王珊，劉亞倩，侯敏娜，王青，劉艷紅，陳衍斌，彭修娟，許海燕*（.陜西國際商貿學院，陜西 咸陽 7046；.陜西步長制藥有限公司，西安 70075）

腦卒中后PSCI（post-stroke cognitive impairment，PSCI）泛指在卒中后6 個月內出現(xiàn)認知障礙表現(xiàn)的一系列綜合征，其會影響患者的記憶力、執(zhí)行力，增加致殘率、病死率、卒中再發(fā)率，嚴重影響患者的日常生活，降低患者生活質量，嚴重者可發(fā)展為阿爾茨海默癥（AD），給患者家庭和社會帶來巨大的經濟負擔[1]。中醫(yī)將PSCI 歸于呆病范疇，認為其病位在腦，關乎肝、腎、心、脾，腎虧為本，五臟相關；以精虧為本，以痰瘀為標；以腎精虧虛、氣血虧虛、痰濁阻竅、瘀血阻絡為臨床常見證型[2]。中醫(yī)治療以補腎填精、活血化瘀、開竅化痰為主[1]。龍生蛭膠囊是由黃芪、水蛭、川芎、當歸、紅花、地龍、刺五加等12 味中藥組成的中成藥制劑，具有補氣活血、逐瘀通絡的功效，臨床主要應用于動脈粥樣硬化性腦梗死的恢復期，中醫(yī)辨證為氣虛血瘀型中風經絡者的治療[3]。龍生蛭膠囊自上市后在治療腦卒中及防止、減輕PSCI 方面療效確切，安全性高，臨床反應良好，尤其是對氣虛血瘀型血管性癡呆患者認知功能改善方面效果極佳[4-6]。但是目前有關龍生蛭膠囊治療PSCI 的作用機制研究甚少。根據(jù)中醫(yī)理論可將龍生蛭膠囊方中各藥分為活血化瘀藥（水蛭、川芎、紅花、桃仁），補虛藥（黃芪、當歸、刺五加），清熱藥（赤芍），其他藥（木香、石菖蒲、地龍、桑寄生）。結合PSCI 發(fā)病機制其以虛證為本的中醫(yī)病機，本文推測龍生蛭膠囊具有防治PSCI 的作用機制可能與方中補虛藥組有緊密的相關性。因此本研究嘗試通過拆方的形式，以方劑中補虛藥組—— “黃芪-當歸-刺五加”為研究對象，通過動物實驗結合網(wǎng)絡預測的形式來揭示龍生蛭膠囊治療PSCI 的作用機制，為龍生蛭膠囊的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 “黃芪-當歸-刺五加”藥組治療PSCI 的實驗研究

1.1.1 材料 “黃芪-當歸-刺五加”藥組（黃芪、當歸、刺五加3 味藥的劑量同方劑中的劑量，由陜西步長制藥提供，經陜西國際商貿學院雷國蓮教授鑒定）。尼莫地平片（天津市中央藥業(yè)有限公司，批號： 170618）；丙二醛（MDA，批號：20160901）、超氧化物歧化酶（SOD，批號：20160919）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Morris 水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)（成都泰盟）。

1.1.2 動物分組、造模期藥物干預 60 只健康雄性SPF 級SD 大鼠[西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心，動物許可證號 SYXK-R（陜）2012-003]，體質量（220±23）g，動物實驗經陜西國際商貿學院實驗動物倫理委員會批準。大鼠適應性飼養(yǎng)1周后按照體質量隨機分組，分為模型組，假手術組，尼莫地平組，龍生蛭膠囊高、中、低劑量組。采用血管內拴線阻斷法永久性阻斷左側大鼠大腦中動脈，制成大鼠腦缺血性中風模型[7-8]。假手術組大鼠進行相同操作，但不夾閉血管，不插入栓線。手術后出現(xiàn)對側的前爪無法充分伸展活動、出現(xiàn)向外側轉圏、無法正常行走或行走時向對側傾倒的大鼠認為造模成功，并進行下一步的實驗研究。

