王知任，李荷楠

1 概述

替加環(huán)素（tigecycline）是四環(huán)素類衍生的新型甘氨酰環(huán)素類抗菌藥物，其在米諾環(huán)素的中心構(gòu)架上增加了9-叔丁基-甘氨酰胺基側(cè)鏈修飾結(jié)構(gòu)[1]。替加環(huán)素進(jìn)入細(xì)菌后可逆地結(jié)合于核糖體30S亞單位中的16S rRNA，阻斷tRNA進(jìn)入A位點(diǎn)從而抑制蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯過程。通過結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，替加環(huán)素與核糖體30S亞基結(jié)合的同時(shí)，也與核糖體亞基H34殘基相互作用，所以兩者的結(jié)合比其他四環(huán)素類藥物更牢固，抑制細(xì)菌蛋白合成的能力是四環(huán)素的20倍[2]。替加環(huán)素對(duì)除變形桿菌屬和假單胞菌屬外大多數(shù)革蘭陽性和革蘭陰性菌都有較強(qiáng)的抗菌活性，包括腸桿菌科、鮑曼不動(dòng)桿菌、金黃色葡萄球菌、腸球菌屬、肺炎鏈球菌等[3]。由于其9位上的大取代基形成了空間位阻，替加環(huán)素不受大多數(shù)抗菌藥物耐藥機(jī)制影響，同時(shí)還克服了四環(huán)素的耐藥機(jī)制，如編碼核糖體保護(hù)蛋白的tet(O)、編碼外排泵的tet(K)和tet(A)等[4]。由于替加環(huán)素廣泛的體外抗菌活性，它和黏菌素被視作碳青霉烯類多重耐藥革蘭陰性菌感染的“最后一道防線”，然而近年來隨著其應(yīng)用愈加廣泛，耐藥性的產(chǎn)生不可避免，替加環(huán)素耐藥機(jī)制的研究也呈趨勢(shì)性發(fā)展。

在已報(bào)道的替加環(huán)素耐藥機(jī)制中，細(xì)菌外排泵系統(tǒng)起主要作用。RND型外排系統(tǒng)（resistancenodulation-division efflux systems）中特征性外排泵AdeABC、AdeFGH和AdeIJK表達(dá)活性過度增加，與雙組份調(diào)控系統(tǒng)adeR和adeS的缺失和突變均可導(dǎo)致替加環(huán)素耐藥[5]。此外，替加環(huán)素敏感性降低的原因還有修飾酶Tet(X)滅活替加環(huán)素、plsC基因突變改變細(xì)胞膜滲透性、rpsJ基因突變導(dǎo)致替加環(huán)素與核糖體之間親和力下降等[6]。近期，有研究報(bào)道替加環(huán)素的耐藥性可以由攜帶耐藥基因的質(zhì)粒通過接合的方式在細(xì)菌中傳播[7]，進(jìn)而可能引起醫(yī)院內(nèi)部耐藥菌的暴發(fā)。耐藥質(zhì)?？梢栽诓煌N類的細(xì)菌之間介導(dǎo)耐藥的水平轉(zhuǎn)移，其取決于宿主范圍的寬窄、接合特性和效率?？赊D(zhuǎn)移質(zhì)粒是傳播耐藥基因的理想載體，因?yàn)樗鼈兛梢詳y帶并表達(dá)多種耐藥基因，并且經(jīng)常攜帶能夠促進(jìn)其向另一細(xì)菌轉(zhuǎn)移的基因。在質(zhì)粒內(nèi)，耐藥基因通常由轉(zhuǎn)座子攜帶，轉(zhuǎn)座子可以在質(zhì)粒之間轉(zhuǎn)移耐藥基因或?qū)⒛退幓蛴谌旧w中運(yùn)進(jìn)或移出[8]。位于質(zhì)粒上的耐藥基因、毒力基因或黏附因子為宿主提供了優(yōu)勢(shì)性狀，使質(zhì)粒得以進(jìn)化為細(xì)菌基因組的組成部分[9]，質(zhì)粒與整合子和轉(zhuǎn)座子等遺傳元件一起利用多種機(jī)制參與了這些性狀的傳播，從而消除了不同種類細(xì)菌之間的屏障[10]。質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥性的產(chǎn)生和傳播目前已經(jīng)成為耐藥菌感染和暴發(fā)的重要原因之一，本文對(duì)近期質(zhì)粒介導(dǎo)的替加環(huán)素耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，已經(jīng)報(bào)道的質(zhì)粒介導(dǎo)的替加環(huán)素耐藥機(jī)制涉及的基因包括tet(A)、tet(X)、tet(M)和tet(L)。

