駱浪，何偉，張磊

(湖北省漢川市人民醫(yī)院骨科，湖北 漢川 432300)

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是一種多發(fā)于青少年的高度惡性腫瘤，約占原發(fā)性骨腫瘤的20%[1]。OS患者臨床表現(xiàn)具有生長(zhǎng)快、病程短、易早期發(fā)生轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，導(dǎo)致OS患者的生存率比較低。隨著OS切除手術(shù)以及輔助放化療技術(shù)的提高，OS患者的生存率得到一定改善，但因缺乏早期敏感與特異性的診斷標(biāo)記物，使得OS患者一旦發(fā)現(xiàn)多已發(fā)展到疾病的晚期，導(dǎo)致其復(fù)發(fā)率與死亡率仍居高不下，據(jù)報(bào)道晚期OS患者5年生存率僅為20%～30%[2]。因此，積極尋找OS患者高敏感度、高特異性的早期診斷標(biāo)記物就顯得尤為重要。微小RNA(microRNA，miRNA)是長(zhǎng)度為18～25個(gè)堿基序列的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA，其表達(dá)量與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3-4]。近年來(lái)，研究表明外周血miRNA在OS患者的早期診斷、準(zhǔn)確診斷以及微創(chuàng)診斷中具有重要作用[5]。miR-34a作為miRNA家族中的一員，屬于腫瘤家族中常見(jiàn)的抑癌基因。有報(bào)道m(xù)iR-34a在OS患者組織中表達(dá)明顯降低[6]，且在體外具有抑制OS細(xì)胞快速增殖和轉(zhuǎn)移的作用[7-8]，但是否在OS患者外周血中表達(dá)發(fā)生變化還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)OS患者外周血中miR-34a表達(dá)的變化，分析其表達(dá)與患者臨床病理特征以及生存率的關(guān)系，探討其在OS患者中的診斷及預(yù)后的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 前瞻性分析湖北省漢川市人民醫(yī)院2008年1月至2014年1月收治的OS患者54例，其中男23例，女31例；年齡10～30歲，平均(15.6±2.3)歲。腫瘤發(fā)生于股骨遠(yuǎn)端21例，脛骨近端28例，肱骨5例。納入標(biāo)準(zhǔn)：入院前未經(jīng)任何治療；組織病理診斷確診為OS；無(wú)其他腫瘤。排除標(biāo)準(zhǔn)：入院前已經(jīng)接受手術(shù)或放化療治療；臨床資料不完整；合并其他腫瘤；無(wú)自主行為能力。參考《骨肉瘤臨床循證診療指南》對(duì)所有骨肉瘤患者采取治療，同分期患者治療方法無(wú)差異?；颊叱鲈汉螅ㄟ^(guò)電話和復(fù)診的方式對(duì)患者進(jìn)行隨訪，隨訪截止時(shí)間為2019年4月，總生存時(shí)間指患者自第一次治療到卒于該腫瘤的時(shí)間(生存者按最后隨訪時(shí)間算)。所有患者及家屬簽署知情同意書(shū)并自愿配合本實(shí)驗(yàn)研究。選擇同期健康體檢者54例作為正常對(duì)照，其中男25例，女29例；年齡10～30歲，平均(16.3±2.1)歲。兩組性別、年齡等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本實(shí)驗(yàn)研究已獲得漢川市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 標(biāo)本制備 晨起收集所有檢測(cè)者靜脈血10 mL，血樣采集后立即放置于無(wú)DNA酶和RNA酶的滅菌采血真空管內(nèi)，自然放置，1 000 g/min，離心5 min，收集血清，將最終獲得的血清置于無(wú)RNA酶的Ep管中-80℃保存、備用。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)血清miR-34a 利用TRizol試劑盒(Invitrogen公司，美國(guó))提取血漿總RNA，使用紫外分光光度計(jì)鑒定RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Applied Biosystems公司)生成cDNA，反應(yīng)條件：65℃ 10 min；25℃ 6 min；冰浴2～5 min；45℃ 30 min；70℃ 10 min。反應(yīng)產(chǎn)物保存于-20℃下備用。以cDNA為模板通過(guò)qPCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：96℃ 18 s；60℃ 20 s；75℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)。選取U6為內(nèi)參，所有檢測(cè)結(jié)果均采用2-ΔCt的方法進(jìn)行分析。反應(yīng)中所使用的引物委托寶生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，其具體序列設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

