唐子琰，曾亞文，倪健，2*，董曉旭*（.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 02488；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，北京 00029）

雷公藤（Tripterygium wilfordiiHook.f.）是衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，有清熱解毒、祛風(fēng)通路、消腫止痛之功，雷公藤甲素是從其中提取的一種環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物，有顯著的抗腫瘤活性[1-2]。但傳統(tǒng)雷公藤甲素制劑水溶性較差、生物利用度低、給藥后被機(jī)體迅速吸收并被快速消除導(dǎo)致了其急性毒性的產(chǎn)生[3-4]。近年來，各種納米給藥系統(tǒng)的出現(xiàn)為解決上述問題提供了新思路，如聚合物膠束、脂質(zhì)體、納米水凝膠以及固體脂質(zhì)納米粒等[5-6]。但以上載體通常載藥量較低，只適于裝載特定性質(zhì)的藥物，例如聚合物膠束和固體脂質(zhì)納米粒適合裝載脂溶性藥物。因此尋找適宜的載藥系統(tǒng)，來實(shí)現(xiàn)藥物的高效裝載以及滿足臨床用藥需求是有意義的。

金屬有機(jī)骨架材料（MOFs）是一種配位聚合物材料，其由無機(jī)金屬離子與有機(jī)配體構(gòu)成，具有結(jié)構(gòu)多樣性、比表面積高、生物相容性好、不飽和金屬配位點(diǎn)多等特點(diǎn)，在吸附[7]、催化[8]、載藥[9]等方面有很大應(yīng)用前景。沸石型咪唑酯骨架材料（ZIFs）是MOFs 的一種，由過渡金屬原子與有機(jī)咪唑類及其衍生物自組裝形成的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)納米材料。其中ZIF-8 作為ZIFs 典型代表，其有很好的水熱穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性，較大的比表面積，較高的pH敏感性，開放的金屬位點(diǎn)，使其在藥物儲(chǔ)存和遞送方面具有廣闊的應(yīng)用前景。周偉強(qiáng)等[10]的研究中，含硒高分子與ZIF-8 復(fù)合材料多級(jí)響應(yīng)釋放藥物分子阿霉素，在低pH 值下阿霉素具有更好的選擇性釋放。曹鑫[11]研究表明，與SM-PGMA 相比，ZIF-8@SM-PGMA 的比表面積從34 m2·g－1提高到172 m2·g－1，平均孔徑從14.24 nm 縮小為5.16 nm，在水溶液中對苯酚的吸附量從23 mg·g－1提高到53 mg·g－1，提高了藥物吸附量，對拓展金屬有機(jī)骨架復(fù)合材料有意義。劉策等[12]實(shí)驗(yàn)表明，DOX@ZIF-8 在酸性環(huán)境中釋放效率明顯快于在中性環(huán)境中的釋放效率，呈現(xiàn)出優(yōu)異的酸響應(yīng)釋放性能。

基于以上思路，本研究制備金屬有機(jī)骨架藥物載體ZIF-8，考察ZIF-8 的不同制備工藝（物理攪拌法，超聲法及水熱合成法），對制備材料的結(jié)構(gòu)和形貌進(jìn)行表征，并用其裝載雷公藤甲素，確定最佳載藥工藝。

1 儀器與試藥

六水硝酸鋅（純度＞99.99%）、二甲基咪唑（純度＞99%）（阿拉丁試劑上海有限公司）；雷公藤甲素（純度：98%，南通飛宇生物科技有限公司）；甲醇、磷酸（分析純，北京化工廠）；Ultimate 3000 高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）；SB-5200 DTD 超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；XP 26 型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；SHA-BA恒溫水浴振蕩器（常州市國旺儀器制造有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 ZIF-8 材料的合成