模型組灌胃給予10 mL·kg－1的生理鹽水；尼莫地平組灌胃給予1.2 g·L－1的尼莫地平混懸液；“黃芪-當歸-刺五加”藥組給藥量根據(jù)臨床常用劑量，按照人和動物間體表面積折算的等效劑量比值進行換算，分別得到“黃芪-當歸-刺五加”藥組低劑量 0.24 g·kg－1、中劑量0.48 g·kg－1、高劑量 0.96 g·kg－1。每日灌胃1 次，共灌胃12 d，從給藥第 10日起按照學習記憶訓練的方法進行訓練，連續(xù)訓練3 d；于給藥第 12日進行水迷宮檢測實驗。

1.1.3 Morris 水迷宮實驗 實驗分為定位航行實驗和空間探索實驗兩部分，實驗前先進行訓練3 d。大鼠每日訓練一次，分別從4 個不同入水點面壁入水。定位航行實驗：每只大鼠從任意一個入水點入水，記錄大鼠120 s 內找到平臺所需的時間（即潛伏期），若120 s 內沒有找到平臺，逃避潛伏期計為120 s?？臻g搜索實驗：定位航行實驗 3 h 后撤出平臺，由任意一個入水點將大鼠面向池壁放入水中。記錄大鼠120 s 內穿過原平臺位置的次數(shù)和在原平臺象限游泳時間占總時間（120 s）的百分比。

1.1.4 血清SOD 活性和MDA 含量檢測 實驗結束后，麻醉大鼠，腹主動脈取血，離心取血清，按照試劑盒方法測定SOD 活性和MDA 含量。

1.2 基于TCMIP V2.0 分析“黃芪-當歸-刺五加”藥組治療PSCI 的作用機制

1.2.1 化學成分來源 在TCMIP V2.0 平臺（www.tcmip.cn）的中藥材數(shù)據(jù)中搜索“黃芪”“當歸”和“刺五加”，收集3 種中藥材的化學成分及所對應的靶標，建立龍生蛭膠囊中“黃芪-當歸-刺五加”藥組的化學成分數(shù)據(jù)庫。

1.2.2 候選靶標來源 在TCMIP V2.0 平臺的疾病分子相關數(shù)據(jù)庫中，以“post-stroke cognitive impairment”作為疾病關鍵詞進行搜索，收集PSCI 的所有靶標，作為候選疾病靶標。在中藥靶標預測功能模塊中通過化學成分二維結構（.mol或.sdf）相似性與美國食品藥品管理局（FDA）上市藥物進行比對，以Tanimoto 系數(shù)定義的相似度計量方法進行相似性打分，選擇相似性分數(shù)≥0.8的藥物所對應的靶標為“黃芪-當歸-刺五加”藥組潛在候選靶標。

1.2.3 網(wǎng)絡構建和關鍵網(wǎng)絡靶標基因功能挖掘分析 通過TCMIP V2.0 平臺中的中醫(yī)藥關聯(lián)網(wǎng)絡挖掘工具，基于目標疾病基因（PSCI）和中藥（黃芪-當歸-刺五加）候選靶標之間的相互作用信息，可構建“疾病基因-藥物靶標分子網(wǎng)絡”。該平臺通過計算網(wǎng)絡節(jié)點的連接度（Degree）、介度（Betweenness）和緊密度（Closeness），篩選網(wǎng)絡中的核心節(jié)點基因，并實現(xiàn)核心節(jié)點網(wǎng)絡的可視化。根據(jù)中藥材-中藥成分-核心靶標-通路-疾病之間的關聯(lián)性，任意選擇不同類型的節(jié)點，構建多維關聯(lián)網(wǎng)絡圖并對其進行分析挖掘得到“黃芪-當歸-刺五加”干預PSCI 的可能有效成分、靶標及通路。