2 結(jié) 果

2.1 OS患者與健康體檢者血清miR-34a表達(dá)的比較 與健康體檢者血清miR-34a表達(dá)量(2.21±0.97)相比，OS患者血清miR-34a表達(dá)水平(1.17±0.91)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 血清miR-34a表達(dá)對(duì)OS的診斷價(jià)值 通過(guò)ROC評(píng)估血清miR-34a是否能夠作為OS診斷的標(biāo)志物，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：曲線下面積(area under curve，AUC)為0.830(95%CI=0.751～0.908，P<0.01)；根據(jù)約登指數(shù)(cut-off)確定診斷OS的miR-34a臨界閾值即截?cái)嘀禐?.34，其診斷OS的靈敏度為79.6%、特異性是75.9%(見(jiàn)圖1)。

表1 miR-34a以及內(nèi)參U6引物序列

圖1 血清miR-34a表達(dá)的ROC曲線

2.3 OS患者血清miR-34a表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 以中位值0.87為分界點(diǎn)，將OS患者分為血清miR-34a高表達(dá)23例和血清miR-34a低表達(dá)31例。通過(guò)χ2檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，血清miR-34a表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期以及是否轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與性別、年齡和腫瘤位置無(wú)關(guān)(P>0.05，見(jiàn)表2)。將血清miR-34a作為因變量，腫瘤大小、TNM分期以及是否轉(zhuǎn)移作為自變量，進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果表明腫瘤是否轉(zhuǎn)移(P=0.001，OR=0.018)、TNM分期(P=0.021，OR=0.111)是影響miR-34a表達(dá)的獨(dú)立因素。

表2 單因素分析OS患者血清miR-34a表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 miR-34a表達(dá)對(duì)OS患者生存率的影響 通過(guò)Kaplan-Meier法和log-rank檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-34a低表達(dá)OS患者總生存率明顯低于miR-34a高表達(dá)患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003，見(jiàn)圖2)。

圖2 miR-34a表達(dá)對(duì)OS患者總生存率的影響

3 討 論

OS是一種起源于間葉組織的原發(fā)性骨腫瘤，惡性程度非常高。早期如果采取手術(shù)聯(lián)合放化療治療，其5年生存率接近50%～70%[9]；一旦沒(méi)有早期診斷發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致其發(fā)生轉(zhuǎn)移，其預(yù)后會(huì)很差，5年生存率僅為10%[10]。因此，早期發(fā)現(xiàn)并診斷OS對(duì)其治療和預(yù)后就顯得非常重要。OS現(xiàn)階段診斷主要依靠臨床表現(xiàn)的特點(diǎn)以及影像學(xué)檢查，但確診還是依賴(lài)于病理檢查觀察到的腫瘤細(xì)胞形成的骨樣組織[11]。很多OS患者早期臨床表現(xiàn)和影像學(xué)檢查并不明顯，因此單純的臨床表現(xiàn)和影像學(xué)檢查誤診率高且容易延遲診斷；病理檢查雖然是OS診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但具有創(chuàng)傷性，操作也不方便。因此，臨床上急需尋找到一種早期的、高效的、高敏感度的OS診斷標(biāo)志物。

