吳海濤 陳小忠 趙洪新 申昊 楊朝志 岳翔 張平 王培

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，貴州 遵義 563000)

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，具有高增殖性、侵襲性及易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)〔1〕。目前臨床治療以手術(shù)聯(lián)合放化療為主，但預(yù)后較差，患者5年生存率很低〔2〕。雖然腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但研究者已發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤屬于多基因異常性疾病〔3〕，原癌基因的高表達(dá)和抑癌基因缺失共同導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞的異常調(diào)控機(jī)制〔4〕。軟骨素聚合因子(ChPF)是一種由多種氨基酸構(gòu)成的跨膜蛋白，在結(jié)腸癌、頭部鱗狀細(xì)胞癌中存在高表達(dá)，且可能介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展〔5〕。ChPF蛋白在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)水平明顯高于正常腦組織〔6〕；本實(shí)驗(yàn)以此為基礎(chǔ)，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)〔7～9〕，推測(cè)ChPF高表達(dá)可能提升腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞活性，其作用機(jī)制可能與調(diào)控單核細(xì)胞趨化蛋白(CCL2)有關(guān)。本研究通過(guò)重組慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)下調(diào)人腦膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞中ChPF表達(dá)，觀察對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲的影響，并進(jìn)一步下調(diào)細(xì)胞中CCL2表達(dá)，探討ChPF對(duì)CCL2表達(dá)的單向調(diào)控機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1主要材料與試劑 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172購(gòu)于上?；鄯f生物科技有限公司。攜帶綠色熒光蛋白的載體構(gòu)建ChPF-shRNA及其陰性對(duì)照Nc-shRNA重組慢病毒質(zhì)粒購(gòu)于博格隆(上海)生物技術(shù)有限公司；CCL2-shRNA及其陰性對(duì)照Nc-shRNA重組慢病毒質(zhì)粒購(gòu)于上海英駿生物技術(shù)有限公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于沃卡威(北京)生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine 3000購(gòu)于上海索寶生物科技有限公司；CCK-8、Trizol試劑購(gòu)于武漢艾美捷科技有限公司；鼠抗人ChPF、CCL2、β-actin單克隆抗體購(gòu)于上海宇淳生物科技有限公司。

1.2重組慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞及驗(yàn)證 使用攜帶綠色熒光蛋的載體構(gòu)建的重組慢病毒轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞，分為空白對(duì)照組、Nc-shRNA組、ChPF-shRNA組。主要步驟為：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A172細(xì)胞，按1×106/孔接種于6孔板中，使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；觀察細(xì)胞融合度超過(guò)30%時(shí)加入慢病毒轉(zhuǎn)染，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白表達(dá)情況，計(jì)算熒光細(xì)胞所占比例，超過(guò)80%后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)使用RT-PCR和Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中ChPF mRNA和蛋白表達(dá)水平，其中RT-PCR的ChPF上游引物序列：5′-GAGGACCATGCACGCAAGG-3′，下游引物序列5′-CCATAAGGTCGTGGTAGGGGC-3′。

1.2.1CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖水平 將3組細(xì)胞按1×103/孔接種于96孔板中，每孔含100 μl細(xì)胞懸液，設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，37℃ 5%CO2濃度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用CCK-8法分別測(cè)定培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h、96 h的細(xì)胞增殖活性，具體為：檢測(cè)前2 h每孔鍵入20 μl的CCK-8溶液，常規(guī)培養(yǎng)2 h，上酶標(biāo)儀讀取450 nm處每孔的吸光度值。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡水平 75%乙醇固定3組細(xì)胞，加入濃度為1 mg/ml的核糖核酸酶(RNase) A溶液300 μl，常規(guī)培養(yǎng)40 min，加入碘化丙啶700 μl，混合均勻后在4℃避光環(huán)境中染色30 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)各細(xì)胞周期分布情況。使用上樣緩沖液洗滌3組細(xì)胞，重懸后收集沉淀，再使用200 μl緩沖液重懸細(xì)胞，滴加10 μl膜聯(lián)蛋白(Annexin)Ⅴ-FITC，4℃避光環(huán)境中靜置20 min，滴加10 μl碘化丙啶，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。