2 結果

2.1 “黃芪-當歸-刺五加”藥組治療PSCI 的實驗研究

2.1.1 對腦卒中大鼠行為學的影響 在定位航行實驗中，與假手術組相比，模型組大鼠的逃避潛伏期顯著延長、尋臺次數(shù)均明顯減少；與模型組相比，尼莫地平組、“黃芪-當歸-刺五加”藥組各劑量組的逃避潛伏期顯著縮短，尼莫地平組和“黃芪-當歸-刺五加”藥組中劑量組尋臺次數(shù)均明顯增加。在空間探索實驗中，與假手術組比較，模型組穿越原平臺次數(shù)、原平臺象限游泳時間占總游泳時間百分比均顯著減少；與模型組比較，尼莫地平組和“黃芪-當歸-刺五加”藥組中劑量組穿越原平臺次數(shù)均明顯增加，尼莫地平組和“黃芪-當歸-刺五加”藥組各劑量原平臺象限游泳時間占總游泳時間百分比均明顯增加，結果見表1。

表1 “黃芪-當歸-刺五加”藥組對大鼠水迷宮實驗的影響(±s，n ＝10)Tab 1 Effect of Astragalus-Angelica sinensis-Schisandra chinensis drug group on Morris water maze test in rats (±s，n ＝10)

表1 “黃芪-當歸-刺五加”藥組對大鼠水迷宮實驗的影響(±s，n ＝10)Tab 1 Effect of Astragalus-Angelica sinensis-Schisandra chinensis drug group on Morris water maze test in rats (±s，n ＝10)

注：與假手術組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。Note：Compared with the sham group，**P ＜0.01；compared with the model group，△P ＜0.05，△△P ＜0.01.

組別 逃避潛伏期/s 尋臺次數(shù)/次 穿越原平臺次數(shù)/次 原平臺象限游泳時間占總游泳時間百分比/%假手術組 38.5±5.82 4±1.16 7±2.05 32.33±9.09模型組 52.7±5.33** 1.7±0.95** 2.4±1.17** 19.08±5.02**尼莫地平組 39.6±5.62△△ 2.5±0.97△ 6.0±1.76△△ 28.08±5.20△△“黃芪-當歸-刺五加”高劑量組 46.9±5.34△ 1.8±0.79 3.7±1.64 25.25±7.54△“黃芪-當歸-刺五加”中劑量組 44.6±5.85△△ 2.4±0.97△ 4.0±1.25△△ 27.83±9.79△“黃芪-當歸-刺五加”低劑量組 45.7±6.58△ 1.6±0.70 3.0±1.33 27.33±8.90△

2.1.2 對腦卒中大鼠血清生化學的影響 與假手術組相比，模型組SOD 活性顯著降低、MDA 含量顯著升高；與模型組比較，尼莫地平組、“黃芪-當歸-刺五加”各劑量組能明顯提高SOD 活性和降低MDA 含量，結果見表2。

表2 “黃芪-當歸-刺五加”藥組對大鼠血清中SOD、MDA 水平的影響(±s，n ＝10)Tab 2 Effect of Astragalus-Angelica sinensis-Schisandra chinensis drug group on SOD and MDA of rats serum(±s，n ＝10)

表2 “黃芪-當歸-刺五加”藥組對大鼠血清中SOD、MDA 水平的影響(±s，n ＝10)Tab 2 Effect of Astragalus-Angelica sinensis-Schisandra chinensis drug group on SOD and MDA of rats serum(±s，n ＝10)

注：與假手術組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05。Note：Compared with the sham group，*P ＜0.05；compared with the model group，△P ＜0.05.

