陳沛卓，洛文靖，程遠(yuǎn)國，任欣怡

（1.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海201203；2.上海益諾思生物技術(shù)股份有限公司，上海201203；3.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院，上海201203）

免疫原性是指免疫系統(tǒng)感知到生物制品中的“外來或非自我”或“危險(xiǎn)信號或應(yīng)激自我”，并對其產(chǎn)生特異性的免疫反應(yīng)。隨著更多的治療性蛋白在市場上的出現(xiàn)，被治療患者抗藥抗體（anti-drug antibody，ADA）反應(yīng)的發(fā)生率正在上升［1］。所有生物技術(shù)藥物都有可能引發(fā)宿主免疫反應(yīng)，這可能會導(dǎo)致無可預(yù)估的臨床后果或出現(xiàn)罕見又嚴(yán)重的不良事件［2］。非臨床研究表明，它們會中和藥物的活性，影響藥物的清除、血漿半衰期和組織分布，改變藥效或藥動(dòng)學(xué)，使在非臨床研究中觀察到的效應(yīng)可能并非藥物真正的藥理和（或）毒性反應(yīng)［3］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，ADA 與藥物及內(nèi)源性同系蛋白結(jié)合（交叉反應(yīng)）后，可能會導(dǎo)致該蛋白缺陷綜合征，對藥物的免疫應(yīng)答導(dǎo)致過敏反應(yīng)，甚至特異質(zhì)反應(yīng)［4］。免疫原性檢測是生物技術(shù)藥物臨床安全性評價(jià)的組成部分，藥物引起的免疫原性反應(yīng)（中和抗體和非中和抗體）可影響藥動(dòng)學(xué)、藥效和（或）毒性。因此，在非臨床和臨床研究中監(jiān)測和評估ADA非常重要。

目前免疫原性檢測方法有很多，常用的檢測方法包括ELISA 如橋聯(lián)法（雙抗夾心法）和直接法等、電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）檢測、放射免疫法和表面等離子共振法等。ADA 檢測結(jié)果有助于解釋藥物的免疫原性、藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)、安全性和有效性。但是檢測的準(zhǔn)確與否取決于分析方法的部分重要參數(shù)，如靈敏度和藥物耐受及特異性等。此外，還受其他多種因素的影響，包括檢測方法、樣本處理、樣本采集時(shí)間、藥物聯(lián)用和疾病狀況等，所以待檢樣本為其主要影響因素之一。由于待檢樣本中的成分較為復(fù)雜，既包括游離ADA，也有ADA 與過量藥物結(jié)合形成的ADA-藥物復(fù)合物，可導(dǎo)致假陰性結(jié)果。對于長半衰期抗體藥物，此問題尤其突出［5］。

1 藥物耐受

臨床Ⅲ期關(guān)鍵性試驗(yàn)中所獲得的樣本應(yīng)使用經(jīng)過充分驗(yàn)證的分析方法進(jìn)行檢測。在申請藥物上市許可時(shí)，需要提供該方法經(jīng)過全驗(yàn)證的證明數(shù)據(jù)。全驗(yàn)證需要證明該方法對于預(yù)期的ADA 檢測是適用的，其基本驗(yàn)證項(xiàng)包括臨界值、靈敏度和藥物耐受、特異性和選擇性、精密度、相關(guān)的重現(xiàn)性、某些測定條件的穩(wěn)健性和關(guān)鍵試劑的穩(wěn)定性。藥物耐受是指在一定陽性對照抗體存在的情況下，可被連續(xù)檢測為陽性時(shí)的最高藥物濃度，該驗(yàn)證項(xiàng)的目的是評估生物技術(shù)對藥物干擾的抵抗能力，是方法開發(fā)中的關(guān)鍵因素之一。

因操作方便、快捷及其高通量的檢測能力，ELISA常被用于免疫原性檢測。免疫原性檢測大多采用橋聯(lián)ELISA，通過包被藥物，用標(biāo)記的藥物檢測。此法的優(yōu)點(diǎn)是能檢測各類抗體亞型，無種屬特異性，可高通量檢測；缺點(diǎn)是不易檢測到低親和力的抗體，包被或標(biāo)記時(shí)可能會掩蓋或改變藥物的抗原表位，易受藥物本身的干擾。直接法則通過包被藥物，用標(biāo)記抗體檢測。此法的優(yōu)點(diǎn)是可能增加檢測低親和力抗體的能力，可高通量檢測；缺點(diǎn)是包被時(shí)可能會掩蓋或改變藥物的表位，僅檢測單一亞型，有種屬特異性，多次洗滌后低親和力抗體丟失。由于交叉反應(yīng)的存在，直接ELISA 不適用于治療性單克隆抗體藥物的檢測。