miRNA為小非編碼RNA基因產(chǎn)物，在許多腫瘤中出現(xiàn)差異性表達(dá)，因此miRNA的表達(dá)分析已經(jīng)成為腫瘤診斷、治療以及預(yù)后判斷的重要生物學(xué)標(biāo)志物[12]。miR-34a為miR-34家族中的一員，通常作為一種抑癌miRNA發(fā)揮作用，其基因序列位于染色體lp36上，受到經(jīng)典的抑癌因子P53調(diào)控，影響細(xì)胞的衰老、凋亡、增殖等[13]。另外，有研究報(bào)道m(xù)iR-34a可以通過(guò)下調(diào)CDK4、CDK6、E2F3、E2F5、c-Met等基因的表達(dá)，發(fā)揮其腫瘤抑制的作用[14-16]。因此，在眾多惡性腫瘤中miR-34a表達(dá)減少或缺失，如金玲玲等[17]報(bào)道在宮頸癌患者血清中miR-34a-5p表達(dá)量降低，且在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起抑制作用；岳會(huì)珠等[18]報(bào)道乳腺癌組織中miR-34a低表達(dá)，并且與患者腫瘤分期、浸潤(rùn)深度、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及不良預(yù)后有關(guān)；李穎等[19]報(bào)道肝癌組織中miR-34a表達(dá)明顯低于正常肝組織，且腫瘤的惡性程度越高miR-34a的表達(dá)就越低。然而，關(guān)于miR-34a在OS患者血清中的表達(dá)水平以及與OS患者臨床病理特征及生存關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。

血清和血漿中miRNAs檢測(cè)正發(fā)展成為一類(lèi)新的潛在生化標(biāo)志物，用于非侵入性診斷和監(jiān)測(cè)癌癥的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后[20]。相比腫瘤組織標(biāo)本來(lái)講，血標(biāo)本更易獲取，對(duì)人體的傷害較小，并且miRNA在血標(biāo)本中穩(wěn)定表達(dá)、敏感性和特異性高。因此，血標(biāo)本中差異表達(dá)的miRNA有利于腫瘤的早期診斷、篩查以及指導(dǎo)治療。任慧文等[21]通過(guò)骨肉瘤血樣研究提示258個(gè)差異表達(dá)基因，其中miR99b-5p/miR124表達(dá)比可以作為診斷骨肉瘤的生物標(biāo)志物；馬草源等[22]報(bào)道骨肉瘤組織與外周血在miRNA表達(dá)上存在相關(guān)性和一致性，其中miR-21與miR-29表達(dá)的特異性最明顯，可以作為骨肉瘤早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。本研究通過(guò)檢測(cè)OS患者血清miR-34a表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-34a表達(dá)水平明顯低于健康者(P<0.01)，說(shuō)明miR-34a在OS患者血清中呈現(xiàn)低表達(dá)，提示miR-34a可能作為抑癌基因參與到OS的發(fā)生中，與其在其他腫瘤中的作用相似。ROC曲線是一種常見(jiàn)的評(píng)估診斷效能的方法，理想情況下AUC為1.0，此時(shí)特異性與敏感性皆為100%；當(dāng)AUC越接近1.0時(shí)診斷效能越高、預(yù)測(cè)越準(zhǔn)[23]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)ROC曲線對(duì)血清miR-34a診斷價(jià)值進(jìn)行評(píng)估時(shí)，AUC為0.830，當(dāng)診斷OS的miR-34a截?cái)嘀禐?.34時(shí)，其診斷骨肉瘤的靈敏度為79.6%、特異性是75.9%，說(shuō)明血清miR-34a表達(dá)水平是診斷骨肉瘤的潛在生物標(biāo)志物，具有較高的靈敏性和特異性。單因素與多因素分析血清miR-34a表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miR-34a表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期以及是否轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，而與性別、年齡和腫瘤位置無(wú)關(guān)(P>0.05)，且腫瘤是否轉(zhuǎn)移(P=0.001，OR=0.018)和TNM分期(P=0.021，OR=0.111)是影響miR-34a表達(dá)的獨(dú)立因素，表明腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移或分期越高，miR-34a表達(dá)越低，預(yù)后越差；反之預(yù)后越好。本研究成果對(duì)于OS外周血差異表達(dá)基因譜的建立以及OS早期診斷、靶向治療和預(yù)后的評(píng)估等具有非常重要的意義。但本實(shí)驗(yàn)僅局限于本院OS患者，樣本數(shù)量比較少，因此仍需要做大樣本的隨機(jī)實(shí)驗(yàn)研究；且miR-34a在OS中的具體作用機(jī)制還不清楚，有待于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步研究。

綜上所述，血清miR-34a水平可作為OS早期診斷、病情進(jìn)展及預(yù)后評(píng)估的生物學(xué)指標(biāo)，并有望為OS患者的治療提供新靶點(diǎn)，值得臨床推廣應(yīng)用。