組別 SOD/U·mL－1MDA/μmol·L－1假手術組 86.93±28.65 4.34±0.59模型組 60.34±25.71* 5.01±0.52*尼莫地平組 87.73±25.77△ 4.53±0.48△“黃芪-當歸-刺五加”高劑量組 83.72±22.98△ 4.58±0.30△“黃芪-當歸-刺五加”中劑量組 81.42±17.05△ 4.42±0.64△“黃芪-當歸-刺五加”低劑量組 81.79±13.00△ 4.50±0.49△

2.2 龍生蛭膠囊中“黃芪-當歸-刺五加”藥組治療PSCI 作用機制的整合藥理學分析

2.2.1 “黃芪-當歸-刺五加”藥組治療PSCI 的“藥物靶標-疾病靶標”核心網(wǎng)絡分析 共得到166 個與認知障礙以及藥物相關核心網(wǎng)絡靶標，其中藥物相關靶標48 個，與疾病相關靶標118 個。同時利用 PPI 模塊構建核心網(wǎng)絡靶標圖（見圖1），平臺設定同時滿足大于節(jié)點“連接度”“介度”“緊密度”的中位數(shù)為卡值，得到關鍵核心靶標75個，藥物與疾病的共有靶標11 個（AKT1、TP53、SDHA、SDHC、SDHB、SDHD、CHRM3、ATP1A3、SCN8A、GNAS、UQCRC2）。

2.2.2 “黃芪-當歸-刺五加”藥組治療PSCI 的“中藥-靶標-通路-疾病”網(wǎng)絡可視化圖分析運用整合藥理學平臺獲得了“黃芪-當歸-刺五加”藥組干預PSCI 的關鍵核心靶標，推測“黃芪-當歸-刺五加”藥組可能是通過作用于藥物與疾病共有靶標來發(fā)揮對PSCI 的干預作用進而發(fā)揮藥效，并利用核心靶標及其與中藥成分和疾病之間的關系繪制 “中藥-成分-關鍵藥靶-通路”網(wǎng)絡可視化圖（見圖2），干預PSCI 的關鍵靶標75 個，主要與27 個化學成分有關，其中刺五加21 個，分別為刺五加苷A、B、C1、D1、D2、I、K、L、蒼耳苷、丁香酸、齊墩果酸、樺木酸、熊果酸等；當歸4 個，分別為棕櫚酸、肉豆蔻酸、二十四酸、豆甾醇-β-D-葡糖苷；黃芪3 個，分別為黃芪甲苷Ⅲ、華良姜素、棕櫚酸。

核心靶標基因功能涉及蛋白質去泛素化、G2/M 過渡有絲分裂細胞周期、自噬調節(jié)、線粒體電子傳輸、質子跨膜轉運、睫狀基體-質膜對接、電子傳輸鏈、凋亡過程、核苷酸切除修復等。作用靶點主要參與核受體轉錄途徑、SLC2A4（GLUT4）向質膜的轉運、TP53 調控DNA 修復基因的轉錄、基底體與質膜的錨定、細胞核向有絲分裂中心體的募集、磷酸化對TP53 活性的調節(jié)、IKKs 復合物激活NF-κB 等。

3 討論

近年來隨著現(xiàn)代社會人口老齡化，腦卒中患者數(shù)量日益增多，PSCI 逐漸成為當前國內外卒中領域研究與干預的熱點。中醫(yī)中藥在防治PSCI 方面發(fā)揮多靶點、多層面、標本兼顧的作用，多項研究表明中醫(yī)中藥具有改善卒中后神經功能缺損和PSCI 的作用[9-11]。在對中醫(yī)治療PSCI 用藥規(guī)律分析中發(fā)現(xiàn)，補虛藥使用頻數(shù)最多，其中黃芪和當歸排在前十位，黃芪為補虛藥中的補氣藥，其補氣治本，可補氣行血，補氣以通痹；當歸為補虛藥中的補血藥，其可補血活血，且其活血而不傷血；刺五加為補虛藥中的補氣藥，能補益心脾之氣，益肺補腎[12]。結合PSCI 的發(fā)病機制這也說明該藥組治療PSCI 的可靠性及龍生蛭膠囊組方的合理性。