2.1.1 水熱合成法制備ZIF-8 取Zn（NO3）2·6H2O（1 mmol）和二甲基咪唑（4 mmol），溶解于20 mL 甲醇中，轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯內(nèi)襯的高壓反應(yīng)釜中，單因素考察反應(yīng)溫度（130、150、170℃）對ZIF-8 合成的影響。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，離心（10 000 r·min－1，10 min），用甲醇洗滌沉淀，真空干燥（110℃，24 h），即得，計(jì)算產(chǎn)率，產(chǎn)率＝產(chǎn)品量/投藥量×100%。

結(jié)果顯示，130、150、170℃時(shí)ZIF-8 的產(chǎn)率（w%）分別為7.30%、5.50%、25.40%。在170℃時(shí)，產(chǎn)品顏色深，可能為原料在高溫下碳化，在使用水熱合成法時(shí)溫度應(yīng)控制在產(chǎn)品無異常顏色變化內(nèi)。

2.1.2 超聲合成法制備ZIF-8 精密稱取Zn（NO3）2·6H2O（1 mmol）和二甲基咪唑（4 mmol），溶解于20 mL 甲醇中，單因素考察超聲時(shí)間（0.5、1、2 h）對ZIF-8 合成的影響。室溫下反應(yīng)結(jié)束后，離心（10 000 r·min－1，10 min），用甲醇洗滌沉淀，真空干燥（110℃，24 h），即得，計(jì)算產(chǎn)率。

結(jié)果顯示，超聲時(shí)間為0.5、1、2 h 時(shí)ZIF-8 的產(chǎn)率（w%）分別為11.01%、10.98%、11.94%。結(jié)果表明，隨著超聲時(shí)間的延長，ZIF-8 產(chǎn)率變化不大，說明在超聲0.5 h 時(shí)ZIF-8 就已經(jīng)基本合成，在之后的時(shí)間里處于解體再合成的動(dòng)態(tài)平衡中。

2.1.3 物理攪拌法制備ZIF-8 精密稱取Zn（NO3）2·6H2O（1 mmol）和二甲基咪唑（4 mmol），溶解于20 mL 甲醇中，超聲功率為250 W，置磁力攪拌器反應(yīng)（600 r·min－1），單因素考察攪拌時(shí)間（12、24、48 h）對ZIF-8 合成的影響。室溫下反應(yīng)結(jié)束后，離心（10 000 r·min－1，10 min），用甲醇洗滌沉淀，真空干燥（110℃，24 h），即得，計(jì)算產(chǎn)率。

結(jié)果顯示，攪拌12、24、48 h 時(shí)ZIF-8 的產(chǎn)率（w%）分別為10.66%、10.02%、13.04%，在48 h 時(shí)產(chǎn)率最高?？赡茈S著攪拌時(shí)間的延長，增加了金屬簇與有機(jī)配體接觸的概率，ZIF-8 的產(chǎn)率增加，新生成的小粒子可以在晶體上繼續(xù)疊加。

2.2 ZIF-8 材料的表征

2.2.1 X 射線衍射（XRD） 用粉末X 射線衍射測定ZIF-8 晶體的分散狀態(tài)和晶體結(jié)構(gòu)。在Cu-Kα（λ＝1.541 nm），高壓40 kV，管流40 mA，掃描速度2°·min－1，2θ＝5～45°條件下進(jìn)行X-ray 粉末衍射，得到衍射圖譜。

3 種方法制備的ZIF-8 衍射峰均很強(qiáng)，說明材料具有較高的結(jié)晶度，由于物理攪拌法和超聲法得到的材料產(chǎn)率較高且較穩(wěn)定，且材料粉末烘干后無明顯因高溫而產(chǎn)生的焦化現(xiàn)象，故對攪拌法和超聲法的材料進(jìn)行XRD 表征。結(jié)果物理攪拌法攪拌12、24、48 h 時(shí)衍射峰無明顯差異；超聲法中超聲30 min、1 h、2 h 衍射峰具有明顯差異，且隨著超聲時(shí)間的延長，ZIF-8 特征峰越明顯（見圖1）。與此同時(shí)，不同制備方法合成的ZIF-8 的特征峰與模擬的ZIF-8 XRD 圖譜一致，這表明ZIF-8 晶體均已成功合成。

