蔣慧靈,鄭倩華*,趙映,張薇,侯雨君,譚玉,李瑛,蔡定均

(1.成都中醫(yī)藥大學針灸推拿學院,成都 610072;2.成都中醫(yī)藥大學研究生院,成都 610072)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一種臨床常見的慢性功能性腸病,以反復發(fā)作的腹痛,伴排便習慣改變和(或)糞便形狀改變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)。最新的研究表明,根據(jù)羅馬Ⅳ標準,IBS全球總體患病率約為3.8%[1],就醫(yī)療費用及生活質量而言,IBS的全球影響也是不可忽略的[2]。目前研究表明IBS的發(fā)病與內臟高敏感、胃腸動力異常、腦-腸軸相互作用、腸道菌群紊亂及代謝異常、胃腸道感染與炎癥、精神心理因素、遺傳、腸道通透性增高等相關[3],內臟高敏是IBS重要的病理機制之一,其主要表現(xiàn)為引起內臟疼痛或不適的閾值降低,內臟感受器對生理性刺激敏感性增強及對傷害性刺激的反應性增強[4]。目前,內臟高敏常作為IBS的特征性指標[5],也是IBS臨床癥狀的重要病因之一,因此研究出一套持續(xù)穩(wěn)定、客觀、可重復性好及操作簡單的內臟高敏動物模型制備方法尤為重要。

現(xiàn)有IBS動物模型制作方法較多,如結直腸球囊擴張、病原體感染、炎性刺激物致炎、母嬰分離及改變胃腸激素等方法[6],其中CRD以其模型內臟高敏感性持續(xù)穩(wěn)定而應用最為廣泛[7]。CRD通過采用機械刺激因素造成大鼠慢性內臟高敏,其模型特點為操作簡單,結論可靠,模型內臟高敏感性明顯增高且持續(xù)穩(wěn)定,并且大鼠結直腸無明顯病理改變。本文對CRD誘導的IBS內臟高敏模型的制備方法進行整理與分析,為建立更有效穩(wěn)定的IBS內臟高敏動物模型提供研究思路,綜述如下。

1 CRD基本操作步驟

將球囊蘸少許醫(yī)用石蠟油以潤滑后,輕柔地從大鼠肛門插入至結直腸,固定球囊,擴張球囊,維持一定時間,給予直腸腔內物理性的壓力刺激,然后放氣收回球囊。每次刺激前可先輕柔大鼠肛門,促使其排便,減少加壓過程中大鼠排便對CRD的影響。采用連續(xù)多天多次的重復性機械刺激方式制作慢性內臟高敏感模型。

2 實驗對象的選擇

文獻回顧發(fā)現(xiàn),CRD主要采用清潔級大鼠作為實驗對象,以SD大鼠[8-30]及Wistar大鼠[31-36]使用最多。其中以SD大鼠乳鼠使用頻率最高,其次為SD成年大鼠。

2.1 大鼠乳鼠CRD模型制備方法

2000年,Al-Chaer等[26]首次通過CRD制備出慢性內臟高敏大鼠模型,該模型采用SD大鼠雄性乳鼠為實驗大鼠。具體方法為:于大鼠出生后8~21 d給予結直腸球囊擴張刺激,期間乳鼠與母鼠不分籠。球囊采用血管成形術球囊(長20 mm,直徑3 mm),通過注水(0.3 mL)的方式擴張球囊,保持球囊壓力60 mmHg(1 mmHg=0.133KPa,用血壓計測量)。每天2次,每次持續(xù)1 min,2次間隔30 min,在1 h內完成2次擴張。CRD結束后2周為休息期,即不進行任何刺激及操作。乳鼠出生后第26天與母鼠分籠。該模型大鼠乳鼠內臟敏感神經(jīng)元興奮性明顯增高,同時結腸組織無明顯可識別病理變化,符合IBS功能性腸病的病理特點。此后該造模方法在國際范圍內廣泛應用。

2.2 成年大鼠CRD聯(lián)合其他因素模型制備方法

成年大鼠CRD多與其他刺激因素聯(lián)合造模,使獲得的模型更加穩(wěn)定可靠。其他刺激因素包括:母嬰分離、醋酸灌腸、束縛、番瀉葉灌胃、夾尾刺激等。由于CRD模型內臟高敏感性穩(wěn)定可靠,同時上述刺激因素單一,僅模擬IBS某一方面,如母嬰分離較好地模擬IBS致病因素,但在模擬IBS胃腸道功能紊亂癥狀方面具有局限性。因此,上述刺激因素常自由組合使用,目前常用組合方式包括:母嬰分離+醋酸灌腸+CRD、CRD+肢體束縛、番瀉葉及冰醋酸灌腸+固定器束縛+CRD+夾尾刺激等方法。

