張倩，席家寧

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京康復(fù)醫(yī)院，北京市100144

腦卒中對全球衛(wèi)生保健系統(tǒng)和社會造成重大負(fù)擔(dān)[1]。除神經(jīng)功能缺損外，卒中后呼吸道感染和尿道感染等并發(fā)癥也對患者的進(jìn)一步康復(fù)構(gòu)成障礙，并增加死亡風(fēng)險[2]。腦卒中相關(guān)感染，特別是肺炎，與不良預(yù)后獨(dú)立相關(guān)[3]。細(xì)菌性肺炎是最常見的并發(fā)癥[4]。

1 卒中后肺炎的特點(diǎn)

微生物學(xué)數(shù)據(jù)顯示，卒中后肺炎大多數(shù)為早期發(fā)作的醫(yī)院獲得性肺炎或社區(qū)獲得性吸入性綜合征。金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性細(xì)菌，如肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌或腸桿菌屬等最為常見[5]。

患者的臨床狀況，如卒中嚴(yán)重程度、保護(hù)性反射受損、吞咽困難、機(jī)械通氣及其他醫(yī)源性侵入性操作等，影響卒中后肺炎的感染率。由于缺乏保護(hù)性反射，患者的誤吸風(fēng)險增加，并與意識障礙程度有關(guān)。大多數(shù)卒中相關(guān)性肺炎由吞咽困難和隨后吸入口咽或胃內(nèi)容物引起的。但臨床上，約一半卒中后肺炎患者沒有吞咽困難；同時，約一半健康成年人睡眠時發(fā)生誤吸，但不會發(fā)展為肺炎[6]。這意味著還涉及其他機(jī)制，如腦卒中誘導(dǎo)的免疫抑制[7]、對感染的易感性和全身性抗炎反應(yīng)[8]。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)通過自主神經(jīng)系統(tǒng)感知體內(nèi)炎癥，并在發(fā)生全身性感染或受傷時產(chǎn)生強(qiáng)烈的反調(diào)節(jié)反應(yīng)；這種反應(yīng)本質(zhì)上是抗炎和免疫抑制的，可以被認(rèn)為是適應(yīng)性反應(yīng)，有助于遏制因感染和損傷引起的炎癥。腦或脊髓損傷可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生炎性介質(zhì)，或破壞神經(jīng)免疫相互作用的控制信號，這兩種情況均可能導(dǎo)致固有和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)下調(diào)；而在沒有周圍炎癥刺激的情況下，這會導(dǎo)致人體防御系統(tǒng)嚴(yán)重缺陷，使宿主易受微生物侵襲[7]。

卒中后肺炎的治療通常是經(jīng)驗(yàn)性的，非插管患者可能難以獲得下呼吸道培養(yǎng)物。目前除護(hù)理和功能訓(xùn)練外，預(yù)防性抗生素也應(yīng)用于臨床實(shí)踐。系統(tǒng)綜述表明[9]，預(yù)防性應(yīng)用抗生素可降低卒中后肺炎的風(fēng)險，但抗生素治療對腦卒中患者的死亡率沒有顯著影響。故目前尚無足夠的證據(jù)推薦急性腦卒中后常規(guī)預(yù)防性使用抗生素[10]。

2 三氧療法

三氧(O3)是由3個氧原子組成的特殊分子，是氧(O2)的同素異構(gòu)體，因特征性刺激氣味，又名臭氧，具有極強(qiáng)的氧化性。三氧療法基于醫(yī)用劑量O3與體液混合后產(chǎn)生的各種生物學(xué)效應(yīng)，目前用于50 多個病理過程的治療。三氧療法結(jié)合O2-O3混合物，具有不同的治療劑量[11]。三氧療法給藥根據(jù)治療目標(biāo)和治療部位而不同，目前常用O3自體輸血(ozonated autohaemotherapy,O3-AHT)，其優(yōu)勢是取預(yù)定量血液，經(jīng)計算，可以注入精確的O2-O3混合氣體。少量血液在體外與O3發(fā)生快速反應(yīng)，產(chǎn)生各種生化產(chǎn)物后，輸回患者。其他治療方式包括通過肌肉、椎間盤內(nèi)和椎旁直接注射給藥。直腸注入是另一個常見的給藥方式。經(jīng)鼻、輸卵管、口腔、陰道、膀胱、胸膜和腹膜腔灌氣是需要慎重選擇的給藥途徑[12]。

臨床試驗(yàn)證明[12-15]，O2-O3療法在心血管、外周血管、神經(jīng)系統(tǒng)、退行性病、骨科、胃腸道和泌尿生殖系統(tǒng)病理方面的有效性，包括多發(fā)性硬化癥[16]、纖維肌痛[17]、糖尿病/潰瘍[18-19]、皮膚疾病/傷口愈合[20-21]、傳染病[12,22]、口腔科[23]以及骨髓炎[24]。