從受試者獲得的血清或血漿樣品是各種因子的復(fù)雜混合物，其可能干擾免疫原性測定中ADA 的檢測。樣本中既包括游離的ADA，也有ADA-藥物復(fù)合物。藥物本身是干擾因素之一，在待測樣本中藥物的含量過高時(shí)，用作捕獲和（或）檢測的標(biāo)記形式的藥物可能無法與樣品中的未標(biāo)記藥物競爭［6］，無法形成“夾心復(fù)合物”，導(dǎo)致免疫原性測定中潛在的假陰性結(jié)果。藥物耐受作為方法開發(fā)過程中主要關(guān)注點(diǎn)之一，盡可能消除藥物對測定體系的干擾，可改善免疫原性檢測中藥物耐受的問題。

2 改善藥物耐受的方法

改善免疫原性檢測中藥物耐受問題，可以從2 個(gè)角度考慮：①將藥物從待測樣本中去除。ADA檢測的主要干擾物質(zhì)為藥物本身，因此最直接的方法就是將藥物從待測樣本中清除，分離去除游離藥物，減少藥物干擾；②破壞血清中ADA-藥物復(fù)合物。當(dāng)ADA 以復(fù)合物的形式存在時(shí)，無法參與形成信號通路，使測定信號值比實(shí)際偏低，通過酸解離可將ADA從ADA-藥物復(fù)合物中解離。

藥物耐受作為免疫原性檢測方法領(lǐng)域的主要挑戰(zhàn)之一，本文歸納目前常用的改善藥物耐受的方法，包括液相ELISA、酸解離、沉淀與酸解離（pre?cipitation and acid dissociation，PandA）、磁珠提取與酸解離（bead extraction and acid dissocia?tion，BEAD）和磁珠提取與熱解離（bead-extraction and heat-dissociation，BEHD）。

2.1 液相ELISA

固相ELISA 是免疫原性測定應(yīng)用最廣泛的測定方法，其操作簡單，靈敏度高，測定成本低，但其藥物耐受低。為解決藥物耐受低的問題，液相ELISA保留了ECL 平臺的樣品處理方法（均相），即把樣品的前處理置于液體環(huán)境中，將生物素標(biāo)記的藥物和地高辛標(biāo)記的藥物混合（命名為Master Mix 溶液），待測樣品與Master Mix 溶液進(jìn)行過夜孵育，使其充分形成免疫復(fù)合物。在孵育結(jié)束后，用鏈霉親和素包被的板上捕獲免疫復(fù)合物，并使用抗地高辛抗體-辣根過氧化物酶和TMB 顯色液進(jìn)行檢測。液相ELISA更換了檢測系統(tǒng)，保持了ECL的一些優(yōu)勢［7］，如均相孵育使整個(gè)體系處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，更有利于形成正確的信號通路，從而提高對游離藥物干擾的耐受性；而且方法穩(wěn)定可靠，可減少對專用設(shè)備的依賴［6］。

2.2 酸解離

通過對樣本進(jìn)行酸化，使樣品的pH 值處于可使ADA-藥物復(fù)合物解離但不失ADA 活性的范圍內(nèi)，通常選用鹽酸或醋酸進(jìn)行酸化，于37℃下進(jìn)行溫育使解離更充分徹底［6］。在檢測前對樣品進(jìn)行酸解離［8］，可降低樣品中復(fù)合物對結(jié)果的干擾。需要注意的是，在酸解離后要進(jìn)行樣品中和，以確保樣品與相應(yīng)配體橋接，而此時(shí)也可使已解離的復(fù)合物重新結(jié)合，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，需要優(yōu)化條件如pH 值和酸暴露時(shí)間，以實(shí)現(xiàn)最大程度地減少干擾。運(yùn)用酸解離的樣品處理方法有以下2種。

2.2.1 親和捕獲洗脫

親和捕獲洗脫（affinity capture elution，ACE）使用2 塊96 孔板，一塊用于酸化，分離ADA-藥物復(fù)合物；另一塊則將ADA 包被于板上，生物素標(biāo)記的藥物作為檢測試劑，用酶標(biāo)儀測定吸光度值。用ELISA 系統(tǒng)和ECL 系統(tǒng)對ACE 進(jìn)行測試后發(fā)現(xiàn)，ELISA系統(tǒng)靈敏度更高，藥物耐受更好［4］。

ACE 在正常內(nèi)源性抗原濃度下無干擾，因此更適合進(jìn)行免疫原性測定。ACE 敏感度高，藥物耐受高，很少或無內(nèi)源性抗原干擾或鉤狀效應(yīng)。ACE 的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以增大檢測信號，用簡單的ELISA即可進(jìn)行測定。