陶麗媛等[16]采用CRD聯(lián)合肢體束縛法成功建立IBS內臟高敏模型,選擇8周齡SD大鼠造模。造模第1~14天,每天同一時間進行CRD,每天2次,連續(xù)2周;第10~14天,聯(lián)合肢體束縛(限制肩、雙前肢及胸部,不限制頭部的活動);每次束縛持續(xù)2 h,連續(xù)5 d。該模型的內臟敏感持續(xù)性不如乳鼠期結直腸擴張,模型正常飼養(yǎng)至18周齡時,接受相同CRD刺激后內臟敏感性沒有增高,反而低于8周齡時期,這提示大鼠內臟敏感性隨周齡增加而下降,同時對相同刺激的耐受性也隨周齡增加而提高。

李依潔等[28]采用番瀉葉灌胃聯(lián)合冰醋酸灌腸+固定器束縛、CRD+夾尾刺激,成功建立脾腎陽虛證腹瀉型IBS模型。具體如下:選擇4周齡SD大鼠造模,造模周期共4周。全周期(4周)予番瀉葉濃縮劑灌胃,每次每只2.0~2.5 mL,每天1次;于造模前2周注入0.5%冰醋酸,劑量從0.2 mL開始,逐漸增加至0.5 mL,同時以大鼠固定器束縛大鼠,時間從0.5 h逐漸加至1 h;于造模后2周進行結直腸擴張,每次擴張持續(xù)3~5 min,每天2次,同時聯(lián)合采用卵圓鉗夾尾刺激。該造模方法以大鼠固定束縛、夾尾刺激聯(lián)合CRD進行行為學應激,誘導肝郁因素;以番瀉葉灌胃、冰醋酸灌腸進行化學性刺激,模擬脾虛因素,番瀉葉及冰醋酸寒涼之物,極易損傷機體陽氣,日久累及腎陽,最終出現(xiàn)脾腎陽虛證[28]。該方法以長周期、多種刺激因素模擬了IBS患者的病程演變,是較為理想的模型制備方法。

由于成年大鼠CRD造模時采用多種刺激因素(化學刺激、物理刺激及心理應激等)聯(lián)合,刺激量本身較大,因此與乳鼠CRD模型相比,聯(lián)合其他因素造模時CRD機械刺激量相應減少,其擴張頻率及擴張持續(xù)時間均縮短。

3 CRD之間的差異

3.1 壓力的產(chǎn)生

3.1.1 球囊種類

目前CRD模型常用的球囊主要有以下幾種:經(jīng)皮冠狀動脈成形術球囊 (PTCA球囊)[10,12-14,17-18,20,26]、血管成形術球囊[16-17,21,25,32,36]、人血管重建氣囊[8,11,15,22,25,30]、雙腔兒科導尿管(6F)[9,28,32-34,36]、一次性無菌雙腔導尿管(8F)[16,24]及自制球囊[19,23,27,29,31,35]。其中因PTCA球囊延展性好且不易破裂最常用。

3.1.2 球囊插入深度

目前CRD模型的球囊插入深度差異較大,尚未有明確統(tǒng)一的標準。查閱現(xiàn)有文獻發(fā)現(xiàn),對球囊深度的描述包括定位、根據(jù)球囊大小確定深度及具體深度三類。如球囊插入至結直腸[14];將人血管重建氣囊(2 mm×2.5 mm)全部插入[8,30];插入距肛門2~3 cm[9,28,32]、1 cm[16]。由于各模型選擇的球囊不同,以及實驗動物年齡的差異,因此球囊插入深度差異較大,從2 cm變化至7 cm,若不考慮球囊種類,僅從插入深度來看,插入深度大致分為3類:2 cm[19,23]、 3 ~ 5 cm[17,24,27,29,34-35]、 6 ~ 7 cm[9,29,31,36]。其中3~5 cm最常用,由于該長度球囊剛好達到大鼠的結腸部位。

3.1.3 擴張持續(xù)時間

多數(shù)模型的建立均參照Al-Chaer等[26]的方法,每次擴張持續(xù)1 min,少數(shù)采用30 s。若重復多次,則每次間隔30 min或5 min[9]。若擴張持續(xù)時間過短,模型的內臟高敏性不明顯,模型制備不成功;如果擴張持續(xù)時間過長,易引起腸道粘膜局部缺血,導致造模失敗。