2 編碼四環(huán)素外排泵的tet(A)基因

tet(A)基因編碼屬于MFS家族的蛋白外排泵，通常定位于轉(zhuǎn)座子Tn1721上，并在質(zhì)粒和染色體上均可被檢測(cè)到。Tn1721與接合質(zhì)粒相關(guān)，所以tet(A)基因?qū)⒂兄趯?duì)四環(huán)素類抗生素耐藥性的傳播[11]。普遍認(rèn)為由于替加環(huán)素可以抑制蛋白質(zhì)的合成，tet(A)基因隨著質(zhì)粒接合進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)就無法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，因此不會(huì)引起細(xì)菌對(duì)替加環(huán)素的耐藥。但是多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，tet(A)基因在肺炎克雷伯菌、腸炎沙門菌和鮑曼不動(dòng)桿菌等革蘭陰性菌中能升高替加環(huán)素最低抑菌濃度（MIC）。

通過持續(xù)監(jiān)測(cè)1例接受替加環(huán)素治療的癌癥患者的肺炎克雷伯菌分離株，發(fā)現(xiàn)在治療的早期階段分離株對(duì)替加環(huán)素敏感，治療13 d后分離出了與早期克隆一致的耐藥菌株，通過全基因組測(cè)序和生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)耐藥株存在tet(A)基因的點(diǎn)突變導(dǎo)致氨基酸改變[12]。耐藥菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922接合成功，接合子的替加環(huán)素MIC從0.125 mg/L增加至8 mg/L，增加了64倍，說明tet(A)基因突變可以引起替加環(huán)素MIC升高，并且這種耐藥性還具有傳播能力。后續(xù)通過DNA印跡雜交和PCR雜交驗(yàn)證了突變的tet(A)基因可以通過可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒介導(dǎo)。這說明在替加環(huán)素的選擇性壓力下，可能發(fā)生tet(A)突變并導(dǎo)致治療失敗。

在食品和臨床分離的腸炎沙門菌株中，檢測(cè)到多個(gè)tet(A)基因移碼突變的突變體[13]。DNA印跡雜交確定突變的tet(A)基因位于質(zhì)粒，消除質(zhì)粒后的菌株替加環(huán)素MIC均低于野生型分離株，說明tet(A)突變基因降低了菌株對(duì)替加環(huán)素的敏感性。在未對(duì)整個(gè)片段進(jìn)行測(cè)序的情況下，用限制酶BsaWI消化tet(A)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物來確定tet(A)是否攜帶突變，發(fā)現(xiàn)所有攜帶tet(A)的擴(kuò)增產(chǎn)物均被切割，說明突變存在于相應(yīng)的結(jié)構(gòu)域間環(huán)路區(qū)域序列中，于是猜測(cè)替加環(huán)素耐藥的增加可能是由于Tet(A)蛋白結(jié)構(gòu)域間環(huán)C3區(qū)內(nèi)的多個(gè)移碼突變影響了替加環(huán)素的底物特異性[13-14]。研究還發(fā)現(xiàn)在大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)氣單胞菌和黏質(zhì)沙雷菌等細(xì)菌中均檢測(cè)到與質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子等可移動(dòng)遺傳元件有關(guān)的突變的tet(A)基因，并且在不同國(guó)家的食品、臨床標(biāo)本、環(huán)境和人類菌群中均有發(fā)現(xiàn)[13]。

除了tet(A)基因的突變外，有研究發(fā)現(xiàn)RND型外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)子AdeABC和AdeIJK可以與tet(A)基因協(xié)同作用使鮑曼不動(dòng)桿菌獲得替加環(huán)素耐藥性[15]。敲除adeAB（ΔadeAB）的鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)替加環(huán)素的敏感性明顯增強(qiáng)，adeIJ的敲除（ΔadeIJ）也小幅增強(qiáng)對(duì)替加環(huán)素敏感性，表明adeAB是參與替加環(huán)素外排的主要RND外排泵。adeFG敲除的菌株在替加環(huán)素存在的情況下顯示出與野生型相似的易感性表型，可能是由于adeG的轉(zhuǎn)錄水平較低。該研究構(gòu)建了tet(A)表達(dá)質(zhì)粒，以敲除不同RND基因的鮑曼不動(dòng)桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)化后檢測(cè)替加環(huán)素MIC，發(fā)現(xiàn)所有菌株對(duì)替加環(huán)素的敏感性降低，包括替加環(huán)素敏感的ΔadeAB和ΔadeIJ菌株，證實(shí)了Tet(A)在替加環(huán)素外排活性中的重要作用。對(duì)暴露于替加環(huán)素時(shí)tet(A)基因表達(dá)進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果顯示tet(A)表達(dá)量在有替加環(huán)素存在的情況下顯著增加，說明替加環(huán)素耐藥性的主要決定因素是tet(A)，RND型轉(zhuǎn)運(yùn)子AdeABC和AdeIJK在外排中起協(xié)同和/或疊加作用。Tet(A)與RND型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白協(xié)同作用的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制對(duì)于深入了解外排泵系統(tǒng)介導(dǎo)的替加環(huán)素耐藥機(jī)制具有重要提示意義。

