李科 肖勁軍 曹永清

(長沙市第一醫(yī)院腫瘤科，湖南 長沙 410005)

肝癌具有惡性程度高、易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，肝癌轉(zhuǎn)移是肝癌患者死亡的重要誘因〔1〕。肝癌細(xì)胞侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是肝癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，靶向抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能對(duì)于提高肝癌患者生活質(zhì)量具有重要意義〔2〕。miRNA是目前研究較多的與正常生命活動(dòng)和疾病發(fā)生有關(guān)的非編碼RNA，其可以通過靶向調(diào)控下游靶基因的表達(dá)發(fā)揮生物學(xué)作用〔3〕。研究顯示，腫瘤發(fā)生與腫瘤組織中miRNA異常表達(dá)有關(guān)，這些miRNA可以作為腫瘤分子標(biāo)志物，通過干擾或重建腫瘤相關(guān)miRNA可能是腫瘤治療的潛在途徑〔4〕。miR-760是目前發(fā)現(xiàn)的與腫瘤有關(guān)的miRNA，miR-760異常表達(dá)下調(diào)與胃癌進(jìn)展有關(guān)，miR-760可以體外抑制胃癌細(xì)胞侵襲能力，后續(xù)在乳腺癌等腫瘤中也發(fā)現(xiàn)miR-760表達(dá)缺失與腫瘤惡性轉(zhuǎn)移有關(guān)〔5,6〕。研究表明，miR-760在肝癌中表達(dá)下調(diào)，并且miR-760表達(dá)水平的高低還與肝癌細(xì)胞阿霉素抵抗有關(guān)〔7〕。本實(shí)驗(yàn)旨在研究miR-760對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲、遷移和EMT的影響和調(diào)控機(jī)制，為明確miR-760在肝癌轉(zhuǎn)移中的作用提供參考，為靶向基因治療肝癌提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料 人肝癌細(xì)胞HCC-9204、SNU-449、HuH-7和人正常肝細(xì)胞HL-7702購自上海中科院細(xì)胞庫；叉頭框(FOX)C2抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；miR-760 mimics、mimics control均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；鈣黏蛋白E(E-cadherin)抗體購自美國Abcam；突變型(WT)和野生型(MUT)熒光素酶報(bào)告載體由漢恒生物科技(上海)有限公司構(gòu)建；波形蛋白(vimentin)抗體購自美國Cell Signaling Technology。

1.2qRT-PCR測定miR-760在肝癌細(xì)胞中的表達(dá) 收集人肝癌細(xì)胞HCC-9204、SNU-449、HuH-7和人正常肝細(xì)胞HL-7702，在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加Trizol，每105個(gè)細(xì)胞中添加1 ml的Trizol，提取細(xì)胞總RNA。以特異性的頸環(huán)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在冰上進(jìn)行，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：2 μl的5×PrimeScript緩沖液、0.5 μl的RNA、0.5 μl的PrimeScript Buffer、0.5 μl的微小RNA引物(miRNA primer)，添加無RNA酶的蒸餾水(RNAse Free dH2O)至10 μl，逆轉(zhuǎn)錄條件為：42℃孵育15 min；85℃孵育5 min，4℃保存。qRT-PCR引物序列如下：內(nèi)參U6-正義鏈5′-CTCGCTTCGGCACATA-3′，U6-反義鏈5′-CGAATTTGCGTGTCATCCT-3′；miR-760-正義鏈5′-GTCGAGCGGCTCTGGGTCTGTG-3′，miR-760-反義鏈5′-TCCAGTGGAGGGTCCGGAGGT-3′。qRT-PCR體系為：10 μl的SYBR Premix Ex Taq、0.8 μl的上下游引物、0.4 μl的ROX Reference、2.0 μl的cDNA，添加dH2O至20 μl。qRT-PCR條件為：95℃變性5 s；60℃退火30 s；72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)PCR產(chǎn)生的Ct值，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-760表達(dá)水平。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將miR-760模擬物(mimics)、mimics control分別轉(zhuǎn)染至人肝癌細(xì)胞HCC-9204中，記為miR-760、miR-NC組，將沒有轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞HCC-9204記為Control組，細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作完全按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明進(jìn)行。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h，按照1.2中qRT-PCR方法測定上調(diào)效果。

1.3.1MTT測定細(xì)胞增殖 將人肝癌細(xì)胞HCC-9204按照Control、miR-NC、miR-760分組方法種植到96孔板，每個(gè)孔中接種4×103個(gè)細(xì)胞，放在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h以后，將培養(yǎng)板取出，然后在每個(gè)孔中添加15 μl的MTT工作液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。把孔中的液體吸除，分別添加150 μl的二甲基亞砜(DMSO)溶液，孵育反應(yīng)10 min。將酶標(biāo)儀波長調(diào)整到570 nm，檢測每個(gè)孔的OD值。