圖1 不同方法合成ZIF-8 的XRD 圖譜Fig 1 XRD patterns of the synthesis of ZIF-8 by different methods

2.2.2 掃描電子顯微鏡（SEM） 精密稱取ZIF-8 材料，用雙碳膠帶固定，在樣品表面噴碳25 min 后，掃描電子顯微鏡下觀察材料形貌特征，記錄SEM 圖譜。

由圖2～4 可知，水熱合成法中隨著反應(yīng)溫度的上升，ZIF-8 晶體逐漸致密。110 ℃時(shí)有大塊狀的晶體；130 ℃時(shí)，晶體為規(guī)則的立方體，表面平滑整潔。但隨著溫度的上升，在150、170 ℃在晶體表面出現(xiàn)了凹痕和塌陷。溫度過高或者過低都會(huì)影響ZIF-8 晶體形貌，適宜的溫度應(yīng)為130 ℃。超聲法中超聲0.5、1、2 h 制備的ZIF-8 晶體均為立方體，但與水熱合成法和物理攪拌法相比，晶體特征不明顯，周圍分散的尺寸也各異。物理攪拌法制備的ZIF-8 晶體最優(yōu)，且隨著攪拌時(shí)間的延長，晶體越來越立方化，且更加致密。

圖2 水熱合成法不同溫度下合成的ZIF-8 晶體形貌Fig 2 ZIF-8 crystal by hydrothermal synthesis method at different temperature

圖3 超聲法超聲不同時(shí)間合成的ZIF-8 晶體形貌Fig 3 ZIF-8 crystal synthesized by ultrasonic method in different time

2.2.3 比表面積儀（BET） 精密稱取ZIF-8 樣品30 mg，置于干燥的樣品管和編號(hào)的橡膠塞。對樣品預(yù)處理，抽真空、加熱、冷卻。預(yù)處理過的樣品垂直插入裝備液氮的比表面積儀，通過Gemini Ⅱ軟件設(shè)置參數(shù)，測定比表面積。

圖4 物理攪拌法攪拌不同時(shí)間合成的ZIF-8 晶體形貌Fig 4 ZIF-8 crystal synthesized by physical stirring method in different time

3 種制備方法制備ZIF-8 MOFs 的比表面積與孔體積有明顯差異，見表1。其中，物理攪拌法制備的ZIF-8 比表面積最大，孔徑適中，可能具備較優(yōu)的載藥性能，且耗能較低操作步驟較少，綜合XRD 及SEM 的結(jié)果，后續(xù)研究均采用物理攪拌法制備的ZIF-8。

表1 3 種制備方法合成ZIF-8 的BET 參數(shù)Tab 1 BET parameters of ZIF-8 MOFs synthesized by 3 preparation methods

2.2.4 紅外分光光度計(jì)（FTIR） 精密稱取ZIF-8 樣品2 mg，加溴化鉀分散，干燥壓片，在4000～500 cm－1范圍內(nèi)測定IR 光譜。

圖5結(jié)果表明：在3130 cm－1和2930 cm－1的吸收振動(dòng)峰是CH3基團(tuán)中C-H 鍵的不對稱吸收振動(dòng)峰，500～1500 cm－1的吸收振動(dòng)峰歸屬于咪唑環(huán)的面內(nèi)彎曲振動(dòng)吸收和伸縮振動(dòng)吸收，其中1150 cm－1和991 cm－1處的吸收峰為咪唑環(huán)上的C-N 的伸縮振動(dòng)峰，說明ZIF-8 材料保留著咪唑環(huán)的結(jié)構(gòu)。1580 cm－1的吸收振動(dòng)峰由C-N 鍵的伸縮振動(dòng)引起的，420 cm－1處的振動(dòng)峰是Zn-N鍵的伸縮振動(dòng)造成的。

圖5 物理攪拌法合成的ZIF-8 的FTIR 圖譜Fig 5 FTIR diagram of ZIF-8 synthesized by physical stirring method in different time