3 編碼替加環(huán)素滅活酶的tet(X)基因家族

Tet(X)蛋白是黃素依賴性單加氧酶，可以修飾四環(huán)素和米諾環(huán)素，需要黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）、鎂離子和氧才能發(fā)揮活性[16]。在NADPH存在時(shí)Tet(X)可以修飾替加環(huán)素，表明替加環(huán)素同樣是Tet(X)的底物，進(jìn)一步利用液相色譜質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)其可在替加環(huán)素的碳11a處進(jìn)行羥基化。研究還通過羥基化前后的替加環(huán)素MIC和阻斷蛋白合成能力的定量比對(duì)，發(fā)現(xiàn)羥基化后的替加環(huán)素MIC升高同時(shí)抑制蛋白質(zhì)翻譯的能力更弱。雖然目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的tet(X)基因有tet(X1)～tet(X6)，但是根據(jù)命名中心的新標(biāo)準(zhǔn)，所有tet(X)變異體基因都只能稱為tet(X)，為了描述方便本文中仍沿用舊稱，目前僅有tet(X3)、tet(X4)和tet(X5)在質(zhì)粒上有報(bào)道。

一項(xiàng)基于全基因組測(cè)序的研究從豬來源的鮑曼不動(dòng)桿菌和大腸埃希菌的替加環(huán)素耐藥分離株中分別發(fā)現(xiàn)了tet(X3)、tet(X4)基因，兩者均位于質(zhì)粒上[17]。tet(X3)和tet(X4)的DH5α轉(zhuǎn)化子的替加環(huán)素MIC是原來的64倍和128倍，攜帶tet(X3)的質(zhì)粒也成功接合到一株攜帶blaOXA-23基因的鮑曼不動(dòng)桿菌分離株中，替加環(huán)素的MIC升高到原來的128倍。小鼠感染模型證實(shí)tet(X3)和tet(X4)能夠在體內(nèi)介導(dǎo)替加環(huán)素耐藥，并可能導(dǎo)致臨床治療失敗。經(jīng)過同源建模和色譜質(zhì)譜分析證實(shí)了Tet(X3)和Tet(X4)通過對(duì)替加環(huán)素進(jìn)行羥基化破壞胞內(nèi)的藥物。為了研究二者的遺傳環(huán)境，實(shí)驗(yàn)還進(jìn)行了三代測(cè)序和生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)二者在各自的質(zhì)粒上兩側(cè)都與插入序列ISVsa3相鄰從而形成環(huán)狀I(lǐng)SVsa3-tet(X3/4)中間體，tet(X3)和tet(X4)基因通過ISVsa3介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座在菌株之間傳播。ISVsa3元件的普遍存在以及環(huán)狀I(lǐng)SVsa3-tet(X)中間體的形成和轉(zhuǎn)座使tet(X)變體基因在不同質(zhì)粒間有潛在易位和整合到染色體上的可能性。動(dòng)物糞便分離細(xì)菌中tet(X3)和tet(X4)的高檢出率很可能是由于飼養(yǎng)中大量四環(huán)素的選擇性壓力造成的，推測(cè)tet(X)變異體正在成為最重要的替加環(huán)素耐藥的決定因素。此外還進(jìn)行了數(shù)據(jù)庫挖掘和回顧性篩選分析，證實(shí)tet(X3)和tet(X4)在臨床細(xì)菌中廣泛存在，并會(huì)導(dǎo)致其對(duì)替加環(huán)素的耐藥，所以需要加強(qiáng)臨床替加環(huán)素耐藥病原體中tet(X)變異體的監(jiān)測(cè)。