3.1 “黃芪-當歸-刺五加”藥組治療PSCI 的實驗研究

Morris 水迷宮實驗是用于評估嚙齒動物空間學習和記憶能力最常用的方法之一。大量研究已證實學習記憶和海馬關系密切，紋狀體邊緣區(qū)與前額葉皮質也參與學習記憶過程。在評價海馬依賴性的空間學習和記憶功能時，Morris 水迷宮實驗結果可靠[13-14]。因此本研究采用Morris 水迷宮實驗來評價該藥組對腦卒中大鼠行為學的影響具有合理性。

研究發(fā)現(xiàn)，氧化應激是缺血性腦卒中的重要病理生理變化之一[15]。MDA 是多不飽和脂肪酸氧化的副產物，被用作氧化應激的標志，當其超過機體內最主要的抗氧化物酶 SOD 的清除能力，會使自由基異常堆積，造成神經元細胞凋亡或壞死[16]。因此本實驗對模型組和給藥組大鼠血清中的SOD 和MDA 進行測定，從而評價“黃芪-當歸-刺五加”藥組對大鼠血清生化學的影響。

研究結果顯示，“黃芪-當歸-刺五加”藥組對PSCI 大鼠的空間記憶能力和學習能力具有良好的改善作用；同時藥組還能顯著降低模型腦卒中大鼠血清中MDA 的含量，提高SOD 的活性。孫曉麗等[8]研究發(fā)現(xiàn)，龍生蛭膠囊能夠改善大鼠的神經功能缺陷，提高大鼠的肌力和自主運動能力，其對腦組織的保護作用可能與抗氧化，抑制NF-κB 以及Caspase-3 的表達有關。本實驗研究結果與其基本一致，提示龍生蛭膠囊發(fā)揮改善PSCI 作用可能與“黃芪-當歸-刺五加”藥組抗PSCI 作用有關。

3.2 “黃芪-當歸-刺五加”藥組治療PSCI 的作用機制研究

在對“藥物靶標-疾病靶標”分析中得到AKT1 等多個核心靶標。有研究發(fā)現(xiàn)，AKT1 能介導癌癥和心血管疾病，促進血管內皮生長因子（VEGF）分泌并介導內皮細胞一氧化氮合酶（eNOS）磷酸化過程，AKT1 可能在許多心血管病理過程中均發(fā)揮重要作用[17]。李劍虹等[18]探討腦源性神經營養(yǎng)因子（BDNF）信號傳導通路中AKT1 基因多態(tài)性與抑郁障礙及認知功能的關系中發(fā)現(xiàn)，AKT1基因SNPrs3001371 多態(tài)性與重性抑郁障礙的認知功能損傷存在關聯(lián)性，研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt 通路失衡會產生嚴重的學習記憶障礙，Akt1 缺乏小鼠表現(xiàn)為空間記憶受影響[19]。閻卉芳[20]研究發(fā)現(xiàn)黃芪當歸配伍對血管內皮受損后內膜增生具有抑制作用，其作用與抑制血管內皮受損后血管平滑肌細胞（VSMCs）的表型轉化和增殖有關，其作用機制可能是通過抑制PI3K/Akt 信號通路活化，從而抑制VSMCs 增殖。

圖1 核心靶點網(wǎng)絡Fig 1 Network for key targets

圖2 “中藥-成分-關鍵靶標-通路”多維關聯(lián)網(wǎng)絡Fig 2 Multi-dimensional network of Chinese materia medica-component-key target-pathway

