余玲，劉葭，郝逗逗，郭子右，劉玉娟，吳清（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是當(dāng)前全球最常見的癌癥之一，其中潰瘍性結(jié)腸炎是結(jié)直腸癌發(fā)展的重要風(fēng)險(xiǎn)因素，約20%的癌癥是由于長期反復(fù)慢性炎癥刺激引起的[1]。研究如何抑制結(jié)直腸炎的發(fā)生，阻斷“炎-癌轉(zhuǎn)化”，對(duì)結(jié)直腸癌的預(yù)防有重要作用。因此，建立穩(wěn)定、可靠的炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌動(dòng)物模型具有非常重要的研究意義。目前該類模型可大致分為三類：化學(xué)誘導(dǎo)類，基因工程類和自發(fā)類[2]，其中化學(xué)誘導(dǎo)類應(yīng)用最廣泛。目前較為常見的用來建立炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌模型的造模誘導(dǎo)劑為 1，2- 二甲肼（1，2-dimethylhydrazine，DMH）、氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）聯(lián)合葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）。DMH/AOM 是構(gòu)建炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌模型常用的化學(xué)致癌劑，可以誘導(dǎo)大鼠/小鼠產(chǎn)生組織學(xué)表現(xiàn)類似于人散發(fā)性結(jié)直腸癌的結(jié)直腸腫瘤[3]，DSS 作為致炎劑的造模方法已經(jīng)比較成熟與穩(wěn)定，重復(fù)性好，在化學(xué)致癌劑與化學(xué)致炎劑的聯(lián)合作用下，能夠模擬炎癥性腸病逐漸發(fā)展為結(jié)直腸癌的“炎-癌轉(zhuǎn)化”過程[4]。

在結(jié)腸炎或炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌藥物防治研究中，目前研究報(bào)道最多的是以微丸為代表的口服固體制劑，如美沙拉嗪腸溶緩釋微丸等[5-8]。微丸是一種粒徑小于2.5 mm 的球狀或類球狀口服固體劑型，具有比表面積大、生物利用度高、便于分劑量及適于組合、通過包衣方式實(shí)現(xiàn)不同釋藥性能、釋藥行為的重現(xiàn)性與一致性良好的特點(diǎn)[9]。然而在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)藥效學(xué)研究方面，以微丸為代表的口服固體制劑存在給藥困難的問題，如制劑不能以常規(guī)方法粉碎、混懸后給藥，且實(shí)驗(yàn)動(dòng)物需要長期灌胃固體制劑，研究中常用的小鼠模型在此并不合適。通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前尚沒有明確、統(tǒng)一的炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌大鼠模型的造模方案，不同造模方案中致癌劑的劑量、致炎劑的濃度、大鼠品系等并不一致，如DMH 多在10～40 mg·kg－1，DSS 多在0.5%～3%，實(shí)驗(yàn)大鼠品系包括SD 大鼠、Wistar 大鼠、F344 大鼠等[10-15]。

當(dāng)歸湯為中醫(yī)治療慢性結(jié)腸炎的經(jīng)典方，首載于《外臺(tái)秘要·卷第二十五·數(shù)十年痢方一十一首》，文中記載“當(dāng)歸湯，療三十年下痢，止諸痛方，當(dāng)歸，生姜，大棗。上三味，以水四升，煮取一升半，分作三服，不瘥復(fù)作之”。前期研究并驗(yàn)證了當(dāng)歸超臨界提取物、酚酸類、多糖類的癌癥預(yù)防作用，并通過擠出-滾圓法制備當(dāng)歸有效組分微丸制劑[16-19]，當(dāng)歸、生姜超臨界提取物對(duì)2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS）誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型具有治療作用[20]。同時(shí)，Zhang 等[21]采用超速離心法制備生姜納米粒，能夠靶向于炎癥損傷黏膜、阻斷損傷因子促進(jìn)愈合因子，對(duì)DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎和AOM/DSS 誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌均有治療作用。大棗多糖可以改善TNBS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎程度，降低腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1β和IL-6 表達(dá)，抑制炎性反應(yīng)，增強(qiáng)腸屏障作用[22]。因此，當(dāng)歸湯提取物（揮發(fā)油類、姜辣素類、多糖類等）及其微丸制劑具有預(yù)防炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌的潛力。