還有研究在鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株中檢測(cè)到一種新的質(zhì)粒介導(dǎo)的高水平替加環(huán)素耐藥tet(X)基因變異體tet(X5)，其與tet(X3)和tet(X4)結(jié)合位點(diǎn)相似，對(duì)四環(huán)素的親和力也相近[18]。tet(X5)重組載體轉(zhuǎn)化子的替加環(huán)素MIC增加4～32倍。可能是由于質(zhì)粒中缺乏接合元件，接合實(shí)驗(yàn)未能成功，但是菌株能夠成功轉(zhuǎn)化也表明該質(zhì)?？梢栽诓粍?dòng)桿菌屬中復(fù)制。利用tet(X)與米諾環(huán)素的復(fù)合體為模板進(jìn)行同源建模，并將該模型疊加到Tet(X2)的X射線結(jié)構(gòu)上，結(jié)果顯示Tet(X5)的四環(huán)素結(jié)合位點(diǎn)與Tet(X2)的基本相同，這與Tet(X3)和Tet(X4)得到的結(jié)果相同，說明這組蛋白質(zhì)之間可能具有高度序列同一性。為了探究其遺傳環(huán)境，實(shí)驗(yàn)通過單分子實(shí)時(shí)測(cè)序得到了tet(X5)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)tet(X5)中心區(qū)域的兩側(cè)同樣有兩個(gè)ISVsa3拷貝形成了環(huán)狀中間體，結(jié)合之前的研究結(jié)果推測(cè)其也有通過ISVsa3元件在菌株之間進(jìn)行轉(zhuǎn)座的可能，表明插入序列ISVsa3可能在所有檢測(cè)到的tet(X)變異體的傳播中起重要作用。可以推測(cè)，在質(zhì)粒上的耐藥基因兩側(cè)若有相同插入序列存在則可能形成環(huán)狀中間體并通過轉(zhuǎn)座在細(xì)菌之間進(jìn)行耐藥的傳播。

此外，有研究發(fā)現(xiàn)在養(yǎng)雞場(chǎng)的家禽樣本和土壤樣本中替加環(huán)素耐藥的不動(dòng)桿菌中含有共攜帶新型tet(X)和碳青霉烯耐藥基因blaNDM-1的質(zhì)粒，這些不動(dòng)桿菌包括印度不動(dòng)桿菌(A. indicus)、遜德勒不動(dòng)桿菌(A. schindleri)、洛菲不動(dòng)桿菌(A.lwoffii)和一種未知的不動(dòng)桿菌[19]。通過全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)了18個(gè)tet(X)和blaNDM-1共攜帶的分離株，其中15個(gè)攜帶的是新型tet(X)基因，15個(gè)中有6個(gè)菌株的新型tet(X)和blaNDM-1共定位于同一質(zhì)粒。由于共攜帶tet(X)和blaNDM-1的質(zhì)粒未能成功接合進(jìn)入受體菌，于是進(jìn)行了轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，成功驗(yàn)證了質(zhì)粒介導(dǎo)的替加環(huán)素耐藥性。通過單分子實(shí)時(shí)測(cè)序獲得了完整的共攜帶新型tet(X)和blaNDM-1的質(zhì)粒序列，發(fā)現(xiàn)6個(gè)質(zhì)粒含有相似的兩個(gè)多藥耐藥區(qū)和質(zhì)粒骨架結(jié)構(gòu)，包括編碼質(zhì)粒復(fù)制、維持和穩(wěn)定的基因，并且其中5個(gè)質(zhì)粒與第6個(gè)質(zhì)粒pCMG3-2-1在核酸序列上有較高一致性，推測(cè)是在其基礎(chǔ)上通過序列插入、置換、刪除和轉(zhuǎn)位形成的。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)tet(X)基因的下游都存在插入序列ISCR2，blaNDM-1均位于Tn125轉(zhuǎn)座子上，這種基因環(huán)境被認(rèn)為與tet(X)和blaNDM-1的可移動(dòng)性有關(guān)。盡管未能證明這類質(zhì)粒的接合能力，也未能發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)移操縱子，但是在不同的物種、來源和地理區(qū)域中均發(fā)現(xiàn)高度相似的質(zhì)粒，暗示該質(zhì)粒具有可水平轉(zhuǎn)移性。研究還發(fā)現(xiàn)除了家禽外其他鳥類物種也含有共攜帶質(zhì)粒，水禽樣本中共攜帶分離株的高檢出率表明這些細(xì)菌可能通過被污染的水系統(tǒng)傳播。令人擔(dān)憂的是，碳青霉烯類和替加環(huán)素耐藥基因的結(jié)合將同時(shí)使兩類最重要的抗菌藥物失去活性，考慮到動(dòng)物、環(huán)境和人類之間的密切關(guān)系，應(yīng)該密切監(jiān)測(cè)這些菌株和質(zhì)粒在人類社會(huì)中的進(jìn)一步傳播。

