黎真真, 陳飛任, 吳紅發(fā), 鐘有清

(1.海南省海口市婦幼保健院 麻醉科, 海南 ?？? 570102;2.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科, 海南 海口, 570102)

心肌缺血再灌注損傷(MIRI)是因多種病因?qū)е碌男募∪毖獕乃?，?yán)重者可出現(xiàn)心律失常、心功能障礙等，甚至導(dǎo)致死亡[1]。手術(shù)過程中心肌缺血發(fā)生率較高，適當(dāng)應(yīng)用麻醉劑可發(fā)揮心肌保護(hù)作用。研究[2-3]發(fā)現(xiàn)異丙酚可保護(hù)缺血的肝細(xì)胞，具有抗氧化功能，可清除MIRI中釋放的自由基。MIRI發(fā)生涉及多種細(xì)胞因子、信號通路，研究[4]表明，抑制氧自由基、炎癥因子的釋放能顯著減輕心肌缺血再灌注引起的細(xì)胞凋亡、壞死。高遷移率族蛋白1(HMGB1)是一種炎性因子，在氧化應(yīng)激等情況下可被釋放入血，與相應(yīng)的配體結(jié)合，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)及免疫細(xì)胞的遷移、分化等[5]。Toll樣受體4(TLR-4)屬于跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)家族蛋白，在免疫功能維持、炎性反應(yīng)中起到至關(guān)重要的作用[6], TLR-4與炎性反應(yīng)有關(guān)，可能參與了MIRI的發(fā)生。本研究擬通過建立大鼠MIRI模型，探討異丙酚是否對MIRI起保護(hù)作用，并研究該過程中HMGB1、TLR4蛋白的表達(dá)變化，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取60只清潔級Wista大鼠，鼠齡18～20周，雌雄不限，體質(zhì)量340～400 g, 由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(蘇)2012-0005, 使用許可證號為SYXK(蘇)2014-0030。動物處理及實驗過程得到海南省人民醫(yī)院動物關(guān)懷及使用委員會的許可(HNRMYY0012)。實驗研究過程中嚴(yán)格遵守3R原則。

1.2 主要儀器及試劑

兔抗鼠HMGB1、TLR4及β-actin單克隆抗體，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的第二抗體(Sigma公司，美國); TRIzol試劑盒(Invitrogen公司，美國); 逆轉(zhuǎn)錄、PCR試劑盒(大連寶生物，中國); 蛋白酶K溶液(上海生工技術(shù)有限公司，中國); 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)引物(上海生工技術(shù)有限公司，中國); 異丙酚(批號090822, 河北九派制藥有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 心肌缺血再灌注大鼠模型的建立及分組: 所有實驗動物在動物房進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。60只大鼠隨機(jī)分為4組，即假手術(shù)組(A組)、假手術(shù)聯(lián)合異丙酚組(B組)、心肌缺血再灌注組(C組)、心肌缺血再灌注聯(lián)合異丙酚組(D組)。A組采用常規(guī)戊巴比妥鈉30 mg/kg耳緣靜脈麻醉，消毒、鋪巾。行氣管插管，連接麻醉機(jī)，以混有30%氧氣的空氧混合氣體作為載體氣體，通氣流速(mL/min)=0.65×體質(zhì)量(g)。開胸，顯露心臟，于左心耳根部2 mm處穿線后，不夾閉左冠狀動脈前降支及心大靜脈, 60 min后縫合。B組手術(shù)開始前10 min靜脈泵入異丙酚6 mg/kg至術(shù)后60 min。C組麻醉后于胸骨左緣3～4肋間開胸，顯露心臟，于左心耳根部2 mm處用絲線夾閉左冠狀動脈前降支及心大靜脈，使心肌失去血液灌注，持續(xù)缺血30 min后，打開夾閉的動脈，再灌注120 min。D組手術(shù)開始前10 min靜脈泵入異丙酚 6 mg/kg至術(shù)后60 min。

1.3.2 HE染色: 實驗完畢后，解剖出心臟，取心肌組織，制備石蠟切片(4 μm), 二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，切片經(jīng)蒸餾水洗滌，放入蘇木精溶液染色數(shù)分鐘，經(jīng)酸水及氨水分色，伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明后用樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.3.3 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡率: 心肌標(biāo)本經(jīng)石蠟切片預(yù)處理，脫蠟、水化、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌，滴加蛋白酶K溶液100 μL室溫下孵育8 min，PBS洗滌; 在此基礎(chǔ)上滴加抗熒光素體和TUNEL標(biāo)志液，而后利用PBS沖洗3次, 5 min/次，經(jīng)緩沖液Ⅲ平衡后，室溫顯色，并滴加氮藍(lán)四唑/溴氯吲哚基磷酸鹽顯色及觀察。采用Leica QWin V3電腦圖像分析系統(tǒng)，觀察TUNEL陽性細(xì)胞并計數(shù)，計算凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比，得到心肌凋亡指數(shù)。

