王雨 王海靜 曾楚華 易巍 王文晟 陳龍菊 袁德培,

(1湖北中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，湖北 武漢 430065；2青島市中醫(yī)醫(yī)院 青島市海慈醫(yī)院干部保健科；湖北民族大學 3醫(yī)學部；4風濕性疾病發(fā)生與干預湖北省重點實驗室)

阿爾茨海默病(AD)又稱為老年性癡呆，為臨床癡呆的最常見類型。相關風險因素包括性別、年齡、遺傳、腦外傷等，中國AD發(fā)病率為7.4%(2015～2018年)，但考慮到人口老齡化情況，中國AD患者人數(shù)為美國的2.5倍，占全球病例數(shù)的25%〔1〕。AD的臨床表現(xiàn)為包括認知、行為異常在內(nèi)的腦神經(jīng)功能損傷，病理改變主要有老年斑、神經(jīng)元纖維纏結及神經(jīng)元丟失、腦萎縮等，主要源于β淀粉樣蛋白(Aβ)、tau蛋白的異常堆積。最新研究發(fā)現(xiàn)，AD發(fā)病機制亦包括代謝、免疫及“腦-腸軸”等異常，表現(xiàn)為系統(tǒng)性損傷〔2〕，而AD的治療藥物僅可改善患者臨床癥狀而無法逆轉(zhuǎn)疾病進展。中醫(yī)學對于AD的治療由來已久，屬于“癡呆”“呆病”等范疇，病機為氣血輸布異常，腎虛血瘀，本虛標實，且臨床補腎、活血等治法取得較好療效〔3〕。本文通過網(wǎng)絡藥理學對養(yǎng)血培本健腦膏治療AD的機制進行探討，以挖掘本方潛在的治療靶點，并通過動物實驗進行論證，為中醫(yī)藥治療AD奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)源 化合物組成、化合物-靶點信息來源于TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/index.php)，疾病-靶點信息來源于OMIM網(wǎng)站(https://omim.org/)、GeneCards網(wǎng)站(https://www.genecards.org/)，R語言數(shù)據(jù)包來源于bioconductor網(wǎng)站(http://www.bioconductor.org/)，蛋白互作網(wǎng)絡(PPI)來源于STRING網(wǎng)站(https://string-db.org/)，KEGG信息來源于KEGG網(wǎng)站(https://www.kegg.jp/)?；衔锶S結構來源于PubChem網(wǎng)站(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，蛋白質(zhì)三維結構來源于PDB網(wǎng)站(http://www.rcsb.org/)。

1.2試劑、儀器 Aβ25～35(美國Sigma公司，批號A4559-1M)，Bcl-2(武漢博士德公司，批號BAO412)，β-淀粉樣蛋白(萬類生物，批號WL01427)。養(yǎng)血培本健腦膏組成藥物(熟地、枸杞子、黃芪、白芍、胡桃肉、當歸、分心木、川芎、郁金、石菖蒲)、鹽酸多哌奈齊片(安理申)購自湖北民族大學附屬民大醫(yī)院。雙臂腦立體定位儀(美國Stoelting公司)，組織切片機(德國LEICA 公司)，正置光學顯微鏡(日本Nikon 公司)。

1.3動物 實驗動物為40只SPF級SD雄性大鼠〔武漢大學實驗中心提供，許可證號：SCXK(鄂)2015-0018〕，體重(250±20)g，體內(nèi)實驗獲得湖北民族大學倫理委員會批準。

1.4網(wǎng)絡藥理學網(wǎng)絡構建

1.4.1化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡構建 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫提取養(yǎng)血培本健腦膏的化合物組成、化合物靶點關系(限定參數(shù)OB>30%、DL>0.18)，OMIM、GeneCards網(wǎng)站檢索疾病“Alzheimer′s disease”“mild cognitive impairment(MCI)”“dementia”的靶點，以獲得疾病靶點關系；R語言V3.6.3軟件安裝“VennDiagram”包，以繪制化合物靶點、疾病靶點的Venn圖，相關信息導入cytoscape V3.7.2以獲得化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡，見圖1。

1.4.2PPI網(wǎng)絡 將交集靶點導入STRING網(wǎng)站，物種為人類(Homo sapiens)，得到PPI網(wǎng)絡圖，并將TSV文件錄入R語言V3.6.3軟件統(tǒng)計蛋白質(zhì)PPI數(shù)。