3.2 壓力的檢測

3.2.1 擴張壓力值的選擇

目前壓力值主要有兩類:固定型及階梯式漸進型。固定型壓力值主要采用Al-Chaer等[26]方法的壓力值,即60 mmHg,使用頻率最高。階梯漸進型即擴張壓力隨著大鼠年齡的增加而增加,以避免乳鼠結直腸損傷甚至死亡,降低其他因素對模型的影響,提高造模成功率。李延青等[35]發(fā)現(xiàn)由于乳鼠周齡較小,在進行CRD刺激時,易造成乳鼠內臟損傷甚至死亡。因此,李延青等[35]選擇8日齡及15日齡Wistar大鼠,在進行CRD之前,提前確定乳鼠結腸刺激的最適壓力,以減少實驗偏差及乳鼠死亡數(shù)量,最終確定8日齡大鼠結腸刺激壓力為30 mmHg(弱刺激組)、45 mmHg(強刺激組),15日齡大鼠結腸刺激壓力為60 mmHg。同時在造模時根據(jù)大鼠年齡選擇壓力值,大鼠出生后8~14 d選擇30 mmHg(弱刺激組)及45 mmHg(強刺激組),大鼠出生后15~21 d選擇60 mmHg。結果顯示30 mmHg與45 mmHg兩組之間均造成慢性內臟高敏且實驗結果無明顯差異,這提示應用CRD造模時,可以選擇最小壓力刺激,仍可以造成慢性內臟高敏性,同時可降低死亡率。唐影[15]在大鼠出生后8~10 d予以40 mmHg,11~12 d予以60 mmHg,13~14 d予以80 mmHg,避免了早期過高的壓力對乳鼠結直腸造成的機械性創(chuàng)傷(如出血、破裂等)。

3.2.2 壓力測定儀器的選擇

壓力測定儀器以血壓計[8,21,25,29-31]、壓力泵(計)[35]和檢壓計[11,15]為主。

3.3 CRD刺激頻率與周期

目前進行CRD的周期主要有兩大類:連續(xù)性CRD刺激和間斷CRD刺激。連續(xù)性CRD刺激指每天進行CRD刺激,每天1次[10-12,14-15,18,21-22,24,30]、2次[16,19,20,26,28,31]或3次[9,34,36]。 如大鼠出生后第8~21天[17-21,23,32],持續(xù)2周;出生后第8 ~ 14天[11,15,35]或第15天[8,22,25],持續(xù)1周左右;間斷CRD刺激指間隔固定天數(shù)(一般間隔2 d)進行CRD刺激,如出生后在第8、10、12天或第14天[10,12-14]給與刺激。連續(xù)性CRD刺激刺激量較大,其模型內臟高敏性更加持續(xù)穩(wěn)定,但連續(xù)的CRD刺激易造成大鼠結直腸病理損傷,如粘膜破損等,動物死亡率較高[35]。間斷CRD刺激給予實驗動物一定的休息期,刺激量較小,不易對大鼠結直腸粘膜造成損傷,不易造成動物死亡,但其內臟高敏性持續(xù)時間較短,因此間斷CRD刺激常與其他刺激因素聯(lián)合,以增加造模成功率。

4 模型評價指標

目前主要采用腹壁撤退反射[37]及腹外斜肌放電檢測[8,11,15,25]評價模型內臟高敏感性;采用一般情況[9,14,28,31,32]、糞便情況[11,26,30]及腸道動力檢測[12,17,18,21,32]評價模型胃腸道紊亂癥狀及糞便情況;采用結直腸組織病理學[18,19,21,22,24,25,28,30-32,35]評價模型結直腸組織情況。

5 討論

CRD方法操作簡單,無需麻醉,重復性好;且造模后內臟高敏性持續(xù)穩(wěn)定。乳鼠CRD后出現(xiàn)慢性內臟高敏,且可持續(xù)至其成年。CRD造模后動物可出現(xiàn)毛發(fā)干枯毛躁,糞便性狀改變等,且腸道無明顯炎癥等器質性的病理學變化,符合IBS的長期慢性病程及臨床癥狀,也符合IBS屬于功能性腸病的特點。