4 編碼MSF泵的tet(L)和編碼核糖體保護(hù)蛋白tet(M)

目前，在革蘭陽性菌中也發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)四環(huán)素類抗菌藥物的耐藥決定簇——編碼MFS超家族外排泵的tet(L)和編碼核糖體保護(hù)蛋白的tet(M)[20]。研究將7株替加環(huán)素MIC在0.5～12 mg/L的屎腸球菌臨床分離株在非選擇性平板上培養(yǎng)115 d，以檢測(cè)其耐藥穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)7株中有2株MIC維持穩(wěn)定、3株略有降低、還有2株完全喪失耐藥，說明耐藥性并不穩(wěn)定。進(jìn)而利用含高濃度替加環(huán)素的瓊脂平板培養(yǎng)菌株，發(fā)現(xiàn)其中1株耐藥丟失株的原分離株在培養(yǎng)4周后MIC升高至64 mg/L，成為耐藥增強(qiáng)株。將這一分離株的原始株、耐藥丟失株和耐藥增強(qiáng)株進(jìn)行全基因組測(cè)序和單分子實(shí)時(shí)測(cè)序，并經(jīng)過S1-PFGE驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)其原始分離株和耐藥增強(qiáng)株含有攜帶tet(M)和tet(L)基因的質(zhì)粒，而耐藥性丟失株則丟失了該質(zhì)粒，說明該屎腸球菌的替加環(huán)素耐藥由質(zhì)粒介導(dǎo)，且可以丟失。Tet(M)是核糖體保護(hù)蛋白，阻礙四環(huán)素與23S rRNA結(jié)合；Tet(L)是MFS外排泵家族的一員，可以外排四環(huán)素卻對(duì)替加環(huán)素?zé)o效，但是在耐藥增強(qiáng)株中發(fā)現(xiàn)成熟Tet(L)蛋白的假定底物結(jié)合位點(diǎn)出現(xiàn)了氨基酸取代，推測(cè)該突變?cè)谔婕迎h(huán)素耐藥中發(fā)揮了作用。通過電轉(zhuǎn)將tet(M)、tet(L)和tet(L)突變體的表達(dá)載體引入革蘭陽性菌單核細(xì)胞增生李斯特菌中表達(dá)，結(jié)果顯示天然Tet(L)對(duì)替加環(huán)素MIC的影響很小，突變的Tet(L)外排泵和核糖體保護(hù)蛋白Tet(M)均使替加環(huán)素MIC值升高數(shù)倍，這也就表明即使在非天然宿主中Tet(L)和Tet(M)也可介導(dǎo)替加環(huán)素的耐藥。此研究并沒有直接驗(yàn)證其可轉(zhuǎn)移性，所以質(zhì)粒是否存在轉(zhuǎn)座子或插入序列而具有傳播耐藥的能力尚未得知。另外逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR也驗(yàn)證了耐藥增強(qiáng)株中tet(M)和tet(L)均過表達(dá)，tet(M)和tet(L)拷貝數(shù)和/或表達(dá)的增加使腸球菌的替加環(huán)素耐藥增加。由此可見對(duì)于革蘭陽性菌的替加環(huán)素耐藥監(jiān)測(cè)也不可忽視，質(zhì)粒耐藥基因的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

5 小結(jié)

隨著臨床和非臨床環(huán)境中四環(huán)素類抗菌藥物的廣泛使用，動(dòng)物和人類細(xì)菌中逐漸出現(xiàn)質(zhì)粒介導(dǎo)的替加環(huán)素耐藥菌株，且其傳播風(fēng)險(xiǎn)逐漸增高。我們需要快速破解新發(fā)耐藥質(zhì)粒的耐藥機(jī)制，同時(shí)也要對(duì)已知耐藥質(zhì)粒的機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步探究，提高質(zhì)粒對(duì)于耐藥傳播重要性的認(rèn)識(shí)，進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)于替加環(huán)素耐藥的監(jiān)測(cè)和研究。