因此，本研究設(shè)計(jì)DMH/DSS 復(fù)合法誘導(dǎo)Wistar 大鼠建立炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌模型的不同造模方案，通過對(duì)宏觀指標(biāo)的觀察和組織病理學(xué)檢查，判斷不同造模方案的造模效果，確定最佳造模方案。并以實(shí)驗(yàn)室自制的當(dāng)歸湯提取物及其微丸制劑給藥進(jìn)行藥效學(xué)評(píng)價(jià)，通過宏觀指標(biāo)、組織病理學(xué)檢查、炎癥因子指標(biāo)等，驗(yàn)證造模方法的可行性，以期為口服固體制劑應(yīng)用于炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌預(yù)防研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Bio Tek Epoch 全波長酶標(biāo)儀（美國Bio Tek公司）；紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；PB-10 型pH 計(jì)、BSA224S型電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；TS2-S-SM 光學(xué)顯微鏡（日本尼康公司）；ST 8R高速冷凍離心機(jī)（美國Thermo 公司）等。

1.2 試藥

DMH（梯希愛上海化成工業(yè)發(fā)展有限公司）；DSS（分子量36 000～50 000，美國MP 公司）；當(dāng)歸湯提取物、當(dāng)歸湯提取物微丸（實(shí)驗(yàn)室自制，當(dāng)歸湯提取物中：藁本內(nèi)酯含量為142.04 mg·g－1，6-姜辣素含量為81.89 mg·g－1，多糖含量為634.79 mg·g－1；當(dāng)歸湯提取物微丸中：藁本內(nèi)酯含量為18.63 mg·g－1，6-姜辣素含量為12.62 mg·g－1，多糖含量為246.95 mg·g－1）。福爾馬林固定液（北京博奧拓達(dá)科技有限公司）；生理鹽水（石家莊四藥有限公司）；CMC-Na（天津市福晨化學(xué)試劑廠）；TNF-α、IL-1β的ELISA 試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）。

1.3 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性Wistar 大鼠（5～6 周齡），購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0010。

2 方法

2.1 大鼠DMH/DSS 炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌模型的建立

2.1.1 動(dòng)物造模方法 將40 只雄性Wistar 大鼠在恒溫恒濕環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，隨機(jī)分為4組，每組10 只。分組及處理方法如下：

① 空白組：不進(jìn)行DMH/DSS 造模處理，正常攝食飲水。② 模型組1：自第1 周第1日起，每7日腹腔注射40 mg·kg－1DMH（以生理鹽水配制，NaHCO3調(diào)節(jié)pH 至6.5～7.0）一次，第1 周開始2% DSS 自由飲用7 d，蒸餾水自由飲水7 d，上述過程為一個(gè)循環(huán)（2 周），共重復(fù)4 個(gè)循環(huán)，共8 周。③ 模型組2：第1 周、第5 周、第9 周每周連續(xù)腹腔注射40 mg·kg－1DMH 3 次（第1、4、7日）。第2 周開始2% DSS 自由飲用7 d，然后蒸餾水自由飲水7 d，上述過程為一個(gè)循環(huán)（共2 周），共重復(fù)4 個(gè)循環(huán)，共8 周。④ 模型組3：在模型組1 的基礎(chǔ)上將2% DSS 全部換成3%DSS，其他造模步驟相同。實(shí)驗(yàn)過程中觀察各組大鼠毛發(fā)、體質(zhì)量、大便、耗水、及死亡情況。各組別飼養(yǎng)到第12、13 及14 周時(shí)，每周分別處死2 只大鼠進(jìn)行取材，通過觀察結(jié)直腸組織病理結(jié)果判斷取材時(shí)間，并于第14 周將所有剩余大鼠進(jìn)行取材處理。大鼠DMH/DSS 炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌模型建立方法如圖1所示。

