劉明娟，韓瑞霞，李 鐵，李江濤

(1.河北省第七人民醫(yī)院泌尿外科，河北 保 定 073000 2.河北省老年病醫(yī)院泌尿外科，河北 石家莊 050000)

前列腺癌(PC)是我國(guó)男性中最常見的癌癥之一，也是癌癥相關(guān)死亡率的第二大誘因，2019年我國(guó)新診斷前列腺癌病例為22萬(wàn)例，與癌癥相關(guān)的死亡為月3萬(wàn)例[1]。傘形科植物白芷的干燥根提取的歐前胡素具有多種生物活性，據(jù)報(bào)道歐前胡素可抑制癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡。先前的研究表明歐前胡素通過抑制細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞周期和凋亡[2]。Rho關(guān)聯(lián)含卷曲螺旋結(jié)合蛋白激酶1(ROCK1)是Ras同源基因家族成員A(RhoA)的關(guān)鍵下游效應(yīng)子。在一系列惡性腫瘤中，例如乳腺癌、前列腺癌和胃癌，已經(jīng)檢測(cè)到ROCK1表達(dá)升高，其與預(yù)后不良相關(guān)，RhoA水平升高與PC風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)[3]。RhoA也可能增加PC細(xì)胞的體外增殖，而反義介導(dǎo)的RhoA表達(dá)抑制可抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)并阻止PC細(xì)胞侵襲性[4]。激活的ROCK1通過有絲分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)/磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/絲蘇氨酸蛋白激酶(Akt)途徑使信號(hào)磷酸化。這些信號(hào)在PC細(xì)胞增殖和凋亡抑制中起重要作用[5]。目前關(guān)于RhoA/ROCK1信號(hào)通路與PC細(xì)胞侵襲機(jī)制的研究較少，因此，本研究擬探討歐前胡素對(duì)人前列腺癌PC3細(xì)胞增殖、凋亡及RhoA/ROCK1信號(hào)通路的影響，為歐前胡素治療前列腺癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要藥物、試劑及儀器:歐前胡素(陜西永源生物技術(shù)有限公司，原料藥，純度98%，批號(hào)YYI-062)；5-氟尿嘧啶(武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司，原料藥，純度99%，批號(hào)TY0987-01)；DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)26140-063)；胎牛血清(美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)WS12052)；二甲基亞砜、TRIzol試劑(碧云天生物科技有限公司，批號(hào)FCFC012、SE-36584)；噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒(美國(guó)Promega公司，批號(hào)LE23696)；Transwell腔室系統(tǒng)(美國(guó)Corning Costar公司，批號(hào)TY1236)；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD公司，批號(hào)LI21458-R)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq熒光定量PCR試劑盒(日本Takara公司，批號(hào)RR149B、DRR057A)；放射免疫沉淀裂解緩沖液、二辛可寧酸蛋白質(zhì)定量試劑盒(德國(guó)默克公司，批號(hào)159696、K36514)；硝酸纖維素膜、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(密理博中國(guó)有限公司，批號(hào)RF-36545、FT-6584)；RhoA、ROCK1、GAPDH單克隆抗體(武漢艾美捷科技有限公司，批號(hào)H00000387-M04、JT-58574、JS-10033)；兔抗人二抗(美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司，批號(hào)YU-3654)；ELx800型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)；SD-98型倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；FACScan型流式細(xì)胞儀(美國(guó)通用公司)；ABI7900型實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(美國(guó)ABI公司)；SmartView Pro 2000型凝膠成像儀(北京金恒祥儀器有限公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組:人前列腺癌PC3細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，批號(hào)CSTC-2020010307，將PC3細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境為：37℃、5%CO2、2% O2、93%N2。 分組設(shè)計(jì)：PC3細(xì)胞組：細(xì)胞濃度為5×106/mL的人前列腺癌PC3細(xì)胞液在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)；5-氟尿嘧啶組：人前列腺癌PC3細(xì)胞培養(yǎng)方法同PC3細(xì)胞組，并加入濃度為100μg/mL的5-氟尿嘧啶[6]；歐前胡素低、高劑量組：人前列腺癌PC3細(xì)胞培養(yǎng)方法同PC3細(xì)胞組，各組分別加入濃度為60μg/mL、120μg/mL的歐前胡素[7]。以上各組每孔設(shè)6個(gè)平行樣，培養(yǎng)72h。