根據(jù)O3靶向相關(guān)分子機(jī)制，試圖尋找這些過程是否與卒中后肺炎發(fā)病機(jī)制相關(guān)，以推定其治療靶標(biāo)，為卒中后肺炎中應(yīng)用O3治療進(jìn)行理論準(zhǔn)備。

3 三氧療法作用機(jī)制

O3是一種三原子氣體分子，在自然界中是由于射線與大氣中的O2反應(yīng)產(chǎn)生，性質(zhì)很不穩(wěn)定，極易分解成O2和氧原子(O)，常溫下O3半衰期為20～30 min。天然的O3能阻擋紫外線，保護(hù)人體免受傷害。人體也會產(chǎn)生氧化劑攻擊入侵的病原體，除過氧化氫、超氧化物、次氯酸鹽和O2外，還包括O3。人外周血分離的帶有抗體的中性粒細(xì)胞，可通過水氧化途徑催化O3生成，從而有效殺滅細(xì)菌[25]。O3有免疫調(diào)節(jié)和抗炎、抗氧化活性，有抗菌、鎮(zhèn)痛、促進(jìn)氧合和血管舒張作用等[12,26]。

3.1 免疫調(diào)節(jié)及抗炎

O3和其他醫(yī)用氣體，如一氧化碳和一氧化氮具有雙重作用，具體取決于劑量和細(xì)胞的氧化-還原狀態(tài)。O3很容易溶解在血漿的水中，并被親水性抗氧化劑(如還原性谷胱甘肽、抗壞血酸和尿酸)作為犧牲性化合物而部分(20%～40%)淬滅，大部分與多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)反應(yīng)并由白蛋白運(yùn)輸[27]。治療范圍為10～80 μg (0.21～1.68 μmol)/ml，以產(chǎn)生精確微小的氧化應(yīng)激，從而引起無毒性的功效。O3是一種前藥，在反應(yīng)過程中快速消失，產(chǎn)生兩個重要產(chǎn)物：過氧化氫和脂質(zhì)氧化產(chǎn)物(lipid oxidative product,LOP)，最終以4-羥基壬烯(4-Hydroxynonenal,4-HNE,來自ω-6 PUFA)和4 羥基-2-己烯(4-hydroxy-2-hexenal,4-HHE,來自ω-3 PUFA 的反式)的形式存在[28]。

過氧化氫容易擴(kuò)散到免疫細(xì)胞，同時也是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的調(diào)節(jié)步驟，促進(jìn)多種免疫反應(yīng)[29-30]，特別是干擾素、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)和白細(xì)胞介素-2(interleukin-2,IL-2)的增加；IL-2 增加會啟動免疫反應(yīng)[31]。另外，過氧化氫激活核因子-κB (nuclear factor-κB,NF-κB)和轉(zhuǎn)化生長因子β (transforming growth factor-β,TGF-β)，從而增加免疫活性細(xì)胞因子的釋放，上調(diào)組織重塑。過氧化氫增強(qiáng)酪氨酸激酶活性，磷酸化IκB (NF-κB 的一個亞基)[32]，介導(dǎo)NF-κB 作用。低劑量O3抑制前列腺素合成，釋放緩激肽，增加巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞分泌物，促進(jìn)過氧化氫和一氧化氮水平，從而刺激IL-8 增加。IL-8還激活NF-κB。動物實(shí)驗(yàn)顯示[33]，使用O3可減輕和預(yù)防大腸桿菌誘導(dǎo)的腎臟系統(tǒng)炎癥反應(yīng)。

低劑量O3可促進(jìn)單核細(xì)胞形成和T 細(xì)胞活化。當(dāng)T 細(xì)胞抗原受體(T cell receptor,TCR)識別入侵者后，TCR 相關(guān)的蛋白激酶(70-kDa zeta-chain associated protein,ZAP-70)分子發(fā)生酪氨酸磷酸化反應(yīng)，激活磷脂酶Cγ1(phospholipase Cγ1,PLCγ1)[34]，產(chǎn)生兩個關(guān)鍵的第二信使：肌醇三磷酸酯(inositol triphosphate,IP3)和二?；视?diacyl glycerol,DAG)。IP3與其位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的受體IP3r 結(jié)合，導(dǎo)致Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)；細(xì)胞質(zhì)中Ca2+升高激活鈣調(diào)磷酸酶，從而使活化T 細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)脫磷酸化并將其轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中。NFAT 誘導(dǎo)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，如IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α 和干擾素-γ，同時還有DNA 上的免疫應(yīng)答元件。這些細(xì)胞因子具有促炎和趨化作用，促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其他炎性細(xì)胞聚集、浸潤，并增強(qiáng)其吞噬能力，以殺死局部病原體[33]。NFAT 也可以在其他細(xì)胞和組織中表達(dá)，自身也可以與DNA 結(jié)合。NFAT 與DNA 的結(jié)合主要通過核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)共存誘導(dǎo)。AP-1 通過促分裂原激活的蛋白激酶途徑激活，從而激活免疫應(yīng)答[28]。過氧化氫是一種活性氧，可以充當(dāng)O3的信使[35]，誘導(dǎo)NFAT或AP-1激活，從而刺激先天免疫系統(tǒng)，幫助細(xì)胞免于損傷。