圖1 大鼠DMH/DSS 炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌模型建立方法Fig 1 Establishment of DMH/DSS inflammation-related colorectal cancer rat models

2.1.2 動(dòng)物取材與指標(biāo)觀察 動(dòng)物飼養(yǎng)過程中，每周稱量大鼠體質(zhì)量并記錄。觀察大鼠健康狀況，肛門外觀形狀、大便、皮毛情況。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食24 h，自由飲水，水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血，剖開大鼠腹腔，取回盲竇處至肛門處的整段結(jié)直腸，拍照，徑向剖開腸壁，用生理鹽水清洗腸內(nèi)壁糞便。測量長度后，統(tǒng)計(jì)腫瘤個(gè)數(shù)，于腫瘤病灶處剪取10～20 mm 結(jié)直腸組織標(biāo)本，其中包括腫瘤組織及周邊正常組織，置 10%中性福爾馬林固定液中固定，置于干燥處保存，用于HE 染色實(shí)驗(yàn)。

2.1.3 HE 染色與組織病理學(xué)診斷 固定于10%中性福爾馬林固定液的結(jié)直腸組織，經(jīng)石蠟包埋，切片，HE 染色后，在顯微鏡下觀察組織病理變化，使用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠結(jié)腸組織各項(xiàng)特征，包括黏膜完整性，杯狀細(xì)胞排列情況，炎性浸潤情況，隱窩結(jié)構(gòu)改變，上皮內(nèi)瘤變的程度及腫瘤的形成情況。根據(jù)WHO 消化系統(tǒng)腫瘤分類進(jìn)行病理診斷，包括低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變和腺癌。

2.2 當(dāng)歸湯提取物及其微丸制劑藥效學(xué)評(píng)價(jià)

2.2.1 模型建立與實(shí)驗(yàn)分組 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機(jī)分為4 組，每組6 只：對(duì)照組（control）、模型組（model）、當(dāng)歸湯提取物組（簡稱提取物組，extract）、當(dāng)歸湯提取物微丸組（簡稱微丸組，pellet）。除對(duì)照組外，參照“2.1”項(xiàng)下確定的造模方法，飼養(yǎng)到第14 周取材。對(duì)照組在相同時(shí)間腹腔注射生理鹽水，實(shí)驗(yàn)期間自由飲用去離子水。

實(shí)驗(yàn)第1日，即第1 次腹腔注射DMH 當(dāng)日開始灌胃給藥，連續(xù)給藥14 周。微丸組采用自制微丸灌胃裝置給藥，提取物組使用灌胃針給藥。微丸灌胃方法如下：微丸倒入干燥的聚氯乙烯軟管中，軟管一段連接剪去針尖的注射器，另一端插入0.75% CMC-Na 溶液中，使用注射器吸取0.75% CMC-Na 溶液進(jìn)入軟管，反復(fù)推拉注射器活塞排氣泡，使微丸均勻分散于0.75% CMCNa 溶液，將軟管插入大鼠食道，推動(dòng)注射器活塞完成灌胃。實(shí)驗(yàn)期間，每周監(jiān)測大鼠體質(zhì)量，日常觀察大鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)情況與毛發(fā)。

2.2.2 動(dòng)物取材與指標(biāo)觀察 實(shí)驗(yàn)第14 周結(jié)束時(shí)取材，取材前大鼠禁食不禁水24 h，10%水合氯醛（3 mL·kg－1）腹腔注射麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，靜置，以3000 r·min－1離心10 min，收集上層血清，－80℃凍存待測；取出肛門至盲腸末端的整個(gè)腸段，測量長度；沿縱軸剖開結(jié)直腸，冰生理鹽水沖洗干凈后，用濾紙吸干，對(duì)腫瘤個(gè)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，測量腫瘤的長和寬，計(jì)算腫瘤體積[23][腫瘤體積＝（長×寬2）/2]，稱量整段結(jié)直腸質(zhì)量；組織固定于10%中性福爾馬林固定液中用于HE染色。計(jì)算結(jié)直腸重量/長度、腫瘤個(gè)數(shù)、腫瘤體積和腫瘤發(fā)生率。