1.2.3Transwell細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染48 h的3組細(xì)胞消化，使用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸計(jì)數(shù)。Transwell小室的上室中加入基質(zhì)膠60 μl，其中基質(zhì)膠：DMEM培養(yǎng)基=1∶2，37℃條件下聚合成膠；下室中加入含600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。上室中加入1×105個(gè)細(xì)胞，37℃ 5%CO2濃度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去上室培養(yǎng)液，擦去未穿膜細(xì)胞，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.4CCL2-shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后CCL2、ChPF mRNA和蛋白表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A172細(xì)胞，按1×105/孔接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)至融合度超過(guò)30%時(shí)，根據(jù)Lipofectamine 3000說(shuō)明書中的操作方法將CCL2-shRNA、Nc-shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分為空白對(duì)照組、Nc-shRNA組、CCL2-shRNA組，并收集轉(zhuǎn)染36 h后的細(xì)胞，使用RT-PCR和Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中CCL2、ChPF mRNA和蛋白表達(dá)水平，其中CCL2上游引物序列：5′-CCACTGACCCCGTAACTAA-3′，下游5′-GTTCGTCTTCACCCAAGTCC-3′。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1轉(zhuǎn)染后各組ChPF mRNA和蛋白表達(dá)情況 ChPF-shRNA轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞72 h后，熒光顯微鏡下觀察可見多數(shù)細(xì)胞中存在綠色熒光，與背景反差強(qiáng)烈，熒光著色細(xì)胞輪廓明顯，說(shuō)明ChPF-shRNA轉(zhuǎn)染效率高；見圖1。ChPF-shRNA組ChPF mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組和Nc-shRNA組(P<0.01)；ChPF mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量在空白對(duì)照組與Nc-shRNA組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖2。

圖1 ChPF-shRNA轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞72 h(×400)

表1 各組ChPF mRNA和蛋白表達(dá)比較

圖2 Western印跡檢測(cè)ChPF蛋白表達(dá)

2.2各組細(xì)胞增殖能力比較 與空白對(duì)照組、Nc-shRNA組相比，ChPF-shRNA組細(xì)胞增殖能力明顯減弱，48 h、72 h、96 h時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白對(duì)照組與Nc-shRNA組細(xì)胞增殖能力之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3各組細(xì)胞周期及凋亡率比較 ChPF-shRNA組S期、G2/M期的細(xì)胞比例明顯低于空白對(duì)照組、Nc-shRNA組，G0/G1期的細(xì)胞比例明顯高于空白對(duì)照組、Nc-shRNA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白對(duì)照組與Nc-shRNA組各細(xì)胞周期的細(xì)胞比例之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ChPF-shRNA組細(xì)胞凋亡率明顯高于空白對(duì)照組、Nc-shRNA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；空白對(duì)照組與Nc-shRNA組細(xì)胞凋亡率之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表2 各組培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)胞增殖能力比較(OD值，

表3 各組人腦膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞周期及凋亡率比較

2.4各組細(xì)胞侵襲能力比較 空白對(duì)照組、Nc-shRNA組、ChPF-shRNA組穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)分別為(35.61±5.08)個(gè)、(34.38±4.62)個(gè)、(15.97±2.69)個(gè)。ChPF-shRNA組穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)明顯少于空白對(duì)照組、Nc-shRNA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；空白對(duì)照組與Nc-shRNA組穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 Transwell小室檢測(cè)各組人腦膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞侵襲能力(×200)

2.5各組CCL2 mRNA和蛋白表達(dá)情況比較 ChPF-shRNA組人腦膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞CCL2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組與Nc-shRNA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；空白對(duì)照組與Nc-shRNA組CCL2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4、圖4。

2.6轉(zhuǎn)染CCL2-shRNA后對(duì)人腦膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞中ChPF mRNA和蛋白表達(dá) CCL2-shRNA組CCL2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組與Nc-shRNA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；空白對(duì)照組與Nc-shRNA組CCL2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。ChPF mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量在各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5、圖5。

