楊少輝，許紅霞，孫衛(wèi)強，崔慧君，唐 麗

(山東省文登整骨醫(yī)院臨床藥學科，山東 威海 264400)

骨關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種常見的慢性、進行性骨關節(jié)疾病，多見于中老年人，關節(jié)軟骨破壞及繼發(fā)的軟骨細胞凋亡是其典型特征[1]。目前對于OA尚無滿意的治療方法，通常針對細胞外基質降解酶，尋找相應的酶活性抑制劑，但會出現(xiàn)不良反應[2]。雖然OA進展緩慢，但患者運動過程中負擔很大。長期以來，大型負重關節(jié)的疼痛、僵硬會導致嚴重的殘疾，需要進行外科手術治療，影響生活質量的同時，還往往伴隨著巨大的醫(yī)療保健成本。研究發(fā)現(xiàn)，軟骨細胞凋亡是導致關節(jié)軟骨退變并發(fā)展為OA的重要環(huán)節(jié)，抑制軟骨細胞凋亡可能是治療OA的有效途徑[3]。白細胞介素(interleukin，IL)-1β作為一種致炎細胞因子，可誘導軟骨細胞凋亡，在OA發(fā)生發(fā)展中起重要作用[4]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一種小分子非編碼RNA，能夠調(diào)節(jié)軟骨細胞增殖、分化、凋亡等生物學行為，在OA發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-204可通過抑制IL-1β的產(chǎn)生參與OA進展[6]。杯莧甾酮是莧科植物川牛膝的主要化學成分，可雙向調(diào)節(jié)破骨和成骨，是一種潛在的骨質疏松治療藥物[7]。本研究將通過探討杯莧甾酮通過miR-204途徑對IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡的影響，以期為OA治療提供參考。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器:人正常軟骨細胞C28/I2購自美國ATCC細胞庫；胎牛血清購自澳大利亞AusGeneX公司；DMEM培養(yǎng)基購自德國merck/sigma公司；重組人IL-1β購自美國santa公司；杯莧甾酮(批號：D0073，HPLC≥98%)購自上海寶曼生物科技有限公司；CCK-8試劑購自日本同仁化學研究所；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自哈爾濱新?；驒z測有限公司；實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)試劑盒購自美國Promega公司；Lipofectamine 2000轉染試劑(貨號：11668030)購自美國Life Technologies；NC-siRNA、miR-204 siRNA及miR-204、U6引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、酶聯(lián)免疫(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒、細胞色素C(Cytochrome C)抗體、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)抗體、半胱天冬酶-3(Caspase-3)抗體、GAPDH抗體購自abcam公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔(批號：0295G-HRP)購自美國santa公司；恒溫培養(yǎng)箱(型號：MIR-162-PC/MIR-262-PC)，日本松下公司；流式細胞儀(型號：BD FACSCanto II)，美國BD公司；熒光定量PCR儀(型號：ABI 7500)為美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品；酶標儀、化學發(fā)光成像系統(tǒng)(型號：MODEL550、ChemiDocXRS)，美國Bio-Rad公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng):將C28/I2細胞接種于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合率達到80%左右時，用胰蛋白酶消化、傳代培養(yǎng)。取對數(shù)期C28/I2細胞以1×104個/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，設置①對照組、IL-1β組、低劑量杯莧甾酮組、中劑量杯莧甾酮組和高劑量杯莧甾酮組，對照組不進行處理，IL-1β組加50mg/L IL-1β處理[8]，低劑量杯莧甾酮組、中劑量杯莧甾酮組、高劑量杯莧甾酮組在加50mg/L IL-1β處理的基礎上，分別加入杯莧甾酮，終濃度分別為2.5mg/L、5mg/L、10mg/L[7]；②正常對照組、陰性對照組和miR-204 siRNA組。三組均加入50mg/L IL-1β、10mg/L杯莧甾酮處理，其中陰性對照組和miR-204 siRNA組C28/I2細胞使用Lipofectamine2000轉染試劑分別轉染NC-siRNA、miR-204 siRNA。

1.2.2CCK-8法檢測C28/I2細胞增殖情況:將C28/I2細胞培養(yǎng)24h、48h、72h，同時設置僅含培養(yǎng)基的空白組，加入CCK-8試劑后繼續(xù)培養(yǎng)2h，使用全自動酶標儀于波長450nm處檢測各孔吸光度(optical density，OD)值，計算細胞活力，細胞活力=(OD處理組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)×100%。

1.2.3流式細胞儀檢測C28/I2細胞凋亡情況:將C28/I2細胞培養(yǎng)48h，收集細胞，胰蛋白酶消化，PBS洗滌，使用400μL 1×結合緩沖液調(diào)整成細胞濃度為1×106個/mL的細胞懸浮液，按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒操作說明書步驟，分別加入Annexin V-FITC、PI各5μL，避光孵育1h，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4ELISA法檢測C28/I2細胞上清液中炎癥因子水平:將C28/I2細胞培養(yǎng)48h，收集各組C28/I2細胞上清液，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，酶標儀于450nm波長下檢測各孔OD值，計算IL-6、IL-8和TNF-α水平。

