劉丹丹，李林 ，董云，崔昌盛，莊寶祥，田華，王岱君

1 濰坊醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，山東濰坊261053；2 濱州市人民醫(yī)院；3 濰坊醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室；4 濰坊醫(yī)學(xué)院校醫(yī)院

日本學(xué)者Ohsawa 等［1］根據(jù)吸入氫氣可以改善腦梗死引起的腦缺血-再灌注（ischemia/reperfusion，IR）損傷，首次提出氫氣可選擇性中和活性氧簇（ROS）和羥自由基（-OH）。近年來(lái)，氫氣在抗氧化、抗炎、抗細(xì)胞凋亡、保護(hù)線(xiàn)粒體、保護(hù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路等方面的作用相關(guān)研究取得較多進(jìn)展。細(xì)胞凋亡是IR 損傷的重要病理生理機(jī)制。研究［2］發(fā)現(xiàn)，富氫生理鹽水可降低腎IR 損傷中腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor α，TNF-α）及白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）的表達(dá)水平，提高B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（B cell lymphoma-2，Bcl-2）與凋亡前體蛋白Bax 比值，抑制腎細(xì)胞凋亡。與TNF-α 一樣，腫瘤壞死因子-相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（Tumor necrosis factor-associated apoptosis induced ligand，TRAIL）也是TNF 超家族（TNFSF）中的一員，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，參與IR 損傷，其配體/受體復(fù)合物可激活天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（cysteine-containing aspartate-specific proteases，caspase）調(diào)控的線(xiàn)粒體凋亡途徑。當(dāng)線(xiàn)粒體凋亡途徑被觸發(fā)時(shí)，線(xiàn)粒體膜的完整性破壞，線(xiàn)粒體膜的通透性發(fā)生改變，促進(jìn)凋亡分子釋放。線(xiàn)粒體絲氨酸蛋白酶高溫需求因子A（High temperature requirement factor A2，HtrA2）又稱(chēng)Omi，已被證明在肝、腎等器官組織的細(xì)胞凋亡中起調(diào)節(jié)作用。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)TNFSF 成員中的 TNF-α 及核轉(zhuǎn)錄因子 κB（nuclear factorkappa B，NF-κB）水平可降低肢體缺血-再灌注（LIR）短期損傷，但氫氣是否可以調(diào)節(jié)TNFSF 成員中的TRAIL 及促凋亡蛋白Omi/HtrA2 來(lái)降低兔LIR 的的長(zhǎng)期損傷，仍待進(jìn)一步探討。我們于2019 年9 月-2020年7月間，我們觀察了腹腔給予氫氣的LIR兔血清TRAIL、Omi/HtrA2 及骨骼肌組織勻漿上清Omi/HtrA2表達(dá)，并探討氫氣在其中的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器 健康成年雄性新西蘭大耳白兔，兔齡70～80 d，體質(zhì)量（2.16 ± 0.25）kg，購(gòu)于青島康大生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（魯）20160002；按SPF 級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)要求喂養(yǎng)一周，飼養(yǎng)環(huán)境設(shè)置為濕度（50± 10）%，溫度（23± 2）℃，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。氫氣濃度99.999%，購(gòu)于安丘市恒安氣體廠(chǎng)；TRAIL ELISA 測(cè)定試劑盒，Omi/HtrA2 ELISA 測(cè)定試劑盒均購(gòu)于上海將來(lái)實(shí)業(yè)股份有限公司江萊生物；TDZ4-WS 低速離心機(jī)為長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司生產(chǎn)；DNM-9602酶標(biāo)儀為北京普朗新技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.2 LIR 兔模型建立及氫氣腹腔注射方法 取45只兔，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為L(zhǎng)IR+氫氣組（H 組）、LIR 組（I 組）及對(duì)照組（C 組）。H、I 組采用袖帶壓力阻斷血流方法進(jìn)行LIR：左側(cè)耳緣靜脈注射200 g/L烏拉坦，5mL/kg給藥劑量麻醉兔，固定于兔臺(tái)上，使用特制的袖帶（長(zhǎng)18 cm，寬3 cm），其橡皮囊的兩管分別與臺(tái)式水銀血壓計(jì)的球囊和檢壓計(jì)相連，將袖帶平整地綁縛于兔右后肢根部股動(dòng)脈搏動(dòng)處，測(cè)量血壓，以超過(guò)收縮壓20～30 mmHg 壓力作為完全阻斷血流的壓力，隨時(shí)補(bǔ)氣保持壓力下降不超過(guò)10 mmHg，束縛4 h打開(kāi)球囊開(kāi)關(guān)，放氣，形成LIR 兔模型。C 組動(dòng)物僅使用相同特制袖帶纏縛相同部位，不充氣加壓。H 組于再灌注前5 min 腹腔注射5 mL/kg氫氣，C、I組同時(shí)刻腹腔注射等體積空氣。