1.3.4 RT-PCR法檢測TNF-α和IL-6 mRNA水平: 采用超聲粉碎心肌組織細(xì)胞并采用PBS洗滌、溶解，然后根據(jù)TRIzol試劑盒提示一步法提取心肌細(xì)胞中RNA分子，測定RNA濃度和純度后，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。目標(biāo)引物序列參照Gene Bank, 由日本Takara公司合成，見表1。采用PCR擴(kuò)增儀，根據(jù)反應(yīng)要求配置反應(yīng)體系，包括SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)12.5 μL和上下游引物10 μmol/L各1.0 μL, 加反應(yīng)水至總體積為25.0 μL。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置: 95 ℃預(yù)退變 5 min, 95 ℃退變 30 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃ 30 s共30個循環(huán), 75 ℃讀取熒光，構(gòu)建溶解曲線。2-△△Ct法計算目標(biāo)引物mRNA的相對表達(dá)量。

表1 目標(biāo)引物序列和大小

1.3.5 Western Blot檢測HMGB1、TLR4蛋白量表達(dá): 解剖出心肌組織，加2 mL RIPA組織裂解液，勻漿，冰浴30 min, 40 ℃ 500×g離心5 min, 吸去上層液體，超聲波破核，再次離心，取上層液體10 μL待測。配膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，切膜，封閉液封閉1 h, 逐次兔抗鼠HMGB1、TLR4及β-actin單克隆抗體、HRP標(biāo)記的二抗。Bio-Rad成像儀曝光成像，Image Lab Software測定光密度，結(jié)果以目標(biāo)蛋白與參照蛋白條帶比值表示相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌組織病理學(xué)變化

在光學(xué)顯微鏡下, A組心肌組織排列整齊，細(xì)胞形態(tài)正常; B組心肌結(jié)構(gòu)正常，輕度水腫，少量炎癥細(xì)胞浸潤; C組、D組中心肌纖維變形和紊亂，心肌細(xì)胞腫脹、破裂以及炎性細(xì)胞浸潤。見圖1。

A: A組心肌組織; B: B組心肌組織; C: C組心肌組織，箭頭所指為心肌細(xì)胞破裂; D: D組心肌組織。

2.2 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況比較

TUNEL染色表明，凋亡的心肌細(xì)胞呈棕褐色。C組心肌凋亡指數(shù)為(0.39±0.05)%, 高于A組的(0.01±0.02)%、B組的(0.01±0.03)%、D組的(0.17±0.03)%, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=15.36、15.44、9.73,P<0.01)。見圖2。

A: A組心肌細(xì)胞排列規(guī)整，未見凋亡細(xì)胞; B: B組心肌細(xì)胞核完整，無凋亡細(xì)胞;C: C組可見大量凋亡細(xì)胞，呈褐色，箭頭所指為凋亡細(xì)胞; D: D組可見散在的棕褐色心肌細(xì)胞，但較C組少，箭頭所指為凋亡細(xì)胞;E: 各組心肌凋亡指數(shù)比較。與A組、B組比較, **P<0.01; 與C組比較, ##P<0.01。

2.3 各組TNF-α和IL-6的mRNA水平比較

A組大鼠心肌TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)水平與B組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05); C組、D組大鼠心肌TNF-α、IL-6的mRNA表達(dá)水平高于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=16.26、8.04、17.66、11.83,P=0.01、0.02、0.01、0.01); D組大鼠心肌TNF-α、IL-6的mRNA表達(dá)水平低于C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.04、8.55,P=0.03、0.04)。見圖3。

A: RT-PCR法檢測各組TNF-α mRNA的表達(dá)水平; B: RT-PCR法檢測各組IL-6 mRNA的表達(dá)水平;C: 各組TNF-α mRNA的表達(dá)水平比較; D: 各組IL-6 mRNA的表達(dá)水平比較。

2.4 各組大鼠心肌組織TLR4、HMGB1蛋白表達(dá)

A組大鼠心肌TLR4、HMGB1蛋白表達(dá)水平與B組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05); C組、D組大鼠心肌TLR4、HMGB1蛋白表達(dá)水平高于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=15.87、9.11、11.95、8.73,P<0.01); D組大鼠心肌TLR4、HMGB1蛋白表達(dá)水平低于C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.02、9.83,P=0.03、0.03)。見圖4。