1.2.5qRT-PCR法檢測C28/I2細胞中miR-204表達情況:將C28/I2細胞培養(yǎng)48h，收集細胞，使用Trizol試劑提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，采用qRT-PCR法檢測miR-204表達水平，內(nèi)參基因為U6。反應程序：95℃預變性10min；95℃變性10s，55℃退火35s，72℃延伸1min，循環(huán)40次。miR-204上游引物：5'-ACGCGTGTAGTAGCTGCTGAG-3'，下游引物：5'-GCGGUAUCGUAUCGUAUGCUAG-3'；內(nèi)參U6上游引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。Ct值為擴增產(chǎn)物的熒光信號達到臨界閾值時對應的循環(huán)數(shù)，相對表達量以2-ΔΔCt法表示。

1.2.6蛋白印跡(western blot，WB)法檢測C28/I2細胞中Cytochrome C、Bax、Caspase-3蛋白表達情況:將C28/I2細胞培養(yǎng)48 h，收集細胞，使用蛋白提取試劑盒提取各組細胞總蛋白，使用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度并進行定量。電泳分離等量蛋白質并轉至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1h，分別加入Cytochrome C抗體、Bax抗體、Caspase-3抗體、GAPDH抗體(1：500)，4℃孵育過夜，TBST洗滌后加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1:5000)，室溫孵育1h，免疫反應化學發(fā)光法顯色，Tanon 600圖像分析系統(tǒng)拍攝圖像并分析條帶灰度，目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。

2 結 果

2.1各組C28/I2細胞增殖情況:各個時間點，與對照組相比，IL-1β組C28/I2細胞活力顯著降低(P<0.05)；與IL-1β組相比，隨著杯莧甾酮劑量的升高，C28/I2細胞活力逐次升高。見表1。

表1 各組C28/I2細胞活力比較

2.2各組C28/I2細胞凋亡情況:與對照組相比，IL-1β組C28/I2細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與IL-1β組相比，低、中、高劑量杯莧甾酮組C28/I2細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；隨著杯莧甾酮劑量的升高，C28/I2細凋亡率逐次降低(P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 各組C28/I2細胞凋亡情況

表2 各組C28/I2細胞凋亡率比較

2.3各組C28/I2細胞上清液中炎癥因子表達水平:與對照組相比，IL-1β組C28/I2細胞上清液中IL-6、IL-8、TNF-α表達水平顯著升高(P<0.05)；與IL-1β組相比，低、中、高劑量杯莧甾酮組C28/I2細胞上清液中IL-6、IL-8、TNF-α表達水平顯著降低(P<0.05)；隨著杯莧甾酮劑量的升高，C28/I2細胞上清液中IL-6、IL-8、TNF-α表達水平逐次降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組C28/I2細胞上清液中炎癥因子表達水平比較

2.4各組C28/I2細胞中miR-204表達情況:與對照組相比，IL-1β組C28/I2細胞中miR-204表達水平顯著降低(P<0.05)；與IL-1β組相比，低、中、高劑量杯莧甾酮組C28/I2細胞中miR-204表達水平顯著升高(P<0.05)；隨著杯莧甾酮劑量的升高，C28/I2細胞中miR-204表達水平逐次升高(P<0.05)。見圖2、表4。

表4 各組C28/I2細胞中miR-204表達水平比較

圖2 五組C28/I2細胞中miR-204表達電泳圖

2.5各組C28/I2細胞中Cytochrome C、Bax、Caspase-3蛋白表達情況:與對照組相比，IL-1β組C28/I2細胞中Cytochrome C、Bax、Caspase-3蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；與IL-1β組相比，低、中、高劑量杯莧甾酮組C28/I2細胞中Cytochrome C、Bax、Caspase-3蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；隨著杯莧甾酮劑量的升高，C28/I2細胞中Cytochrome C、Bax、Caspase-3蛋白表達水平逐次降低(P<0.05)。見圖3、表5。

表5 各組C28/I2細胞中Cytochrome C Bax Caspase-3蛋白表達水平比較

圖3 各組C28/I2細胞中Cytochrome C、Bax、Caspase-3蛋白表達情況

2.6下調(diào)miR-204表達對杯莧甾酮抑制C28/I2細胞凋亡的影響:正常對照組與陰性對照組C28/I2細胞中miR-204表達水平、凋亡率的差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與陰性對照組相比，miR-204 siRNA組C28/I2細胞中miR-204表達水平顯著降低，凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖4、圖5、表6。