1.3細(xì)胞增殖水平測(cè)定:將每孔2×103個(gè)PC3細(xì)胞接種到96孔微量滴定板中，于37℃在5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)48h。將10μL MTT試劑(5 mg/mL)添加到100μL培養(yǎng)基中，并在37℃下孵育4h。除去培養(yǎng)基，并加入二甲基亞砜(150μL/孔)。使用酶標(biāo)儀測(cè)量490 nm處的吸光度OD值，存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值- PC3細(xì)胞組OD值)/(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值)×100%?？字泻信囵B(yǎng)基，但沒有細(xì)胞用作空白對(duì)照。

1.4細(xì)胞侵襲遷移水平測(cè)定:各組人前列腺癌PC3細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，將細(xì)胞重懸于無(wú)血清培養(yǎng)基中(細(xì)胞密度為8×103/mL)。將每組總共200μL細(xì)胞懸液添加到Matrigel包被的Transwell腔室系統(tǒng)中，并向基底外側(cè)室中添加含有100mL/L胎牛血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)48h后，將剩余的細(xì)胞用乙醇固定并用結(jié)晶紫染色，將室的基底膜風(fēng)干并在倒置顯微鏡下檢查，并隨機(jī)選擇六個(gè)視野以獲取侵襲細(xì)胞數(shù)量的平均值并拍攝照片。

1.5細(xì)胞凋亡水平測(cè)定:各組人前列腺癌PC3細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，將細(xì)胞用胰蛋白酶消化并用PBS緩沖液洗滌兩次。然后將細(xì)胞用70%的冰冷乙醇固定，使用Annexin V-FITC/PI試劑盒進(jìn)行分析。使用流式細(xì)胞儀通過熒光激活細(xì)胞分選分析染色的細(xì)胞后，生成細(xì)胞凋亡直方圖。FACS生成的直方圖由Cell Quest(Becto-Dickinson)分析，以確定每個(gè)階段中細(xì)胞的百分比。

1.6細(xì)胞RhoA、ROCK1 mRNA水平測(cè)定:使用TRIzol試劑提取總RNA，并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采用SYBR Premix Ex Taq熒光定量PCR試劑盒通過qRT-PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成，使用引物序列：RhoA正向：5'-GCAGTTGTGCTCCTGAAGAA-3'，RhoA反向：5'-CGGGCGGCCAGAAACTACTG-3'；ROCK1正向：5'-GTGCCCAAAGAAAGGTGCTG-3'，ROCK1反向：5'-AGGAGGGGAGCCATCCATAG-3'；GAPDH正向：5'-GTAAAGACCTCTATGCCATCA-3'，GAPDH反向：5'-GGACTCATCGTACTCCTGCTG-3'。GAPDH基因用作標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照。PCR總反應(yīng)體系(10μL)為：SYBR Premix Ex Taq 4 μL，cDNA模板 1μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，去離子水4 μL。熱循環(huán)參數(shù)為：95℃ 60s，95℃ 20s，57℃ 30s，70℃ 40s，78℃ 20s，共30個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法計(jì)算RhoA、ROCK1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.7細(xì)胞RhoA、ROCK1蛋白水平測(cè)定:各組人前列腺癌PC3細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，將細(xì)胞用放射免疫沉淀裂解緩沖液在冰上裂解30min，并在4℃下以10000×g離心10min。使用二辛可寧酸蛋白質(zhì)定量試劑盒來(lái)測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。取總共30μg總蛋白用于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，并用Tween 20制備的5%脫脂奶粉封閉1.5h。然后將膜與RhoA(1∶1000)、ROCK1(1∶1000)、GAPDH(1∶1000)一抗在4℃孵育過夜，然后將兔抗人二抗(1:5000)與膜在室溫下孵育2h，通過增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色并由凝膠成像儀拍照。使用Quantity One軟件分析蛋白質(zhì)條帶的灰度值。