2.3 ZIF-8 裝載雷公藤甲素的研究

2.3.1 雷公藤甲素色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（50∶50），等度洗脫；檢測波長：218 nm；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3.2 雷公藤甲素線性考察 精密稱取雷公藤甲素10.00 mg，置10 mL 量瓶中，加入甲醇定容至刻度，制得1.00 mg·mL－1的雷公藤甲素母液。另精密量取母液適量，加入甲醇稀釋依次制備成質(zhì)量濃度為0.5、0.25、0.2、0.1、0.05 mg·mL－1的雷公藤甲素工作溶液。按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

雷公藤甲素對照品HPLC 圖譜見圖6。雷公藤甲素的回歸方程為y＝316.18x＋0.0727（R2＝0.9997），表明雷公藤甲素質(zhì)量濃度在0.05～1.00 mg·mL－1與峰面積線性關(guān)系良好。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，儀器精密度、方法重復(fù)性、準(zhǔn)確度和樣品穩(wěn)定性均符合含量測定要求。

圖6 雷公藤甲素對照品色譜圖Fig 6 HPLC chromatogram of triptolide

2.3.3 正交優(yōu)選最佳載藥工藝 稱取適量的ZIF-8 與不同質(zhì)量濃度的雷公藤甲素溶液，加入甲醇中攪拌反應(yīng)（600 r·min－1）不同時(shí)間，離心（4800 r·min－1，10 min），用甲醇洗滌沉淀2 次，收集上清液進(jìn)樣檢測雷公藤甲素含量。以載藥量與包封率為指標(biāo)，篩選最佳載藥工藝。分別考察影響載藥量的三個(gè)因素：載藥時(shí)間、藥物質(zhì)量濃度、藥載比，各因素設(shè)三個(gè)水平，采用L9（3）4試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平表見表2。載藥量＝（投藥量－上清量）/ZIF-8 總量×100%，包封率＝（投藥量－上清量）/投藥量×100%。

表2 因素水平表Tab 2 Factor level table

表3結(jié)果顯示，ZIF-8 載雷公藤甲素最佳工藝為A3B2C3，即載藥時(shí)間3 d，藥物濃度6 mg·mL－1，藥載比為5∶12 時(shí)，載藥量最高。表4結(jié)果表明，載藥量影響因素為C（藥載比）＞B（藥物濃度）＞A（載藥時(shí)間），其中藥載比對載藥工藝有顯著影響（P＜0.05）。

表3 雷公藤甲素載藥工藝直觀分析表Tab 3 Orthogonal intuitive analysis of triptolide loading process

表4 載藥工藝方差分析表Tab 4 Variance analysis table of loading process

按優(yōu)選條件進(jìn)行3 批樣品驗(yàn)證，3 批樣品載藥量分別為50.33%、49.16%、50.13%，均值為（49.87±1.26）%，包封率分別為71.31%、69.64%、71.02%，均值為（70.66±1.26）%。表明正交優(yōu)化的ZIF-8 載雷公藤甲素工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)金屬離子（六水合硝酸鋅）與有機(jī)配體（2-甲基咪唑）為4∶1 時(shí)，以甲醇為溶劑制備ZIF-8 晶體形貌較好，且孔徑較大。3 種方法均可成功制備ZIF-8，但超聲法、水熱合成法制備的晶體形貌不穩(wěn)定，易受溫度的影響，并伴隨較高的能耗。物理攪拌法制備的ZIF-8 晶體形貌較優(yōu)且穩(wěn)定，比表面積最大，利于后續(xù)藥物的高效裝載，因此選用物理攪拌法制備ZIF-8 來進(jìn)行后續(xù)載藥研究。

載藥工藝研究中，通過預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)藥載比、藥物濃度和載藥時(shí)間為影響載藥量的主要影響因素，因此本文以此為考察對象，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)優(yōu)化最優(yōu)載藥工藝。結(jié)果顯示，最優(yōu)載藥工藝的載藥量達(dá)到（49.87±1.26）%，包封率為（70.66±1.26）%，且載藥工藝穩(wěn)定可行。