1.4.3GO、KEGG富集分析 R語言V3.6.3軟件安裝“RSQLite”“org.Hs.eg.db”包，將交集靶點名轉(zhuǎn)換為基因ID；安裝“colorspace”“stringi”“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”包，基于基因ID分別進行GO(Gene Ontology)、KEGG富集分析并繪制柱狀圖。

1.5分子對接 從PubChem、PDB網(wǎng)站分別獲得化合物、蛋白質(zhì)三維結構，采用Autodock4 進行加氫、加電荷操作，并確定蛋白質(zhì)中心點位置、大小(如APP蛋白：center_x = 17.23，center_y = 15.78，center_z = 44.93，size_x = 44，size_y = 64，size_z = 44)，導出pdbqt文件；采用Autodock vina V1.1.2軟件進行分子對接，得到的結果采用LigPlus、pymol軟件進行可視化分析。

1.6體內(nèi)實驗

1.6.1分組、造模、干預 40只SD大鼠適應性喂養(yǎng)1 w，隨機分為4組：正常組、模型組、中藥組、多哌奈齊組。其中，對模型組、中藥組和多哌奈齊組大鼠進行雙側海馬Aβ25～35注射，參照已發(fā)表文獻〔4〕，建立AD動物模型。自動煎藥機熬制養(yǎng)血培本健腦膏中藥濾液，旋蒸儀蒸發(fā)以獲得中藥溶液(0.32 g/ml)，采用雙蒸水進行稀釋以給藥；鹽酸多哌奈齊片采用生理鹽水稀釋，獲得混懸液(0.045 mg/ml)。中藥組灌胃養(yǎng)血培本健腦膏(6.17 mg/kg)，多哌奈齊組灌胃鹽酸多哌奈齊片(1.67 mg/kg)，正常組、模型組灌胃等體積生理鹽水，持續(xù)28 d；第28天時進行心臟灌注取材。

圖1 網(wǎng)絡藥理學研究養(yǎng)血培本健腦膏治療AD機制的路線

1.6.2免疫組織化學染色 大腦組織經(jīng)脫水、包埋后制成蠟塊，切片(4 μm)，經(jīng)二甲苯、梯度酒精脫蠟，枸櫞酸鹽進行微波抗原修復，5% BSA抗原封閉；4℃一抗(Aβ、Bcl-2工作濃度均為1∶200)孵育過夜，TBST 清洗5 min×3次；37℃二抗孵育30 min，TBST 清洗5 min×3次；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色后進行蘇木素復染，經(jīng)梯度酒精、二甲苯脫水，中性樹脂封片后顯微鏡下觀察拍照。每個樣本連續(xù)切片5張，每組選取5個樣本進行統(tǒng)計，采用GraphPad Prism5進行繪圖。蛋白陽性表達面密度=(陽性表達面積/區(qū)域面積)×100%。

1.7統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0 軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡 養(yǎng)血培本健腦膏含有97種化合物，包括黃酮類、酚類等，對應靶點數(shù)165個，靶點數(shù)較多的化合物包括槲皮素、阿托品、山奈素、β-谷甾醇等；通過與AD、癡呆、輕度認知功能障礙(MCI)疾病靶點交集后，交集靶點數(shù)為149個，化合物為69種，見圖2。

A.Venn圖，B.化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡，紅色下劃線為化合物、疾病的交集靶點圖2 化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡

2.2PPI網(wǎng)絡 交集靶點導入STRING網(wǎng)站，可觀察到β淀粉樣蛋白前體(APP)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)1(亦稱為ERK2)、白細胞介素(IL)-6等蛋白質(zhì)可與多種蛋白發(fā)揮作用，如APP蛋白可與毒葷堿型乙酰膽堿能受體(CHR)M1、表皮細胞生長因子(EGF)、乙酰膽堿酯酶(ACHE)、糖原合酶激酶(GSK)-3β等蛋白質(zhì)發(fā)揮作用，見圖3。

2.3GO、KEGG富集分析 通過GO富集分析交集靶點可觀察到，神經(jīng)遞質(zhì)受體通路、G蛋白耦聯(lián)胺受體、G蛋白耦聯(lián)神經(jīng)遞質(zhì)受體等可能為養(yǎng)血培本健腦膏治療AD的機制；KEGG富集分析可觀察到，流體剪切應力與老年性硬化、糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE通路、IL-17通路等可能為養(yǎng)血培本健腦膏治療AD的機制，見圖4。