1.3 血清TRAIL、Omi/HtrA2 及骨骼肌組織Omi/HtrA2 檢測(cè) 分別于再灌注 24、72、168 h 時(shí)取各組大耳白兔，耳緣靜脈取血1 mL，靜置10 min，2 500 r/min 離心 10 min，取上清，ELISA 法檢測(cè)血清TRAIL 及Omi/HtrA2。①剪去兔右后肢脛骨前區(qū)毛發(fā)并消毒，沿脛骨縱行切開(kāi)皮膚，分離肌肉組織，注意不傷及血管與神經(jīng)，切取0.7 cm×0.3 cm×0.2 cm大小的脛骨前肌組織塊，PBS 沖洗所取組織、稱(chēng)重、冰上研磨、制備勻漿、離心、取上清，ELISA 法檢測(cè)骨骼肌組織勻漿上清Omi/HtrA2 每次取材后，及時(shí)止血縫合包扎傷口，飼養(yǎng)條件同前。取材后每2 天更換一次敷料，若有感染及時(shí)處理。各指標(biāo)檢測(cè)操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料以表示。本研究各組各時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)存在一定的相關(guān)性，使用重復(fù)測(cè)量方差分析。進(jìn)行重復(fù)測(cè)量方差分析前，需檢驗(yàn)資料的正態(tài)性、方差齊性及協(xié)方差矩陣的球形性（sphericity）。Mauchly 法檢驗(yàn)球?qū)ΨQ(chēng)性，如數(shù)據(jù)不符合球?qū)ΨQ(chēng)假設(shè)，則采用Greenhous-Geisser（G-G）法對(duì)自由度進(jìn)行校正。組內(nèi)兩兩比較用數(shù)據(jù)拆分后行估算邊際均值法（Bonferroni 法），組間兩兩比較用多變量方差分析法。P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 再灌注 24、72、168 h 時(shí)三組兔血清 TRAIL 表達(dá)比較 再灌注24、72、168 h 時(shí)三組兔血清TRAIL表達(dá)比較見(jiàn)表1。

表1 再灌注24、72、168 h時(shí)三組兔血清TRAIL表達(dá)比較（pg/mL，）

表1 再灌注24、72、168 h時(shí)三組兔血清TRAIL表達(dá)比較（pg/mL，）

注：與再灌注72 h 比較，*P＜0.01；與C 組比較，△P＜0.01；與I 組比較，#P＜0.01。

再灌注168 h 97.854 ± 4.003*△#88.309±4.809 132.466±7.920*△組別H組C組I組TRAIL再灌注24 h 96.249 ± 4.839*△#88.419±4.876 110.363 ± 8.258*△再灌注72 h 94.083±5.599#88.929±4.980 103.231±9.087△

2.2 再灌注24、72、168 h 時(shí)三組兔血清Omi/HtrA2表達(dá)比較 再灌注24、72、168 h時(shí)三組兔血清Omi/HtrA2表達(dá)比較見(jiàn)表2。

