而變化。很難證明植物是否可以通過(guò)在一定時(shí)間使用幾種抗氧化酶來(lái)保護(hù)自己免受環(huán)境壓力。但是，抗氧化防御酶的活性通常在有機(jī)體遇到低水平壓力時(shí)增加，而在高壓力條件下降低[43]。