圖3 PPI網(wǎng)絡及統(tǒng)計

A.GO富集分析，B.KEGG富集分析圖4 GO、KEGG富集分析

2.4分子對接 通過將交集靶點數(shù)最多的10種化合物與PPI數(shù)最高的蛋白質(zhì)(APP、MAPK1、IL-6)進行對接，發(fā)現(xiàn)槲皮素、阿托品、山奈素等均可有效結合上述蛋白，結合能范圍-5.4～-7.9 kCal/mol，可能對蛋白質(zhì)活性具有調(diào)節(jié)作用；以槲皮素為例，其可與APP蛋白的Ser6(A)、Glue7(A)、Ala9(A)等殘基位點結合，與MAPK1蛋白的Met108(A)、Ala52(a)、Val39(A)等殘基結合，與IL-6蛋白的Glue42(A)、Phe105(A)、Lys46(A)等殘基結合，見表1、圖5。

表1 分子對接結合能(kCal/mol)

圖5 槲皮素分子對接可視化

2.5免疫組織化學染色 免疫組織化學染色觀察海馬CA1區(qū)Aβ和Bcl-2蛋白表達，與正常組相比，模型組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Aβ蛋白表達明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，中藥組、多哌奈齊組神經(jīng)元Aβ蛋白表達下降(P<0.05或P<0.01)。與正常組相比，模型組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Bcl-2蛋白表達明顯下降(P<0.01)；與模型組相比，中藥組多哌奈齊組神經(jīng)元Bcl-2表達增加(P<0.05)，見圖6、表2。

表2 各組海馬CA1區(qū)免疫組化陽性表達面密度值統(tǒng)計

3 討 論

1990～2016年，全球癡呆患者人數(shù)上升117%，達到4 380萬人，并成為第五大死亡原因〔5〕。目前，本病的治療藥物為膽堿酯酶抑制劑、NMDA受體拮抗劑，僅可改善患者臨床癥狀，且2019年通過臨床Ⅲ期試驗的阿杜卡單抗、甘露特鈉膠囊(“九期一”)，亦需進一步論證從而上市〔6，7〕。每年AD的治療需要大量人力、醫(yī)保資金的投入，與之相對應的是疾病的不可治愈性和缺乏特效藥物，均對AD的臨床診療提出巨大挑戰(zhàn)。SD為進行性發(fā)病，全身多系統(tǒng)出現(xiàn)異常改變，而中醫(yī)藥具有多靶點、療效確切的優(yōu)勢，可通過多種途徑進行干預以發(fā)揮療效，相較于單一靶點藥物具有明顯優(yōu)勢〔8〕。

根據(jù)臨床癥狀及發(fā)病機制，AD屬于中醫(yī)學“癡呆”“呆病”疾病范疇?！鹅`樞·營衛(wèi)生會》載：“老者之氣血衰，其肌肉枯，氣道澀?！睔鈾C不暢，脾胃運化能力下降，共同促成氣血輸布異常，精血乏源，“血者，神氣也”，故無以上充于腦而失養(yǎng)；氣機推動無力，血停于局部而為瘀，《醫(yī)林改錯》提出：“凡有瘀血，也令人善忘”〔9〕。人之衰老源于腎精漸虧，促進五臟之精衰少，又“腎主骨生髓”，精氣虛少不能充養(yǎng)腦髓而發(fā)病〔10，11〕，故可總結為“老年人精氣虛衰，氣血不足，以至陽化風動”，屬于本虛標實的癥候?；诖瞬C課題組擬方養(yǎng)血培本健腦膏，方中熟地、枸杞子補益腎精，培補先天，黃芪、白芍、當歸補益脾氣以養(yǎng)血，胡桃肉、分心木補益腎精、充腦益智，佐以川芎、郁金、石菖蒲，祛瘀化痰濁、醒腦開竅從而健腦，共奏養(yǎng)血培本健腦之功。

養(yǎng)血培本健腦膏含有多種有效成分，其中的黃酮類化合物存在于蔬果、中藥中，具有抗氧化、調(diào)節(jié)突觸可塑性的功能，并可透過血腦屏障，對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有潛在的治療作用。槲皮素具有抗炎、抗氧化、神經(jīng)保護等作用，已有研究〔12〕顯示，其可提高體外培養(yǎng)神經(jīng)元活性，改善氧化應激、炎癥反應，抑制AD動物腦內(nèi)毒性片段Aβ1～42聚集、纖維形成，從而治療本??；山奈素具有抗炎、抗菌、心肌保護作用，可通過調(diào)節(jié)炎癥反應、膽堿能系統(tǒng)改善認知功能〔13〕。本研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)血培本健腦膏含有97種化合物、對應靶點數(shù)165個，具有多向調(diào)節(jié)能力。