表2 再灌注24、72、168 h時(shí)三組兔血清Omi/HtrA2表達(dá)比較（pg/mL，）

表2 再灌注24、72、168 h時(shí)三組兔血清Omi/HtrA2表達(dá)比較（pg/mL，）

注：與再灌注72 h 比較，*P＜0.01；與C 組比較，△P＜0.01；與I 組比較，#P＜0.01。

再灌注168 h 10.592± 1.541△#8.711±0.323 19.543±0.714*△組別H組C組I組Omi/HtrA2再灌注24 h 10.746± 0.837△#8.869±0.428 13.934±1.322*△再灌注72 h 10.536± 0.987△#8.707±0.496 12.495±1.523△

2.3 再灌注24、72、168 h時(shí)三組兔骨骼肌組織勻漿上清Omi/HtrA2表達(dá)比較 再灌注24、72、168 h時(shí)三組兔骨骼肌組織勻漿上清Omi/HtrA2表達(dá)比較見(jiàn)表3。

3 討論

LIR 損傷在臨床上較為常見(jiàn)，嚴(yán)重?cái)D壓傷、斷肢再植、血管夾閉等均可導(dǎo)致LIR，可造成嚴(yán)重組織損傷甚至導(dǎo)致組織壞死。缺血組織在恢復(fù)血供時(shí)，會(huì)出現(xiàn)組織內(nèi)大量Ca2+內(nèi)流、氧自由基生成、組織細(xì)胞凋亡等病理生理現(xiàn)象。我們前期研究［3］表明，抑制TNF-α 與 NF-κB 的相互激活過(guò)程減輕 LIR 損傷引起的炎癥反應(yīng)，提示通過(guò)阻礙TNFSF 成員與其他炎癥或凋亡因子的相互作用能夠減輕LIR 損傷。TRAIL又稱(chēng)為凋亡素 2（Apo2 Ligand，Apo2L），是一個(gè)與TNFSF 成員序列有同源性的蛋白分子［4］。TRAIL 具有可特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，且對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯影響的特性［5］，所以TRAIL 在腫瘤免疫、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡方面一直是目前腫瘤學(xué)的研究熱點(diǎn)。當(dāng)組織器官發(fā)生IR 損傷時(shí)，TRAIL 活化并與細(xì)胞膜上的死亡受體結(jié)合，經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（death inducing signaling complex，DISC），DISC促使caspase-8活化，之后會(huì)通過(guò)兩條信號(hào)途徑傳遞凋亡信號(hào)，激活細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑。其中一條是線(xiàn)粒體依賴(lài)型途徑，活化的caspase-8催化Bcl-2家族蛋白導(dǎo)致Bid裂解產(chǎn)生截短Bid（t Bid），t Bid激活多域蛋白Bax和Bak，線(xiàn)粒體膜的完整性被破壞，凋亡蛋白如細(xì)胞色素C（Cytochrome C，Cyt C）和Omi/HtrA2 等一起從線(xiàn)粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，降解誘導(dǎo)X染色體連鎖的凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP），觸發(fā)caspase凋亡級(jí)聯(lián)，細(xì)胞凋亡加速，組織細(xì)胞水腫和損傷加重。研究顯示，氫氣可在心、腦、肝、腎、大腸、肢體［6-11］等 IR 損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。TRAIL在IR中的研究多集中在心、腦、腎等［12-14］方面，在LIR方面的研究較少。Omi/HtrA2參與IR損傷、癌癥、阿茲海默癥［15-17］等疾病，被認(rèn)為是促進(jìn)IR 細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵細(xì)胞內(nèi)分子，在心、腸 IR 損傷［18-20］中研究較多。目前，氫氣影響LIR 損傷細(xì)胞凋亡的研究不多，機(jī)制尚不十分清楚，故本研究選擇了在LIR損傷中研究較少的TRAIL及Omi/HtrA2作為檢測(cè)指標(biāo)。