2.2.2 固相萃取與酸解離

固相萃取與酸解離（solid-phase extraction with acid dissociation，SPEAD）［4］也是一種樣品前處理方法。首先將生物素標(biāo)記的藥物加入到樣品中，并在室溫下過夜培養(yǎng)。次日將生物素標(biāo)記的藥物復(fù)合物在室溫下結(jié)合于鏈霉親和素板。通過酸解離ADA-藥物復(fù)合物，消除可能導(dǎo)致干擾分析的過量未結(jié)合的藥物和其他血清蛋白，使游離的ADA 直接結(jié)合在ELISA板的表面。

這種方法有兩方面的限制［9］：①一些ADA 和（或）中和抗體（neutralizing antibody，Nab）具有高親和力和非常低的解離速率，因此過夜孵育不足以形成生物素-藥物和（或）ADA 復(fù)合物的新平衡。②高吸附板具有有限的吸附能力，限制了生物素標(biāo)記藥物的添加量；如果測試樣品中的藥物過多，添加的生物素標(biāo)記藥物的有限量只能回收一部分ADA 和（或）NAb，造成藥物耐受差，Nab 檢測準(zhǔn)確率低?？偟膩碚f，SPEAD 雖然在敏感性和藥物耐受方面與ACE 非常相似；不同的是SPEAD 中使用鏈霉親和素板去捕獲生物素標(biāo)記的藥物［10］，消除了放大檢測信號的可能性并導(dǎo)致需要ECL 系統(tǒng)，也意味著對抗原干擾更敏感，且專用儀器和材料的成本增加。

2.3 沉淀與酸解離

盡管上述方法對藥物耐受有所改善，但其無法保持高靈敏度和相對準(zhǔn)確性，因此在被治療患者中仍存在假陰性和低ADA 發(fā)生率的風(fēng)險(xiǎn)［11］。此方法中聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）沉淀的目標(biāo)分子或ADA-藥物復(fù)合物是基于自身相對分子質(zhì)量的大小，并由PEG 自身濃度所決定。PEG 濃度越高，相對分子質(zhì)量越低的目標(biāo)分子越易沉淀。為了減少非特異性血清蛋白如白蛋白和免疫球蛋白的沉淀，常采用低濃度PEG 沉淀相對分子質(zhì)量高的藥物形成ADA-藥物復(fù)合物。利用PandA 在酸性條件下吸附在高容量板的表面（防止重新結(jié)合），可用特定的檢測試劑檢測ADA 或目標(biāo)藥物。PandA 利用沉淀原理和酸解離，先將樣品中加入過量藥物，孵育形成ADA-藥物復(fù)合物。盡管有些樣品可能已含有與藥物有關(guān)的抗體，但這一步驟可確保樣品中任何剩余的游離ADA 均與藥物結(jié)合。然后在樣品中加入PEG 溶液，并在2～8℃下進(jìn)行過夜溫育，使總ADA 沉淀。第2 天，離心樣品使復(fù)合物沉淀成小顆粒，吸出上清液。在最終離心和去除上清液后進(jìn)行酸解離，將游離ADA 結(jié)合在鏈霉親和素板上，而后加入釕標(biāo)記的藥物，選用ECL進(jìn)行檢測。

與酸解離相比，PandA 方法的優(yōu)點(diǎn)在于其在高藥物濃度下仍可完全消除藥物干擾，并且保持測定靈敏度。PEG 沉淀已在文獻(xiàn)中描述用于表征循環(huán)免疫復(fù)合物［12］，并且使用放射免疫沉淀測定胰島素和胰島素衍生的藥物產(chǎn)品的ADA［13］。無論樣品中存在多少藥物，分析抗體滴度時(shí)均可使用該方法。該方法原理可用于減少或消除任何類型免疫測定中的干擾［11］。

2.4 磁珠提取與酸解離和磁珠提取與熱解離

BEAD 方法采用酸解和過量生物素結(jié)合2 個(gè)步驟從血清中提取ADA［14］。首先酸處理是將ADA 從所有復(fù)合物中釋放出來，這些非特異性和特異性復(fù)合物可能競爭或阻斷藥物捕獲并引入ADA 假陰性信號，從而低估總ADA 的量。其次通過在鏈霉親和素包覆的磁珠上與過量的生物素標(biāo)記的藥物結(jié)合提取游離ADA。ADA-生物素標(biāo)記藥物在磁珠上分離并洗滌后，利用酸解作用將其從珠上分離出來，再與可溶性生物素標(biāo)記藥物結(jié)合，捕獲在MSD 板上，ECL直接檢測。