由O3引起的中度氧化應(yīng)激會增加核因子-類胡蘿卜素2 相關(guān)因子2 (nuclear factor erythroid derived 2-like 2,Nrf2)活化，Nrf2 激活抗氧化反應(yīng)元件(anti-oxidative response element,ARE)的轉(zhuǎn)錄，即Keap1/Nrf2/ARE 信號通路，調(diào)控抗炎基因表達(dá)，抑制炎癥進(jìn)展[36]。誘導(dǎo)ARE 轉(zhuǎn)錄后，各種抗氧化劑酶響應(yīng)O3的短暫氧化應(yīng)激，水平升高，如過氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、過氧化氫酶、血紅素加氧酶-1、NADPH-醌-氧化還原酶和熱休克蛋白，它們與臨床多種疾病的自由基清除有關(guān)[12]。

3.2 刺激氧代謝和調(diào)節(jié)血管

O3是O2跨膜流動的刺激物。三氧療法繼發(fā)細(xì)胞內(nèi)O2含量增加，使線粒體呼吸鏈更有效[33]。O3-AHT 可增加紅細(xì)胞果糖磷酸激酶活性，從而增加糖酵解速度，進(jìn)而增加ATP 和2,3-二磷酸甘油酸酯(2,3-diphosphoglycerate,2,3-DPG)，2,3-DPG 使血紅蛋白解離平衡偏移，從而增加組織中O2的輸送。再加上一氧化氮合酶活性增加，O3-AHT 刺激區(qū)域灌注明顯增加[37]。反復(fù)治療可產(chǎn)生足夠LOP，到達(dá)骨髓，作為應(yīng)激源，促進(jìn)紅細(xì)胞生成和抗氧化酶上調(diào)。O3也引起煙酰胺腺嘌呤二核苷酸減少，并協(xié)助氧化細(xì)胞色素C。

O3可以改善血液循環(huán)，以及向缺血組織輸送氧氣[38]，增加抗氧化酶糾正慢性氧化應(yīng)激可增加成紅細(xì)胞分化，導(dǎo)致紅細(xì)胞增加，即“氧化預(yù)處理”[39]。此外，O3誘導(dǎo)產(chǎn)生血管舒張劑前列環(huán)素[31]，并通過血管內(nèi)皮細(xì)胞刺激一氧化氮產(chǎn)生[40]。這些事件有利于微循環(huán)水平血管擴(kuò)張，降低周圍血管阻力。

4 三氧療法應(yīng)用于卒中后肺炎

卒中后肺炎的發(fā)生與環(huán)境(如患者所處空間及醫(yī)源性侵入性操作)、病原體致病性、患者免疫與屏障功能受損相關(guān)。以下發(fā)病機(jī)制可能與O3治療靶點(diǎn)對應(yīng)。

4.1 免疫和抗炎作用

卒中后肺炎最常培養(yǎng)出的細(xì)菌為需氧革蘭氏陰性桿菌和革蘭氏陽性球菌，包括腸桿菌科(肺炎克雷伯菌、大腸桿菌)、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌和肺炎鏈球菌[6,41]。隨著抗生素的濫用，耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌變得越來越普遍，也時?？梢钥吹蕉嘀啬退幖?xì)菌。念珠菌通常代表定植或氣管受累[42]。與非臥床患者相比，大約75%危重患者感染革蘭氏陰性桿菌[43]。在革蘭氏陰性菌中，脂多糖似乎起了重要作用。