在活性成分方面的研究顯示，藥組治療PSCI可能與黃芪甲苷、刺五加皂苷、有機酸等有關。有研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷對腦損傷引發(fā)的神經損傷也有一定的保護作用[21]。晏燕[22]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷能夠改善Aβ25-35誘導AD 模型大鼠的學習和記憶能力，能夠顯著減輕Aβ誘導的神經元損傷，黃芪甲苷能夠顯著增加抗氧化酶GSH-Px 和SOD 的活性，降低海馬組織MDA 的含量，且能改善AD大鼠學習記憶功能和海馬區(qū)神經元損傷，其作用機制可能與其抗氧化應激有關。黃芪注射液具有改善慢性腦缺血患者認知功能，機制可能與其改善腦血流和血液流變學等作用有關[23]。當歸提取物可劑量依賴性地減弱Aβ1-42誘導的神經毒性和tau 蛋白磷酸化，同時，其能增加Akt 的絲氨酸磷酸化水平，并下調GSK-3β活性，說明當歸提取物保護神經細胞的作用與PI3K/Akt/GSK-3β信號通路有關[24]。研究發(fā)現(xiàn)，刺五加皂苷能活化海馬神經元膽堿乙?；福–hAc），增強海馬膽堿能神經功能；調節(jié)NOS 活性，偶聯(lián)神經活動與腦血流量，促進遞質釋放；激活Na＋-K＋-ATP 酶，促進與學習記憶有關的神經遞質釋放，調節(jié)神經元的興奮性，改善大腦活動的質量；增強SOD 活性，加速氧自由基的清除，減輕海馬神經元損傷，保護海馬神經元，維系膽堿能神經的可塑性；抑制血清單胺氧化酶（MAO）活性，減少兒茶酚胺的代謝，改善腦功能活動[25]，因此其能提高學習記憶能力及改善腦組織生化學的改變，較好地改善PSCI 的臨床癥狀[26-28]。

在對核心靶標基因功能分析中，發(fā)現(xiàn)其與自噬調節(jié)、線粒體電子傳輸?shù)榷鄠€基因功能有關。研究發(fā)現(xiàn)線粒體功能障礙是PSCI 的早期特征，其受損可導致大腦功能受損，并會導致AD 患者中的神經元變性[29]。線粒體自噬可以清除損傷的線粒體，線粒體自噬的發(fā)生依賴線粒體自噬受體的調控[30]。其分子通路涉及核受體轉錄途徑、磷酸化對TP53 活性的調節(jié)等。核受體是一類配體誘導的轉錄因子超家族，核受體可參與調節(jié)包括脂質生物活性在內的各種細胞內生物學過程[31]。研究發(fā)現(xiàn)，核受體編碼基因變異導致膽固醇產生過量及輸出障礙，致病性Aβ肽過量產生，會產生PSCI，且最終導致AD[32]。研究發(fā)現(xiàn)，海馬tau 蛋白的異常磷酸化可能在神經細胞調亡和認知功能損傷中起到了重要的作用[33]。已經有大量基礎研究和部分臨床研究發(fā)現(xiàn)tau 蛋白顯著的磷酸化會同時伴有認知功能的損傷[34]?，F(xiàn)代醫(yī)學發(fā)現(xiàn)這些靶標功能和分子通路多與神經系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)有關?，F(xiàn)代醫(yī)學發(fā)現(xiàn)神經-內分泌-免疫網(wǎng)絡系統(tǒng)調節(jié)功能的表達異常，導致神經系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)功能表達異常，從而導致腦部疾病的發(fā)生[35]。

綜上所述，本研究采用實驗研究與整合藥理學相結合的技術和方法，綜合評價“黃芪-當歸-刺五加”藥組對PSCI 的影響及作用機制。本研究發(fā)現(xiàn) “黃芪-當歸-刺五加”藥組能較好地改善PSCI 大鼠的行為和學習記憶力，同時也通過TCMIP V2.0 網(wǎng)絡大數(shù)據(jù)對藥組治療PSCI 的作用機制進行了預測，發(fā)現(xiàn)“黃芪-當歸-刺五加”藥組治療PSCI 可能通過多分子、多靶點、多通路相協(xié)同作用，但還需要進一步的實驗驗證。