BEAD 預(yù)處理已成功應(yīng)用于ADA 分析驗(yàn)證，準(zhǔn)確度高，并具有有效提高分析靈敏度和消除藥物或基質(zhì)干擾的能力。BEAD 預(yù)處理具有高效率和高準(zhǔn)確率的特點(diǎn)，過量生物素標(biāo)記藥物的添加可充分提取游離ADA，減少損失。該方法原理不僅是ADA測定的有效策略，也是Nab、藥動(dòng)學(xué)和生物標(biāo)志物分析的有效策略。

盡管BEAD 方法已成功應(yīng)用于多種NAb 分析，但一篇研究論文中提到，在對15組Nab檢測過程中發(fā)現(xiàn)，其中一組Nab 回收率低，原因是其遇酸不穩(wěn)定，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，因此不能進(jìn)行酸處理［9］。這意味著實(shí)際測試樣品中存在不耐酸的ADA，并且在BEAD 提取后可能檢測不到。對于酸不穩(wěn)定的樣本，可選用其他處理方法，如BEHD［9］。

BEHD 與BEAD 類似，均用磁珠進(jìn)行。不同的是，BEAD 用的是酸解離ADA；而BEHD 則用熱解離ADA。將樣品設(shè)定在62℃下振蕩孵育，62℃加熱步驟不僅解離Nab-藥物復(fù)合物以取代BEAD 中的酸處理，而且還不可逆地使樣品中的大部分藥物變性，留下完整的NAb。該方法具有良好的準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度，其方法運(yùn)用有待于后期更多研究結(jié)果。

3 結(jié)語

2019 版美國FDA《免疫原性指導(dǎo)原則》［15］指出，藥物耐受可通過使用破壞ADA-藥物復(fù)合物的酸解等方法進(jìn)行改進(jìn)。由于某些因素如方法選擇性、藥物性質(zhì)和陽性對照抗體類型等會影響藥物耐受，因此在方法開發(fā)過程中要對這些因素進(jìn)行評估。當(dāng)藥物是酸不穩(wěn)定的或靶點(diǎn)性質(zhì)特殊［13，16］時(shí)，酸解離可能會破壞藥物-靶點(diǎn)復(fù)合物，釋放多余靶點(diǎn)使得靶點(diǎn)干擾增多，在中和樣品時(shí)藥物靶點(diǎn)與捕獲和檢測試劑橋接，導(dǎo)致篩選測定中出現(xiàn)假陽性結(jié)果［17］。因此，可以通過在藥物谷濃度水平（CTrough）下收集血清樣本，最大限度地減少來自藥物的干擾。而在方法開發(fā)前期，是否對樣本進(jìn)行酸化，需要對藥物和靶點(diǎn)性質(zhì)進(jìn)行綜合評估。

由于藥物干擾的問題，樣品合適的前處理方法可以改善藥物耐受。受試者對藥物產(chǎn)生ADA 的免疫反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)因產(chǎn)品而異，準(zhǔn)確可靠的免疫原性檢測方法可用于評估生物技術(shù)藥物的免疫原性或者免疫相關(guān)的不良臨床反應(yīng)。由于酸處理操作簡便被廣泛使用，但酸處理并不適用于所有藥物的免疫原性檢測，van Schouwenburg 等［18］在研究中考察了采用酸處理方法檢測的ADA 結(jié)果與實(shí)際臨床免疫反應(yīng)間相關(guān)性，受試者為99 例使用阿達(dá)木單抗（adalimumab）治療3 年的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者。研究結(jié)果顯示，ADA 檢測為陽性和陰性患者在實(shí)際臨床療效中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其臨床相關(guān)性有限。BEAD 和BEHD 方法由于需要磁珠的參與，檢測成本問題限制了其應(yīng)用。PandA 方法可以有效消除藥物干擾，但操作步驟復(fù)雜，周期長，無法廣泛應(yīng)用于大樣本的檢測。

生物技術(shù)藥物是目前藥物研發(fā)的熱點(diǎn)，但幾乎所有的生物技術(shù)藥物都會有一定程度的免疫原性，可能會降低藥物療效或?qū)е聡?yán)重的不良反應(yīng)。因此，生物技術(shù)藥物的免疫原性評價(jià)越來越受重視。選擇最佳的檢測方法，是抗體藥物發(fā)展需要重點(diǎn)考慮的一個(gè)環(huán)節(jié)。雖然方法眾多，但每種方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)和針對性，沒有哪一種單一的方法，可以適合所有生物技術(shù)藥物免疫原性的評估。因此，在實(shí)際方法開發(fā)過程中，要根據(jù)藥物的實(shí)際情況采取最佳的檢測方法。