圖4 下調(diào)miR-204表達對杯莧甾酮抑制C28/I2細胞凋亡的影響

表6 各組C28/I2細胞中miR-204表達水平及細胞凋亡率比較

圖5 三組C28/I2細胞中miR-204表達電泳圖

3 討 論

現(xiàn)有研究已對OA發(fā)病機制有一定程度的了解，大量的候選藥物也在為用于OA治療開展相關實驗。然而，目前進入臨床實驗的試驗藥物都是高特異性的，屬于針對某種細胞外基質降解酶的抑制劑，這種治療手段并不能改善OA的整個疾病進程，治療效果有限，且部分藥物具有副作用[2]。IL是一類調(diào)節(jié)細胞生長及分化的因子，主要由白細胞分泌，目前已知與軟骨損傷有關的IL因子有IL-1β、IL-6、IL-8等[9]。其中，IL-1β是破壞關節(jié)軟骨最直接的IL細胞因子，其水平與關節(jié)軟骨退變程度呈正比，能夠促進軟骨基質的降解，并誘導軟骨細胞的凋亡，常用于誘導關節(jié)軟骨細胞凋亡建立關節(jié)炎軟骨細胞模型。

IL-6、IL-8、TNF-α是參與炎癥反應的常見因子，均參與OA的發(fā)生發(fā)展過程[10]。本研究結果顯示，與對照組相比，IL-1β組C28/I2細胞OD值顯著降低，凋亡率顯著升高，上清液中IL-6、IL-8、TNF-α表達水平顯著升高，提示IL-1β可以抑制C28/I2細胞增殖，并誘導其凋亡，這可能是通過促進IL-6、IL-8、TNF-α等炎癥因子表達，增強炎癥反應發(fā)揮作用的。miRNA是一種單鏈小分子非編碼RNA，廣泛存在于真核生物中，參與對炎癥反應的調(diào)控。李靜等[11]研究表明，miR-204能通過下調(diào)NOTCH2減輕心肌缺血再灌注大鼠的心肌炎癥反應及氧化應激反應。徐琰瑛等[12]研究表明，miR-204在角膜損傷愈合過程中，不僅與小梁網(wǎng)細胞的凋亡及生存能力有關，還與炎癥介質的表達有著重要聯(lián)系。Song等[6]研究發(fā)現(xiàn)，OA軟骨組織中miR-204水平明顯降低，使用IL-1β處理軟骨細胞可降低miR-204水平，而過表達miR-204可抑制軟骨細胞中IL-1β蛋白水平，并消除IL-1β對軟骨細胞中COX-2、IL-6表達的促進作用。本研究結果亦顯示，IL-1β組C28/I2細胞中miR-204表達水平較對照組顯著降低，提示IL-1β可抑制C28/I2細胞中miR-204表達。

川牛膝是一種莧科植物，其根干燥后具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、強筋健骨等功效，常用來治療骨折及其炎癥反應[13]。杯莧甾酮是川牛膝的主要化學成分，在治療骨質疏松癥時具有抑制破骨分化和促進成骨分化的雙向作用，在骨折修復中有助于加快骨折愈合并縮短骨折愈合時間[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，與IL-1β組相比，杯莧甾酮組C28/I2細胞OD值及miR-204表達水平顯著升高，細胞凋亡率及上清液中IL-6、IL-8、TNF-α表達水平顯著降低，提示使用杯莧甾酮可以促進miR-204表達，降低炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α的表達，促進C28/I2細胞增殖并減少其凋亡。進一步研究顯示，在使用IL-1β、杯莧甾酮處理C28/I2細胞基礎上，下調(diào)miR-204表達可導致細胞凋亡率升高，提示miR-204表達水平與C28/I2細胞凋亡過程有關，杯莧甾酮減少C28/I2細胞凋亡可能是通過上調(diào)miR-204表達發(fā)揮作用的，并進一步推測杯莧甾酮通過上調(diào)miR-204表達，消除IL-1β引起的炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α水平變化，進而影響C28/I2細胞的增殖、凋亡，但miR-204影響炎癥因子變化的途徑還有待深入研究[6]。

CytochromeC是重要的凋亡激活因子，當細胞受到病理因素刺激后，從線粒體釋放至細胞質中，激活細胞質中的凋亡反應，誘導細胞凋亡發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β可以促進CytochromeC釋放，經(jīng)由線粒體途徑誘導關節(jié)軟骨細胞的凋亡[15]。Bax、Caspase-3分別為Bcl-2家族、caspase家族的重要成員，參與細胞凋亡。本研究結果顯示，IL-1β促進C28/I2細胞凋亡及杯莧甾酮通過促進miR-204表達發(fā)揮抑制IL-1β對C28/I2細胞的促凋亡作用過程中，CytochromeC、Bax、Caspase-3蛋白水平均有顯著變化，表明杯莧甾酮促進miR-204表達后，減輕IL-1β引起的炎癥反應，并可能通過調(diào)控CytochromeC釋放，進而減少促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達，從而抑制C28/I2細胞凋亡。

綜上所述，杯莧甾酮可能通過上調(diào)miR-204表達，進而抑制IL-1β誘導的軟骨細胞C28/I2凋亡。這可能為骨關節(jié)炎癥的治療提供了一定參考，但miRNA調(diào)控機制復雜，下一步研究將更深入明確其具體調(diào)控機制。