2.2.3 HE 染色及組織病理學(xué)診斷 方法同“2.1.3”項(xiàng)下HE 染色及組織病理學(xué)診斷。

2.2.4 血清中促炎細(xì)胞因子的測定 按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β水平。

2.2.5 血清中鐵調(diào)素的測定 按照ELISA 試劑盒說明書檢測血清中鐵調(diào)素水平。

2.3 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為mean±SD，使用Graphpad 6.0進(jìn)行繪圖，采用one-way ANOVA 和Dunnetts 多重比較進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠DMH/DSS 炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌模型的建立

3.1.1 大鼠體質(zhì)量及一般生活狀況 實(shí)驗(yàn)過程中，空白組大鼠飲食、飲水正常，毛色光亮，糞便正常，未出現(xiàn)便血、黏液便、萎靡不振、厭食等癥狀。其他3 組模型組大鼠均出現(xiàn)明顯的肛門紅腫、肉眼可見便血、毛發(fā)干枯、活力下降的情況，無大鼠死亡。其中DSS 給藥時(shí)便血嚴(yán)重，停止給藥后癥狀緩解。各組大鼠體質(zhì)量變化曲線如圖2。空白組大鼠體質(zhì)量整體高于各模型組，各模型組之間無明顯差異。

圖2 各組大鼠體質(zhì)量變化曲線圖Fig 2 Rat mass change curves of each group

3.1.2 宏觀指標(biāo)分析 每組大鼠分別在第12 周取材2 只，空白組大鼠結(jié)直腸黏膜組織完整，模型組1 大鼠結(jié)腸表面有肉眼可見輕微凸起，無明顯菜花狀增生組織，黏膜輕微破壞，模型組2 肉眼可見凸起較為嚴(yán)重，黏膜部分破壞，模型組3 肉眼可見凸起、黏膜破壞均較為嚴(yán)重；在第13 周分別取材2 只，發(fā)現(xiàn)病理變化不明顯，與第12 周相近；飼養(yǎng)至第14 周分別取材2 只發(fā)現(xiàn)模型組1、2、3 結(jié)腸凸起均明顯，且以模型組3 最為嚴(yán)重，因此于14 周全部取材。14 周各組大鼠結(jié)直腸長度、腫瘤個(gè)數(shù)見圖3，與空白組相比，各模型組結(jié)直腸長度及腫瘤個(gè)數(shù)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖3 各組大鼠結(jié)直腸長度（A）與腫瘤個(gè)數(shù)（B）（n ＝6）Fig 3 Rat colorectal length（A）and tumor number（B） of each group（n ＝6）