脂多糖與其主要受體Toll樣受體4(Toll-like receptors,TLR-4)結(jié)合[44]。細(xì)胞內(nèi)銜接蛋白(如MyD88)與TLR-4 結(jié)合并激活涉及細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶和p38 等多種細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)；TLR 激活巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，包括TNF、IL-1β 和IL-6，協(xié)調(diào)局部和全身炎癥反應(yīng)。TNF 和IL-1β 依次激活局部內(nèi)皮，誘導(dǎo)血管舒張，并增加血管通透性，使血清蛋白和白細(xì)胞募集到感染部位。此外，內(nèi)皮上組織因子(也稱“凝血因子Ⅲ”)增加，導(dǎo)致局部凝血級聯(lián)反應(yīng)，有助于防止微生物通過血液傳播。IL-1β 和IL-6 一起激活肝細(xì)胞，產(chǎn)生急性期蛋白，這些蛋白質(zhì)激活補(bǔ)體并調(diào)理病原體，以便巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞吞噬。這些信號的表達(dá)通過NF-κB途徑激活[45]。

微生物病原體可以通過多種致病方式，使機(jī)體感染。大腸桿菌使用效應(yīng)子逃避先天免疫應(yīng)答。效應(yīng)子之一OspG 與泛素化E2 蛋白結(jié)合，可阻止NF-κB 亞基-α (IκBα)抑制劑降解，從而抑制NF-κB 活化[46]。OspB 與OspF 作用，通過招募宿主因素改造染色質(zhì)，降低IL-8 水平[47]?？傮w上，效應(yīng)子減弱炎癥反應(yīng)，使細(xì)菌得以長期存活[48]。肺炎克雷伯菌免疫逃避策略的重要手段為阻止由NF-κB 和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPKs)控制的TLR依賴性激活：克雷伯菌可劫持去泛素化酶cylindromatosis (CYLD)和MAPKs 磷酸酶MKP-1；在組織水平，克雷伯菌利用IL-10 的抗炎特性塑造局部微環(huán)境，通過限制炎癥反應(yīng)實(shí)施免疫逃避[49]。銅綠假單胞菌的鞭毛、脂多糖和4 型菌毛有高度炎癥性，可被宿主模式識別受體(如TLR)識別，通過NF-κB信號通路引發(fā)炎癥反應(yīng)[50-51]。

動物實(shí)驗(yàn)證明，腦卒中導(dǎo)致與菌血癥和肺炎相關(guān)的細(xì)胞介導(dǎo)免疫持續(xù)下降，如單核細(xì)胞失活、淋巴細(xì)胞減少、Th1/Th2轉(zhuǎn)移，早期NK 細(xì)胞和T 細(xì)胞反應(yīng)受損，尤其是干擾素-γ 產(chǎn)生減少，誘發(fā)關(guān)鍵性抗菌防御缺陷[52]。腦卒中患者T 細(xì)胞快速丟失和功能失常是常見變化，與腦缺血后免疫抑制一致。腦卒中后，細(xì)胞免疫應(yīng)答降低、交感神經(jīng)活動增加，與較高的感染風(fēng)險相關(guān)[9-10,53]。

O3可增加巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞分泌，增強(qiáng)粒細(xì)胞吞噬能力，促進(jìn)單核細(xì)胞形成和T 細(xì)胞活化。過氧化氫誘導(dǎo)NFAT 激活，啟動免疫系統(tǒng)；同時通過Keap1-Nrf2-ARE 信號通路產(chǎn)生抗炎作用。與野生動物相比，Nrf2-/-動物表現(xiàn)出更嚴(yán)重的炎癥和組織損傷，推測Nrf2 信號傳導(dǎo)途徑在炎性疾病中具有保護(hù)作用[54]。激活肺泡巨噬細(xì)胞Nrf2，可對肺部炎癥產(chǎn)生保護(hù)作用，阻止向肺氣腫發(fā)展[55]。

4.2 改善血液循環(huán)和氧化預(yù)處理

O3改善血液循環(huán)和向缺血組織輸送氧氣的作用，以及2,3-DPG 水平增加、谷胱甘肽還原劑增加，我們推測O3處理可以部分改善因炎癥受損的氧化代謝。O3通過增加Keap1-Nrf2-ARE信號通路中的抗氧化酶，糾正慢性氧化應(yīng)激，增加成紅細(xì)胞分化，導(dǎo)致紅細(xì)胞增加，即氧化預(yù)處理。同時通過前列環(huán)素和一氧化氮的產(chǎn)生，改善微循環(huán)。

5 小結(jié)

三氧療法可能對卒中后肺炎有效，減少抗生素使用。機(jī)制主要?dú)w因于免疫和抗炎系統(tǒng)激活，細(xì)胞抗氧化酶活性上調(diào)，血小板生長因子釋放增強(qiáng)，血液循環(huán)和O2遞送改善組織氧合，增強(qiáng)新陳代謝[25]。Nrf2-ARE、NF-κB、NFAT、AP-1 等是O3發(fā)揮作用的主要信號通路。這種療法沒有副作用[56-57]?？蛇M(jìn)一步通過臨床試驗(yàn)證實(shí)其療效。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。