2 結(jié) 果

2.1各組人前列腺癌PC3細(xì)胞OD值、存活率比較:與PC3細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組、歐前胡素低、高劑量組OD值、存活率降低(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，歐前胡素低、高劑量組OD值、存活率升高(P<0.05)；與歐前胡素低劑量組比較，歐前胡素高劑量組OD值、存活率降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組人前列腺癌PC3細(xì)胞OD值存活率比較

2.2各組人前列腺癌PC3細(xì)胞侵襲遷移能力比較:與PC3細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組、歐前胡素低、高劑量組穿膜數(shù)降低(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，歐前胡素低、高劑量組穿膜數(shù)升高(P<0.05)；與歐前胡素低劑量組比較，歐前胡素高劑量組穿膜數(shù)降低(P<0.05)。見表2、圖1。

圖1 各組人前列腺癌PC3細(xì)胞穿膜數(shù)數(shù)目比較(結(jié)晶紫染色，200倍)注:A：PC3細(xì)胞組，B：5-氟尿嘧啶組，C：歐前胡素低劑量組，D：歐前胡素高劑量組

表2 各組人前列腺癌PC3細(xì)胞侵襲遷移能力比較

2.3各組人前列腺癌PC3細(xì)胞凋亡率比較:與PC3細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組、歐前胡素低、高劑量組凋亡率升高(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，歐前胡素低、高劑量組凋亡率降低(P<0.05)；與歐前胡素低劑量組比較，歐前胡素高劑量組凋亡率升高(P<0.05)。見表3、圖2。

圖2 各組人前列腺癌PC3細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞圖注:A：PC3細(xì)胞組，B：5-氟尿嘧啶組，C：歐前胡素低劑量組，D：歐前胡素高劑量組

表3 各組人前列腺癌PC3細(xì)胞凋亡率比較

2.4各組人前列腺癌PC3細(xì)胞RhoA、ROCK1mRNA表達(dá)水平比較:與PC3細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組、歐前胡素低、高劑量組RhoA、ROCK1 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，歐前胡素低、高劑量組RhoA、ROCK1 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)；與歐前胡素低劑量組比較，歐前胡素高劑量組RhoA、R71.1mm。80.8mm(+28.2mm,94.7mm)〗51.1mm。80.9mm(+8.2mm,3.7mm)〗OCK1 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組人前列腺癌PC3細(xì)胞RhoA ROCK1 mRNA表達(dá)水平比較

2.5各組人前列腺癌PC3細(xì)胞RhoA、ROCK1蛋白表達(dá)水平比較:與PC3細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組、歐前胡素低、高劑量組RhoA、ROCK1蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，歐前胡素低、高劑量組RhoA、ROCK1蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與歐前胡素低劑量組比較，歐前胡素高劑量組RhoA、ROCK1蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。見表5、圖3。

表5 各組人前列腺癌PC3細(xì)胞RhoA ROCK1蛋白表達(dá)水平比較

圖3 各組人前列腺癌PC3細(xì)胞RhoA、ROCK1蛋白表達(dá)水平印跡圖注:A：PC3細(xì)胞組 B：5-氟尿嘧啶組 C：歐前胡素低劑量組 D：歐前胡素高劑量組