表3 再灌注24、72、168 h時(shí)三組兔骨骼肌組織勻漿上清中Omi/HtrA2表達(dá)比較（pg/mL，）

表3 再灌注24、72、168 h時(shí)三組兔骨骼肌組織勻漿上清中Omi/HtrA2表達(dá)比較（pg/mL，）

注：與再灌注72 h 比較，*P＜0.01；與C 組比較，△P＜0.01；與I 組比較，#P＜0.01。

再灌注168 h 26.413 ± 0.920*△#20.388±0.994 35.086±1.385*△組別H組C組I組Omi/HtrA2再灌注24 h 24.157 ± 0.549*△#22.435±0.717 30.454±2.369*△再灌注72 h 21.267±0.927#20.608±0.562 26.459±1.518△

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LIR 后再灌注 24～72 h，I 組血清中TRAIL 及Omi/HtrA2 的濃度呈下降趨勢(shì)，這可能與缺血肢體在再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)，缺血骨骼肌組織細(xì)胞凋亡程度受到機(jī)體全身免疫反應(yīng)的調(diào)控有關(guān)，體內(nèi)多種免疫因子活性增高，TRAIL活性被抑制，進(jìn)而Omi/HtrA2 釋放減少。再灌注72～168 h，TRAIL 及Omi/HtrA2 的濃度呈快速增長(zhǎng)趨勢(shì)，在7d時(shí)達(dá)到峰值，這一現(xiàn)象可能是因?yàn)?，再灌?2 h后骨骼肌組織的細(xì)胞凋亡不斷累積，機(jī)體全身免疫反應(yīng)的調(diào)控到達(dá)一定程度，TRAIL活化不再被抑制，同時(shí)Omi/HtrA2 釋放增多。再灌注不同時(shí)間，H 組血清中TRAIL及Omi/HtrA2的濃度及骨骼肌組織勻漿上清中Omi/HtrA2 的濃度均低于I 組，再灌注168 h 時(shí)降低最為明顯，說(shuō)明腹腔注射氫氣可以降低LIR 損傷產(chǎn)生的TRAIL及Omi/HtrA2的濃度。此外我們還發(fā)現(xiàn)，凋亡蛋白Omi/HtrA2 不僅可以在兔骨骼肌組織勻漿上清中檢測(cè)到，在血清中也可以檢測(cè)到，血清與骨骼肌組織勻漿上清中Omi/HtrA2的濃度變化趨勢(shì)相同，并且勻漿上清中Omi/HtrA2 的濃度高于血清中Omi/HtrA2 的濃度，這可能與細(xì)胞凋亡后細(xì)胞質(zhì)膜破裂，導(dǎo)致包括細(xì)胞內(nèi)Omi/HtrA2 在內(nèi)的所有細(xì)胞內(nèi)容物進(jìn)入細(xì)胞外間隙有關(guān)［21］。

綜上所述，腹腔注射氫氣的LIR 兔血清TRAIL、Omi/HtrA2 及骨骼肌組組織勻漿上清Omi/HtrA2 表達(dá)均降低。TRAIL 及促凋亡因子Omi/HtrA2 參與了LIR 骨骼肌細(xì)胞的凋亡。腹腔注射氫氣可抑制TRAIL 的活化及Omi/HtrA2 的釋放，發(fā)揮其抗細(xì)胞凋亡的作用。其機(jī)制可能是氫分子通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，抑制TRAIL 與誘導(dǎo)凋亡受體的結(jié)合，維持線(xiàn)粒體穩(wěn)態(tài)，釋放到細(xì)胞質(zhì)中的Omi/HtrA2減少，抑制凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。后續(xù)我們將從基因水平上進(jìn)行驗(yàn)證對(duì)比，并延長(zhǎng)再灌注時(shí)間點(diǎn)的選取，進(jìn)一步探討氫氣對(duì) LIR 中 TRAIL 及 Omi/HtrA2 的影響，為研究細(xì)胞凋亡與LIR的關(guān)系提供更有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)資料。