張明煥 毛文 劉雷 祁福 李北 鄭一舟

(武漢市第三醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430000)

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種常見(jiàn)的關(guān)節(jié)退行性疾病，其主要病理特征為關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)的進(jìn)行性降解〔1〕。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，中藥在OA的臨床治療中治療效果更佳，中藥復(fù)方劑對(duì)阻斷或延緩軟骨細(xì)胞凋亡有一定作用〔2,3〕。熟地黃多糖(RGP)是中藥熟地黃的主要成分，具有增強(qiáng)免疫、抗氧化、抗突變等作用〔4〕。此外，熟地黃在治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的方劑中發(fā)揮輔助作用，且含熟地黃的中藥配方對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎有良好的療效〔5,6〕。熟地黃多糖還能有效誘導(dǎo)H22荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡〔7〕。微小RNA(miRNA)是一類單鏈非編碼的小分子RNA，與OA軟骨基質(zhì)降解過(guò)程中的炎性介質(zhì)及各種細(xì)胞因子密切相關(guān)〔8〕。研究發(fā)現(xiàn)miR-140在OA組織中表達(dá)顯著減少，且參與軟骨細(xì)胞的重塑修復(fù)過(guò)程，與OA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔9〕。但熟地黃多糖對(duì)OA軟骨細(xì)胞增殖、凋亡及炎性因子的影響及熟地黃多糖影響OA的機(jī)制是否與miR-140相關(guān)還尚未清楚，本實(shí)驗(yàn)旨在研究熟地黃多糖對(duì)OA軟骨細(xì)胞增殖、凋亡及炎性因子的影響及其作用機(jī)制，為OA臨床診斷和治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 胎牛血清、DEME培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRT-PCR試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒、CCK-8試劑盒、蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；抗體購(gòu)自上海煊翎生物科技有限公司。

1.2人OA軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng) OA軟骨組織由當(dāng)?shù)毓强漆t(yī)院提供，無(wú)菌條件下切碎OA軟骨組織，用0.15%的膠原酶充分消化，加入含10%胎牛血清的DEME的培養(yǎng)基終止反應(yīng)，用22目細(xì)胞篩選過(guò)濾除渣后再以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，去上清。加入無(wú)血清的DEME培養(yǎng)液重懸，37℃培養(yǎng)，2～3 d換代一次。

1.3熟地黃多糖的制備 稱取適量熟地黃，加6倍量水煎煮1 h；殘?jiān)偌逯?次，每次加3倍量水煮1 h，合并3次煎液，過(guò)濾后濃縮至每1 ml含原生藥0.2 g，-20℃保存，使用時(shí)按所需濃度稀釋。

1.4細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染 取常規(guī)培養(yǎng)的OA軟骨細(xì)胞消化后接種于96孔板中，培養(yǎng)到細(xì)胞貼壁后換成終濃度分別為0.0 μg/ml、12.5 μg/ml、25.0 μg/ml、50.0 μg/ml的熟地黃多糖再培養(yǎng)48 h，分別記為RGP 0.0 μg/ml組、RGP 12.5 μg/ml組、RGP 25.0 μg/ml組、RGP 50.0 μg/ml組；以不添熟地黃多糖培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照(Control)組，以50.0 μg/ml熟地黃多糖培養(yǎng)的細(xì)胞為RGP組。OA軟骨細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將anti-miR-con、anti-miR-140質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至OA軟骨細(xì)胞中，再用50 μg/ml的熟地黃多糖處理后記為RGP+anti-miR-con組和RGP+anti-miR-140組；轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM 2000試劑盒進(jìn)行操作。

1.5qRT-PCR分析miR-140的表達(dá)水平 按照Trizol說(shuō)明書提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照TaKaRa 熒光定量試劑盒使用說(shuō)明配制反應(yīng)體系，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次，循環(huán)條件為95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；60℃延長(zhǎng)5 min。相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。

1.6CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖 分別在各組細(xì)胞培養(yǎng)至48 h時(shí)，每孔加入10 μl CCK-8試劑繼續(xù)孵育2 h。酶標(biāo)儀測(cè)定各孔490 nm波長(zhǎng)處吸光度A值，每組3個(gè)復(fù)孔取平均值。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化各組細(xì)胞，離心收集各組細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次，加結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。依據(jù)試劑盒說(shuō)明書，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育。流式細(xì)胞儀檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)488 nm和發(fā)射波長(zhǎng)530 nm處的熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8ELISA檢測(cè)白細(xì)胞介素(IL)-1β和腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達(dá)水平 取各組細(xì)胞，離心取上清，按ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.00軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1熟地黃多糖對(duì)OA軟骨細(xì)胞增殖的影響 相較于RGP 0.0 μg/ml組，RGP 25.0 μg/ml組和RGP 50.0 μg/ml組OA軟骨細(xì)胞的吸光度值顯著升高(0.64±0.05、0.94±0.05、1.18±0.07；P<0.05)，RGP 12.5 μg/ml組吸光度值(0.78±0.06)無(wú)顯著變化?？梢?jiàn)，一定濃度的熟地黃多糖可促進(jìn)OA軟骨細(xì)胞增殖。選用濃度為50 μg/ml的熟地黃多糖做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2熟地黃多糖對(duì)OA軟骨細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組相比，RGP組OA軟骨細(xì)胞的凋亡率顯著降低〔(7.51±0.82)%vs (3.50±0.36)%；P<0.05〕。見(jiàn)圖1。