3.1.3 組織病理學(xué)分析 HE 染色結(jié)果顯示，第12 周時(shí)，空白組黏膜完整，隱窩結(jié)構(gòu)正常，杯狀細(xì)胞排列整齊，間質(zhì)內(nèi)可見少量淋巴細(xì)胞浸潤；模型組1 大部分黏膜完整，隱窩結(jié)構(gòu)正常，排列整齊，間質(zhì)內(nèi)可見少量淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，血管充血。黏膜下層可見明顯的淋巴濾泡。局灶表面上皮腺體結(jié)構(gòu)不規(guī)則，排列紊亂，考慮為炎癥反應(yīng)性改變；模型組2 部分顯示低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變，部分顯示高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變，部分顯示腺癌，侵至黏膜下層，靠近腸壁固有肌層；模型組3 部分顯示高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變，部分顯示腺癌，侵至黏膜下層。第14 周時(shí)，空白組黏膜結(jié)構(gòu)完整，隱窩結(jié)構(gòu)尚可，黏膜間質(zhì)內(nèi)可見局灶淋巴細(xì)胞浸潤及淋巴濾泡形成；模型組1 可見低至中分化腺癌侵襲至漿膜層；模型組2、3 均已發(fā)展為腺癌，侵至固有肌層。各類型腫瘤的HE 染色如圖4所示。模型組1 與模型組2 比較可知，每周注射一次與一周連續(xù)注射三次的方法其模型結(jié)果相似，但是實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)每周注射一次DMH，其大鼠活動(dòng)狀態(tài)等相關(guān)可視化指標(biāo)更加穩(wěn)定，因此，選擇每周腹腔注射DMH 一次。大鼠飲用DSS 的濃度、周期與造模結(jié)果關(guān)系密切，模型組1 中使用2% DSS，于12 周時(shí)取材時(shí)大鼠的結(jié)直腸均處于炎癥狀態(tài)，而14 周時(shí)是早期腺癌，推測在12 周至14 周飼養(yǎng)過程中體現(xiàn)“炎-癌轉(zhuǎn)化”的變化過程，模型組3 使用3% DSS，于12周時(shí)已經(jīng)表現(xiàn)出腺癌，說明其在12 周之前已經(jīng)發(fā)生癌前病變，從經(jīng)濟(jì)角度和實(shí)驗(yàn)周期綜合考慮，確定模型組1 的造模方案為最佳造模方案。

3.2 當(dāng)歸湯提取物及其微丸藥效學(xué)評(píng)價(jià)

3.2.1 大鼠體質(zhì)量及一般生活狀況 實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)照組大鼠飲食飲水正常，精神狀態(tài)良好，活潑好動(dòng)，毛發(fā)有光澤，糞便正常。在飲用2% DSS的第1、3、5、7 周，模型組與各給藥組炎癥反應(yīng)明顯，均可見不同程度的腹瀉和肉眼血便，改為飲用去離子水后，腹瀉與肉眼血便情況均得到緩解。如圖5所示，各組大鼠體質(zhì)量在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)均呈上升趨勢。模型組大鼠體質(zhì)量增長最緩，各給藥組大鼠體質(zhì)量在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)均高于模型組。

3.2.2 結(jié)直腸重量/長度 疾病狀態(tài)下結(jié)直腸縮短和/或腫瘤生成均會(huì)引起結(jié)直腸重量/長度比值增大，一定程度上可以反映疾病的嚴(yán)重程度。各組大鼠結(jié)直腸重量/長度見圖6。由圖6可知，與對(duì)照組相比，模型組大鼠的結(jié)直腸重量/長度顯著增加（P＜0.01）；各給藥組大鼠的結(jié)直腸重量/長度與模型組相比顯著降低（P＜0.01），而與對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中微丸組的結(jié)直腸重量/長度與對(duì)照組最接近。

3.2.3 腫瘤發(fā)生情況和組織病理學(xué)分析 各組大鼠結(jié)直腸宏觀狀態(tài)見圖7，腫瘤個(gè)數(shù)和體積見圖8，腫瘤發(fā)生率見表1。對(duì)照組大鼠結(jié)直腸黏膜完整光滑，沒有腫瘤發(fā)生；模型組大鼠結(jié)直腸均肉眼可見腫瘤狀突起，平均腫瘤數(shù)為（9.83±4.22）個(gè)，平均腫瘤體積為（199.49±97.28）mm3，腫瘤發(fā)生率為100%（6/6）。與模型組相比，提取物組和微丸組大鼠的腫瘤個(gè)數(shù)顯著減少（P＜0.01），腫瘤體積顯著減?。≒＜0.01，P＜0.0001），腫瘤發(fā)生率（均為66.7%）降低，且微丸組效果優(yōu)于提取物組。