3 討 論

草藥及其提取物可提供具有多種生物學(xué)功能的多種植物化學(xué)物質(zhì)。在這些植物化學(xué)物質(zhì)中，歐前胡素涉及不同細(xì)胞系統(tǒng)的生物化學(xué)反應(yīng)，在植物生物化學(xué)和生理學(xué)中起著重要作用，包括抗氧化劑，酶抑制劑和有毒物質(zhì)的前體[8]。在其多種生物學(xué)特性中，其抗腫瘤活性和抗增殖作用已得到廣泛研究和報(bào)道。本研究中，與PC3細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組、歐前胡素低、高劑量組OD值、存活率、穿膜數(shù)降低，凋亡率升高；這說(shuō)明，歐前胡素能明顯抑制人前列腺癌PC3細(xì)胞增殖、侵襲，促進(jìn)其凋亡。有研究表明，歐前胡素在腫瘤細(xì)胞系中顯示出較強(qiáng)細(xì)胞毒性活性，歐前胡素對(duì)肺癌細(xì)胞系具有顯著的抗增殖活性[9]。這與本研究結(jié)果一致。

侵襲-轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)的初始步驟包括細(xì)胞間粘附的喪失、侵襲局部微環(huán)境、血管內(nèi)滲入血液和淋巴管系統(tǒng)以及滲入遠(yuǎn)處組織的實(shí)質(zhì)。該過程由上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)控制，通過該過程，上皮細(xì)胞喪失其上皮特征并獲得間充質(zhì)細(xì)胞的許多屬性，包括與上皮細(xì)胞片的結(jié)合喪失以及獲得細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性、侵襲性和抗凋亡性[10]。EMT程序涉及上皮蛋白表達(dá)的上調(diào)，特別是RhoA。RhoA是上皮表型的下游效應(yīng)子，并且是EMT誘導(dǎo)因子抑制的靶標(biāo)，當(dāng)RhoA過表達(dá)時(shí)，會(huì)觸發(fā)許多與EMT相關(guān)的表達(dá)[11]。EMT可能僅涉及癌細(xì)胞的一小部分-少數(shù)位于癌細(xì)胞內(nèi)上皮和基質(zhì)之間的界面。實(shí)體瘤的進(jìn)展涉及EMT在空間和時(shí)間上的發(fā)生，從而腫瘤細(xì)胞獲得更具侵襲性和轉(zhuǎn)移性的表型。RhoA的上調(diào)是轉(zhuǎn)移性癌癥中最常報(bào)道的現(xiàn)象之一，ROCK1在乳腺癌中具有促進(jìn)作用[12]。生物信息學(xué)分析顯示ROCK1是RhoA的潛在靶目標(biāo)[13]。體外細(xì)胞學(xué)研究表明，ROCK1與乳腺癌細(xì)胞的體外遷移能力呈正相關(guān)[14]。相比較具有低轉(zhuǎn)移能力和低表達(dá)ROCK1的乳腺癌MCF-7細(xì)胞，高表達(dá)ROCK1可使這些細(xì)胞獲得更高的轉(zhuǎn)移潛能。在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中，ROCK1低表達(dá)顯著抑制了細(xì)胞遷移能力。ROCK1能夠抑制原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中caspase-3的活性。研究發(fā)現(xiàn)抑制RhoA和ROCK1的表達(dá)能夠誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡[15]。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，與PC3細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組、歐前胡素低、高劑量組RhoA、ROCK1 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低；且歐前胡素高劑量組RhoA、ROCK1 mRNA和蛋白表達(dá)水平低于歐前胡素低劑量組。說(shuō)明歐前胡素可抑制人前列腺癌PC3細(xì)胞侵襲遷移、促進(jìn)其凋亡水平，其機(jī)制可能與歐前胡素可抑制人前列腺癌PC3細(xì)胞RhoA、ROCK1 mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制RhoA/ROCK1信號(hào)通路的激活有關(guān)。

綜上所述，歐前胡素能明顯抑制人前列腺癌PC3細(xì)胞增殖、侵襲，促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與歐前胡素可抑制人前列腺癌PC3細(xì)胞RhoA、ROCK1 mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制RhoA/ROCK1信號(hào)通路的激活有關(guān)。