CRD通過直腸腔內擴張產(chǎn)生的機械刺激因素直接作用于結直腸平滑肌細胞,引起腸道內外周感受器敏感性增高,從而導致脊髓背角神經(jīng)元興奮性增加,產(chǎn)生痛敏化反應,引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)對傷害性刺激傳入擴大化并產(chǎn)生記憶,從而引起模型慢性內臟高敏感性持續(xù)存在[38]。由于新生期接受反復的CRD刺激,導致結腸粘膜基礎離子轉運增加,可能直接導致腸腔內含水量增加,同時長期的CRD刺激會引起平滑肌過度收縮,從而導致新生期乳鼠成年后大便疏松、水樣便增加,且結腸內無明顯炎癥及組織學變化。因此,乳鼠CRD被認為是IBS-D的合適模型[2]。Al-Chaer等[26]研究發(fā)現(xiàn)成年大鼠進行CRD刺激不會產(chǎn)生慢性內臟高敏,可能的解釋是新生兒期神經(jīng)系統(tǒng)與成年期神經(jīng)系統(tǒng)相比擁有長期可塑性。因此,以成年大鼠為實驗對象的CRD造模法,多采取聯(lián)合其他刺激因素的方式使慢性內臟高敏性持續(xù)且穩(wěn)定。

單一的刺激因素如母嬰分離、醋酸灌腸、束縛、番瀉葉灌胃、夾尾等僅模擬IBS病因癥狀等某一方面,均有一定的局限性。如夾尾能較好地模擬IBS致病因素及胃腸道功能紊亂癥狀,但其模型內臟高敏性持續(xù)時間較短,在模擬IBS慢性病程方面具有局限性[39];醋酸灌腸可致腹痛腹瀉等臨床癥狀,但模型結直腸組織可見炎癥粘連[40];慢性束縛應激為非損傷應激且接近人的心理應激[41],但易對實驗動物產(chǎn)生耐受。CRD模型內臟高敏性穩(wěn)定可靠,但其在模擬IBS致病因素等方面具有局限性。因此,CRD聯(lián)合其他刺激因素可以較全面地模擬IBS病因、病機、臨床癥狀等方面,從而獲得穩(wěn)定可靠的模型。

當然CRD也有一定的局限性,如采用乳鼠作為對象進行造模時,因乳鼠周齡較小,機體各系統(tǒng)較脆弱,操作難度大,且造模周期長,死亡率較高。對于成年鼠,由于采用單一CRD造模穩(wěn)定性欠佳,內臟高敏持續(xù)性不如乳鼠,所以往往聯(lián)合其他刺激因素進行造模。刺激因素的增加,導致不可控因素增加,使得造模操作難度加大。目前CRD尚未有統(tǒng)一的操作標準,在采用的球囊種類、擴張壓力、造模周期等方面均存在較大差異。這些差異可能是由于實驗所選擇的動物年齡、以及所涉及臨床亞型不同所造成;也有可能是CRD的廣泛應用,研究者們在最初CRD造模方法基礎上不斷改進,從而產(chǎn)生的差異。

目前CRD與中醫(yī)辨證相關研究較少,筆者閱讀文獻后發(fā)現(xiàn),在模擬IBS中醫(yī)證型方面多采用聯(lián)合其他刺激因素造模,母嬰分離、束縛及夾尾等刺進模擬致病因素,產(chǎn)生行為學應激,誘導肝郁因素;番瀉葉灌胃聯(lián)合冰醋酸灌腸,番瀉葉及冰醋酸均為寒性之物,損傷脾陽,日久及腎,腎陽亦不足;CRD優(yōu)勢在于延長模型穩(wěn)定性。因此,CRD聯(lián)合其他刺激因素主要用于模擬肝郁脾虛證和脾腎陽虛證。但目前尚無CRD模型的中醫(yī)證型客觀評價指標,各證型也缺乏統(tǒng)一的造模標準。同時,根據(jù)大便性狀IBS可分為四個亞型包括腹瀉型(IBS-D)、便秘型(IBS-C)、混合型(IBS-M)以及不確定型(IBS-U)。臨床診治IBS患者時,確定患者所患亞型為治療的前提與療效的保證。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn),單一使用CRD造模難以確定模型的IBS亞型,同一批經(jīng)CRD方法造模的大鼠可出現(xiàn)各種亞型,因此在研究IBS具體某一亞型時,不宜單一使用CRD造模,可聯(lián)合其他刺激因素。

6 小結

動物實驗是科研先導,建立成功的動物模型是實驗成功的關鍵環(huán)節(jié)。綜上所述,根據(jù)實驗對象的選擇,可將結直腸擴張法分為乳鼠CRD和成年大鼠CRD聯(lián)合其他刺激因素兩大類。隨著IBS相關研究的進一步發(fā)展,研究者們根據(jù)不同的實驗目的,可以選擇合適的造模方法。目前中醫(yī)證型的IBS模型制備方法尚不成熟,缺乏客觀的IBS中醫(yī)證型的評價標準,使用CRD動物模型研究IBS中醫(yī)證型的模型評價指標等方面對于中醫(yī)研究IBS具有重要科學意義。