表4 各組CCL2 mRNA和蛋白表達(dá)比較

圖4 Western印跡檢測(cè)CCL2蛋白表達(dá)

表5 各組人腦膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞CCL2及 ChPF mRNA和蛋白表達(dá)比較

圖5 Western印跡檢測(cè)人腦膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞中CCL2及ChPF mRNA和蛋白表達(dá)

3 討 論

腦膠質(zhì)瘤惡性程度高、治療預(yù)后差，且發(fā)病機(jī)制目前仍未完全明確，但基因水平的變異被公認(rèn)為膠質(zhì)瘤發(fā)生的根本原因之一，膠質(zhì)瘤基因水平治療也受到了廣泛關(guān)注〔10〕。ChPF是人軟骨素合成酶生成硫酸軟骨素的必要輔助因子，硫酸軟骨素廣泛分布于人體多個(gè)組織中，與腦神經(jīng)發(fā)育、感染、炎癥反應(yīng)密切相關(guān)〔11〕，同時(shí)還能夠抑制脊髓受損后神經(jīng)軸突的再生〔12〕。提示ChPF可能通過(guò)調(diào)節(jié)人體細(xì)胞的分化，介導(dǎo)相關(guān)疾病的發(fā)生與發(fā)展。相關(guān)研究顯示，結(jié)直腸癌組織中存在ChPF高表達(dá)，且ChPF表達(dá)水平與腫瘤分級(jí)呈正相關(guān)〔13〕；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ChPF能夠介導(dǎo)結(jié)直腸癌組織中軟骨素合成，在結(jié)腸癌中主要發(fā)揮促癌因子作用〔14〕。研究發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤組織中ChPF表達(dá)水平明顯高于正常腦組織〔15〕，提示腦膠質(zhì)瘤組織中存在ChPF高表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，本研究使用ChPF-shRNA轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞，經(jīng)ChPF mRNA和蛋白檢測(cè)顯示細(xì)胞中ChPF表達(dá)被明顯抑制，提示轉(zhuǎn)染成功。CCK-8檢測(cè)顯示，ChPF表達(dá)下調(diào)后細(xì)胞增殖能力被明顯抑制；進(jìn)一步分析細(xì)胞周期及凋亡情況顯示，ChPF表達(dá)下調(diào)后G0/G1期細(xì)胞數(shù)量明顯提升，提示細(xì)胞增殖受限，且細(xì)胞凋亡比例明顯增加。Transwell小室實(shí)驗(yàn)顯示，抑制ChPF表達(dá)能夠有效降低人腦膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞的侵襲能力。上述研究結(jié)果表明，ChPF表達(dá)下調(diào)后，人腦膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞的增殖、侵襲能力被抑制，凋亡水平提升。

研究者利用基因芯片技術(shù)研究分析發(fā)現(xiàn)，敲除ChPF基因表達(dá)后糖皮質(zhì)激素信號(hào)通路受到明顯影響，其中對(duì)CCL2的影響最為顯著〔16〕。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素受體能夠通過(guò)調(diào)控炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展〔17〕。如乳腺癌患者體內(nèi)糖皮質(zhì)激素受體信號(hào)能夠激活核轉(zhuǎn)錄因子(NK)-κB，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移〔18〕。CCL2屬于促炎癥因子，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞聚集相關(guān)巨噬細(xì)胞，作為趨化因子促進(jìn)腫瘤發(fā)生與發(fā)展〔19〕。研究證實(shí)，炎性微環(huán)境能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)化，已被用于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的治療性實(shí)驗(yàn)〔20，21〕。本研究顯示，抑制ChPF表達(dá)后，人腦膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞中CCL2 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯下降；但抑制CCL2表達(dá)后，ChPF mRNA和蛋白表達(dá)水平未出現(xiàn)明顯改變；提示ChPF對(duì)CCL2表達(dá)具有單向調(diào)控作用，ChPF可能通過(guò)調(diào)控CCL2表達(dá)來(lái)影響人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞活性。