表1 各組大鼠腫瘤發(fā)生率(n ＝6，%)Tab 1 Tumor incidence rate of rats of each group (n ＝6，%)

結(jié)直腸組織HE 染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠結(jié)直腸組織黏膜完整，隱窩結(jié)構(gòu)正常，排列整齊，杯狀細(xì)胞充足，有少量炎性細(xì)胞浸潤，沒有腫瘤發(fā)生。模型組與各給藥組的腫瘤惡性程度有所差異，模型組均為腺癌，可見低至中分化腺癌侵襲至漿膜層；提取物組和微丸組腫瘤均截止至上皮內(nèi)瘤變階段，微丸組僅可見低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變，其腫瘤惡性程度改善效果最好。

3.2.4 大鼠血清炎癥因子水平 各組大鼠血清中TNF-α和IL-1β水平見圖9。與對(duì)照組相比，模型組大鼠血清中TNF-α和IL-1β水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，各給藥組大鼠血清中兩種炎癥因子水平顯著降低（P＜0.01）。微丸組的兩種炎癥因子水平低于提取物組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 各類型結(jié)直腸病理變化HE 染色切片圖像（×100）Fig 4 Image of HE staining slices of pathological changes in colorectal tissue（×100）

圖5 各組大鼠體質(zhì)量變化曲線（n ＝6）Fig 5 Rat mass change curves of each group（n ＝6）

圖6 各組大鼠結(jié)直腸重量/長度（n ＝6）Fig 6 Colorectal weight/length of rats of each group（n ＝6）

圖7 各組大鼠結(jié)直腸宏觀形態(tài)Fig 7 Colorectal macromorphology of rats of each group

3.2.5 大鼠血清鐵調(diào)素水平 各組大鼠血清鐵調(diào)素表達(dá)情況見圖10。與對(duì)照組相比，模型組大鼠血清鐵調(diào)素含量顯著增加（P＜0.01）。與模型組相比，提取物組與微丸組的鐵調(diào)素水平均顯著降低（P＜0.01）。同時(shí)微丸組的鐵調(diào)素水平低于提取物組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖8 各組大鼠腫瘤個(gè)數(shù)（A）與腫瘤體積（B）（n ＝6）Fig 8 Tumor number（A）and tumor volume（B）of rats of each group（n ＝6）

圖9 各組大鼠血清炎癥因子TNF-α（A）、IL-1β（B）（n ＝6）Fig 9 Inflammatory cytokines TNF-α（A）and IL-1β（B）in the serum of rats of each group（n ＝6）

圖10 各組大鼠血清鐵調(diào)素（n ＝6）Fig 10 Serum hepcidin of rats of each group（n ＝6）

4 討論

近年來炎癥相關(guān)的散發(fā)性結(jié)腸癌動(dòng)物模型得到了很快的發(fā)展，以化學(xué)誘導(dǎo)類模型的應(yīng)用最為普遍，DMH/AOM 聯(lián)合DSS 是常用的化學(xué)誘導(dǎo)劑，此類模型具有簡單易行，重現(xiàn)性好，具有與人類潰瘍性結(jié)腸炎癌變相似的特點(diǎn)，是其發(fā)病機(jī)制研究及防治藥物療效評(píng)估的比較理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[24-25]，目前主要使用小鼠作為研究對(duì)象，然而小鼠模型應(yīng)用于以微丸為代表的口服固體制劑的藥效研究具有局限性，大鼠模型文獻(xiàn)雖然有報(bào)道，但是造模方法差異大，因此探索大鼠炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌模型造模方法同樣具有重要的研究意義。