2.3熟地黃多糖對(duì)OA軟骨細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，RGP組OA軟骨細(xì)胞中IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表1。

2.4熟地黃多糖對(duì)OA軟骨細(xì)胞miR-140表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，RGP組OA軟骨細(xì)胞中miR-140表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

圖1 熟地黃多糖對(duì)OA軟骨細(xì)胞凋亡的影響

圖2 熟地黃多糖對(duì)OA軟骨細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響

表1 熟地黃多糖對(duì)OA軟骨細(xì)胞炎性因子表達(dá)及miR-140表達(dá)的影響

2.5熟地黃多糖通過(guò)上調(diào)miR-140的表達(dá)促進(jìn)OA軟骨細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡 與RGP+anti-miR-con組相比，RGP+anti-miR-140組OA軟骨細(xì)胞中miR-140表達(dá)水平、吸光度值顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 抑制miR-140的表達(dá)逆轉(zhuǎn)了熟地黃多糖對(duì)OA軟骨細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用和凋亡的抑制作用

2.6熟地黃多糖通過(guò)上調(diào)miR-140的表達(dá)抑制OA軟骨細(xì)胞炎性因子的表達(dá) 與RGP+anti-miR-con組相比，RGP+anti-miR-140組OA軟骨細(xì)胞中IL-1β和TNF-α表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖3、表3。

1～4：Control組、RGP組、RGP+anti-miR-con組、RGP+anti-140組圖3 Western印跡檢測(cè)OA細(xì)胞炎性因子的表達(dá)

表3 抑制miR-140的表達(dá)逆轉(zhuǎn)熟地黃多糖對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞炎性因子表達(dá)的抑制作用

3 討 論

在OA的病理進(jìn)程中，炎癥可促進(jìn)形成滑膜炎及破壞軟骨，而軟骨細(xì)胞的異常凋亡對(duì)OA的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要〔10,11〕。中醫(yī)藥治療OA療效明確，可以改善滑膜炎癥、降低炎癥因子水平、抑制氧自由基損傷、抑制軟骨細(xì)胞凋亡等〔12〕。熟地黃多糖是中藥熟地黃的一種提取物，據(jù)報(bào)道熟地黃多糖對(duì)阿霉素所致的白細(xì)胞減少導(dǎo)致的免疫功能損傷有一定的預(yù)防和保護(hù)作用〔13〕；熟地黃多糖還可通過(guò)TNF-α、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子(STAT)3和酪氨酸激酶(JAK)的表達(dá)抑制鼻咽癌增殖轉(zhuǎn)移，且具有一定的時(shí)間和劑量依賴性〔14〕。熟地黃具有免疫增強(qiáng)作用，增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞Th1和Th2細(xì)胞因子的表達(dá)〔15〕。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明熟地黃多糖可以促進(jìn)OA軟骨細(xì)胞增殖，抑制凋亡。即熟地黃多糖可有效治療OA。

研究顯示miRNA可通過(guò)調(diào)控軟骨組織的降解、軟骨細(xì)胞凋亡從而參與OA的發(fā)生發(fā)展〔16〕。miR-140在OA軟骨中顯著下調(diào)，在軟骨細(xì)胞增殖分化和關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中起重要作用〔17〕。miR-140參與調(diào)控人類軟骨形成和發(fā)育，并促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，IL-1β是軟骨退化和關(guān)節(jié)反應(yīng)中的重要介質(zhì)，用IL-1β刺激軟骨細(xì)胞可抑制miR-140表達(dá)〔18〕。本實(shí)驗(yàn)中抑制miR-140表達(dá)可促進(jìn)炎性因子IL-1β的表達(dá)。miR-140基因敲除能導(dǎo)致小鼠軟骨內(nèi)成骨的生長(zhǎng)缺陷〔19〕；miR-140可能通過(guò)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBP)-5引起軟骨細(xì)胞合成減少，引起OA樣變〔20〕。以上研究結(jié)果均顯示miR-140對(duì)OA的發(fā)生發(fā)展具有重要的調(diào)控作用，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果說(shuō)明抑制miR-140表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；抑制miR-140表達(dá)逆轉(zhuǎn)了熟地黃多糖對(duì)OA軟骨細(xì)胞增殖促進(jìn)、凋亡抑制作用，此外，熟地黃多糖可上調(diào)miR-140的表達(dá)。說(shuō)明熟地黃多糖可能通過(guò)調(diào)控miR-140影響OA軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡。

OA軟骨中IL-1β和TNF-α mRNA表達(dá)上調(diào)〔21〕；IL-1β可誘導(dǎo)OA軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，TNF-α可刺激OA軟骨細(xì)胞凋亡，TNF-α還能誘導(dǎo)IL-1β的產(chǎn)生，而IL-1β能提高TNF-α的活性，兩者具有協(xié)同作用，介導(dǎo)對(duì)關(guān)節(jié)組織的破壞〔22〕。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明抑制miR-140表達(dá)促進(jìn)炎性因子的表達(dá)，抑制miR-140表達(dá)逆轉(zhuǎn)了熟地黃多糖對(duì)IL-1β和TNF-α的抑制作用。

綜上所述，熟地黃多糖抑制IL-1β和TNF-α的表達(dá)，促進(jìn)OA軟骨細(xì)胞的增殖，抑制凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)控miR-140及炎性因子的表達(dá)有關(guān)；可為OA的治療提供新的研究思路和理論依據(jù)。