在病理狀態(tài)下，APP經(jīng)β-分泌酶(BACE)-1和γ-分泌酶過度切割生成Aβ，導致Aβ生成、降解平衡破壞，積聚形成的纖維、斑塊可促進神經(jīng)元凋亡、氧化應激、突觸功能障礙等改變，大量新藥開發(fā)針對Aβ、BACE-1進行設計，其中Aducanumab可明顯降低AD患者大腦老年斑沉積，有望用于臨床〔6〕。在AD模型動物中MAPK通路(包括ERK1/2,p38,JNK)處于活化狀態(tài)，其可參與Aβ、tau、突觸病理性損傷，并調(diào)節(jié)膠質(zhì)細胞介導的炎癥反應，通過外源性干預此通路表達可抑制膠質(zhì)細胞活化，從而抑制炎癥反應〔14〕；而部分研究〔15〕發(fā)現(xiàn)，ERK抑制劑(U0126、PD98059)可加重Aβ誘導的認知功能損傷，促進神經(jīng)元凋亡、氧化應激，提示MAPK通路參與多種AD發(fā)病機制。Aβ、tau均可引起神經(jīng)炎癥，包括大腦膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元，部分基因突變(TREM2,CD33,PILRA等)除了參與突觸活動、脂質(zhì)代謝和囊泡轉(zhuǎn)運，亦可介導促炎細胞內(nèi)信號、細胞因子/IL/細胞轉(zhuǎn)換〔16〕；IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α為常見的促炎癥因子，且為M1型(促炎癥表型)小膠質(zhì)細胞的標志物〔14〕。本研究結果提示基于網(wǎng)絡藥理學方法可較為準確挖掘潛在靶點，利于基礎研究的機制探討。

信號通路的異常表達可參與AD的病理進程，包括凋亡、自噬、代謝、炎癥反應等通路。神經(jīng)遞質(zhì)受體通路包括膽堿能通路、單胺能通路、氨基酸能通路等，AD病理過程涉及多種神經(jīng)遞質(zhì)受體通路的異常，AlCl3建立的認知損傷動物模型中，腦神經(jīng)多巴胺和5-羥色胺含量下降，而去甲腎上腺素含量上升〔17〕，并且APP可通過神經(jīng)元PAS結構域蛋白4(NPAS)4調(diào)節(jié)抑制性突觸傳遞(GABA)含量〔18〕；“膽堿能假說”為目前AD發(fā)病機制較為認可的假說之一，主要內(nèi)容為AD患者大腦杏仁核、海馬和皮層的膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性顯著降低，突觸的乙酰膽堿含量下降，從而確立膽堿酯酶抑制劑的治療作用，相關藥物包括多奈哌齊、利伐他明和加蘭他明〔19〕。2型糖尿病(T2DM)與認知功能損傷相關，提高人群患遲發(fā)型AD的易感性，相應出現(xiàn)的糖代謝異常、氧化應激可促進活性二羰基化合物的非酶切反應，生成晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)；AD患者AGEs受體(RAGE)表達增加，且Aβ自身亦可被糖基化形成AGEs，AGEs、Aβ可與RAGE結合以傳遞信號，介導氧化應激、NF-κB、細胞死亡等機制，而AGEs清除劑具有神經(jīng)保護作用〔20〕，可知AGE-RAGE通路可促進AD的病理進程。本研究GO、KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)遞質(zhì)受體通路、G蛋白耦聯(lián)胺受體、流體剪切應力與老年性硬化、糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE通路等可能為養(yǎng)血培本健腦膏治療AD的機制，而兩種富集方法結果的差異可能來源于數(shù)據(jù)庫、算法的不同。

課題組前期研究〔4〕已證實，養(yǎng)血培本健腦膏可改善模型動物認知功能，抑制海馬神經(jīng)元線粒體凋亡通路及星形膠質(zhì)細胞活化。網(wǎng)絡藥理學方法可較好地預測中藥治療疾病的靶點、通路，提升中藥研究的科學性、精準性。本研究中進一步證實，養(yǎng)血培本健腦膏對治療AD具有多靶點、多途徑和多通路的特點，其治療機制可能與MAPK1、IL-6活性有關，且與其降低海馬CA1區(qū)神經(jīng)元Aβ表達、提高Bcl-2的表達有關。課題組擬進一步采用實驗方法論證本研究挖掘的信號通路，拓展本方的治療機制。