在前期實(shí)驗(yàn)中參考課題組建立的小鼠模型造模方法[17，26]及文獻(xiàn)報(bào)道的大鼠造模方法[15]，使用SD 大鼠進(jìn)行造模均未能成功復(fù)制模型，可能與SD 大鼠適應(yīng)性及抗病能力較強(qiáng)有關(guān)[27]。通過相關(guān)文獻(xiàn)研究，擬確定使用DMH/DSS 化學(xué)誘導(dǎo)法建立炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌Wistar 大鼠模型，并擬定不同的造模方案。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)可以大致確定取材時(shí)間為12 周至15 周，因此從第12 周開始每周隨機(jī)選取2 只大鼠進(jìn)行取材判斷造模效果，至明顯病變周期時(shí)結(jié)束飼養(yǎng)。從空白組和各模型組大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，DMH/DSS 聯(lián)合誘導(dǎo)能夠建立炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌模型，40 mg·kg－1劑量的DMH 能夠有效發(fā)揮致癌作用，且隨著注射次數(shù)增加，致癌作用明顯。同時(shí)在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Wistar 大鼠、F344 大鼠均能建立較為穩(wěn)定的炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌模型，而Wistar 大鼠更為經(jīng)濟(jì)，且同一周齡其體型比F344 大鼠大，更適合用于以微丸為代表的口服固體制劑研究，因此考慮以Wistar 大鼠作為造模對(duì)象。

基于所確定的DMH/DSS 誘導(dǎo)的大鼠炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌模型造模方法，通過實(shí)驗(yàn)室自制的當(dāng)歸湯提取物及其微丸制劑的藥效學(xué)研究驗(yàn)證造模方法的可行性。結(jié)果顯示，模型組平均腫瘤數(shù)、平均腫瘤體積、腫瘤發(fā)生率均高于其他組，腫瘤已發(fā)展至腺癌階段，其中平均腫瘤數(shù)為（9.83±4.22）個(gè)。藥物干預(yù)能夠減少結(jié)直腸腫瘤個(gè)數(shù)和體積，降低腫瘤發(fā)生率，延緩癌癥發(fā)展程度，其中微丸組對(duì)DMH/DSS 誘導(dǎo)的大鼠炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的預(yù)防作用比提取物組效果更明顯，腫瘤截止至低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變階段。本文以TNF-α、IL-1β為指標(biāo)，從抑制炎癥反應(yīng)角度探討預(yù)防結(jié)直腸癌的作用機(jī)制。促炎細(xì)胞因子TNF-α與IL-1β是促進(jìn)炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的重要介質(zhì)，即使結(jié)直腸癌已經(jīng)發(fā)生，阻斷TNF-α也可以抑制其進(jìn)展，提示靶向于TNF-α的藥物可能對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎引起的結(jié)直腸癌具有治療作用[28]。中性粒細(xì)胞浸潤是慢性結(jié)腸炎及相關(guān)結(jié)直腸癌的重要特征，浸潤的中性粒細(xì)胞能夠分泌大量的IL-1β，阻斷IL-1β活性可以顯著減少黏膜損傷及腫瘤形成[29]。本研究結(jié)果表明，DMH/DSS 誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌模型大鼠血清中TNF-α和IL-1β水平顯著升高，經(jīng)藥物干預(yù)后，兩者水平明顯降低，其中微丸組的作用最明顯。此外，鐵代謝異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。鐵調(diào)素是鐵代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在多種類型癌癥患者體內(nèi)存在高表達(dá)，如乳腺癌、腎癌、肺癌、前列腺癌、胃癌和結(jié)直腸癌[30]，因此本文以鐵調(diào)素為指標(biāo)，嘗試從調(diào)節(jié)鐵代謝角度探討預(yù)防結(jié)直腸癌的作用機(jī)制。結(jié)果表明，DMH/DSS 誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌模型大鼠血清中鐵調(diào)素水平顯著升高，微丸組在改善鐵調(diào)素表達(dá)方面的作用優(yōu)于提取物組。

綜上所述，本研究建立的炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌大鼠模型，其造模方法簡單易行，重現(xiàn)性好，能夠用于口服固體制劑的藥效學(xué)研究，可以為炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌防治藥物（尤其是口服固體制劑）的篩選與評(píng)價(jià)提供一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持與參考。