A: Western Blot檢測HMGB1、TLR4蛋白量表達(dá); B: 各組HMGB1、TLR4蛋白定量結(jié)果比較。

3 討 論

異丙酚是臨床常用的全身麻醉誘導(dǎo)劑，具有起效快、副作用小等優(yōu)勢。研究[7]表明，異丙酚在肝、腎、腦等臟器損傷中可發(fā)揮保護(hù)作用。研究[8]表明，異丙酚可以保護(hù)心血管疾病手術(shù)患者的心血管系統(tǒng)。研究[9]表明，異丙酚對MIRI犬的心電傳導(dǎo)、心功能、心肌灌注具有保護(hù)功能。動物實驗[10]結(jié)果提示，異丙酚可抑制心肌纖維收縮，從而減少心肌耗能，同時異丙酚具有抗氧化作用，可維持細(xì)胞內(nèi)線粒體完整性。曹軍濤等[11]研究結(jié)果表明，異丙酚可減輕糖尿病大鼠MIRI導(dǎo)致的心肌細(xì)胞受損，保護(hù)大鼠心臟功能。本研究心肌組織HE染色結(jié)果提示，缺血再灌注的心肌細(xì)胞排列紊亂，胞漿染色不均勻，細(xì)胞核消失，呈空泡，心肌纖維排列松散、無序，肌纖維變性腫脹，間質(zhì)水腫，紅細(xì)胞滲漏，中性粒細(xì)胞浸潤，A組大鼠心肌正常，同時發(fā)現(xiàn)異丙酚預(yù)處理的大鼠心肌損傷較未使用異丙酚大鼠輕，TUNEL染色同樣表明異丙酚可減輕MIRI導(dǎo)致的心肌損害。

研究[12]表明，炎性反應(yīng)在MIRI中發(fā)揮重要的作用。TNF-α、IL-6是參與MIRI的重要炎性介質(zhì)。TNF-α為促炎因子，由心肌巨噬細(xì)胞和心肌細(xì)胞分泌[13]; TNF-α可抑制心肌細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞對葡萄糖的利用障礙。TNF-α還可以誘導(dǎo)IL-1、IL-6等大量合成，并通過一系列的通道，正反饋引起TNF-α的合成，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)[14]。

HMGB1屬于核蛋白家族，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)損傷、壞死或機(jī)體在炎性反應(yīng)的刺激下巨噬細(xì)胞釋放入血，與免疫細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，引起炎癥因子(TNF-α、IL-6)的分泌以及免疫細(xì)胞的遷移、分化等[15]。研究[16]表明, MIRI大鼠血清HMGB1含量明顯高于正常大鼠，靜脈滴注抗HMGB1抗體后可減輕心肌細(xì)胞損害。研究[17]提示, HMGB1預(yù)處理能減輕心肌MIRI程度，縮小心肌壞死范圍。TLR-4屬于跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)家族蛋白，在免疫功能維持、炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用[18], TLR-4可能也參與了HMGB1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究[19]表明，使用HMGB1抑制劑后，細(xì)胞可通過抑制TLR4/NF-κB通道蛋白減輕壞死性小腸結(jié)腸炎的癥狀。研究[20]提示維達(dá)立肽可通過TLR4/NF-κB/HMGB1通路保護(hù)缺血再灌注損傷的肝臟。研究[21]認(rèn)為，HMGB1可結(jié)合糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE), 進(jìn)而促進(jìn)TLR4和炎癥因子的分泌，而TLR4又可促進(jìn)HMGB1分泌。上述結(jié)果表明，HMGB1可通過TLR4信號通路促進(jìn)炎性反應(yīng)，參與細(xì)胞缺血再灌注損傷。

本研究結(jié)果表明，MIRI組大鼠心肌的TLR4、HMGB1、TNF-α、IL-6較正常大鼠顯著升高，而異丙酚預(yù)處理后的大鼠心肌TLR4、HMGB1、TNF-α、IL-6的表達(dá)水平顯著降低，表明靜脈注射異丙酚可保護(hù)缺血再灌注損傷的心肌，可能與異丙酚清除細(xì)胞產(chǎn)生的氧自由基、抑制HMGB1/TLR4通道的活性、降低炎性介質(zhì)TNF-α、IL-6的表達(dá)以及減輕炎性反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，異丙酚能顯著減輕MIRI大鼠的心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與異丙酚抑制HMGB1、LR4蛋白活性和減少炎性因子的釋放有關(guān)。