1.3.2Transwell小室測定侵襲和遷移 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：將人肝癌細(xì)胞HCC-9204按照Control、miR-NC、miR-760分組方法懸浮在不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液中，吸取200 μl添加到Transwell小室的上室中，在下室中添加600 μl的含血清細(xì)胞培養(yǎng)液，放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h以后，取出小室，以70%的乙醇固定，0.1%的結(jié)晶紫染色以后，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移數(shù)目。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)前在小室中添加基質(zhì)膠濕化，其余步驟同上。

1.3.3Western印跡檢測E-cadherin、vimentin蛋白表達(dá) 取Control、miR-NC、miR-760細(xì)胞，添加RIPA蛋白抽提試劑，放在冰上裂解30 min，收集裂解液，在4℃高速離心。將蛋白上清分裝并保存在-80℃。把電泳槽清洗干凈，配制十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)凝膠。把蛋白樣品與5×上樣緩沖液(Loading Buffer)混合煮沸5 min，然后放在-80℃保存。每孔上樣孔內(nèi)加入30 μg蛋白，電泳電壓設(shè)置為100 V，等到溴酚藍(lán)進(jìn)入到凝膠的底部以后，停止電泳。將聚偏氟乙烯(PVDF)膜裁剪成凝膠大小，以200 mA恒流轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜操作在冰上進(jìn)行。把PVDF膜放在封閉液中將非特異性結(jié)合位點(diǎn)封閉以后，再依次放在一抗、二抗反應(yīng)液中，在室溫條件下結(jié)合1.5 h。一抗和二抗均用封閉液稀釋，一抗稀釋倍數(shù)為1∶800，二抗稀釋倍數(shù)為1∶2 000。電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色。內(nèi)參為β-actin。分析條帶的灰度值，計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

1.4miR-760靶基因預(yù)測和鑒定 在線靶基因預(yù)測軟件targetscan發(fā)現(xiàn)miR-760與FOXC2的3′UTR端有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)鑒定靶向關(guān)系。分別將FOXC2 WT和MUT熒光素酶報(bào)告載體同miR-760 mimics、mimics control共轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞中，培養(yǎng)24 h以后，用熒光素酶活性測定試劑盒檢測細(xì)胞熒光素酶活性。用Western印跡法檢測Control、miR-NC、miR-760組細(xì)胞中FOXC2蛋白表達(dá)水平，步驟同上。

1.5pcDNA3.1-FOXC2對(duì)上調(diào)miR-760影響肝癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和EMT的作用 人肝癌細(xì)胞HCC-9204中分別共轉(zhuǎn)染miR-760 mimics、pcDNA3.1和miR-760 mimics、pcDNA3.1-FOXC2，記為miR-760+pcDNA3.1、miR-760+pcDNA3.1-FOXC2組，轉(zhuǎn)染后24 h，MTT檢測細(xì)胞增殖，Transwell小室測定細(xì)胞侵襲和遷移，Western印跡檢測E-cadherin、vimentin蛋白表達(dá)，步驟同上。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-760在肝癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào) 人肝癌細(xì)胞HCC-9204(0.28±0.04)、SNU-449(0.65±0.08)、HuH-7(0.45±0.05)中miR-760表達(dá)水平明顯低于人正常肝細(xì)胞HL-7702(1.00±0.12；F=46.153，P=0.000)。miR-760在肝癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。人肝癌細(xì)胞HCC-9204中miR-760表達(dá)水平最低，選擇人肝癌細(xì)胞HCC-9204做后續(xù)研究。

2.2miR-760 mimics對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和EMT影響 肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-760 mimics后，細(xì)胞中miR-760表達(dá)水平升高，細(xì)胞OD值降低，細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)目下降，vimentin表達(dá)水平降低，E-cadherin表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1和表1)。miR-760 mimics抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和EMT。

圖1 Western印跡檢測miR-760 mimics轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞中E-cadherin、vimentin蛋白表達(dá)

表1 miR-760 mimics轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞中miR-760水平、OD值、遷移數(shù)目、侵襲數(shù)目及E-cadherin、vimentin、FOXC2蛋白水平比較

2.3miR-760靶向調(diào)控FOXC2 在線靶基因預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn) miR-760與FOXC2的3′UTR端有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-760靶向調(diào)控FOXC2表達(dá)。見圖2和表2。

圖2 miR-760與FOXC2的3′UTR端結(jié)合位點(diǎn)

表2 熒光素酶活性

2.4上調(diào)miR-760對(duì)肝癌細(xì)胞中FOXC2表達(dá)影響 肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-760 mimics后，細(xì)胞中FOXC2蛋白表達(dá)水平下降(表1和圖3)。上調(diào)miR-760抑制肝癌細(xì)胞中FOXC2蛋白表達(dá)。

2.5pcDNA3.1-FOXC2逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-760對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和EMT影響 肝癌細(xì)胞共轉(zhuǎn)染miR-760 mimics和pcDNA3.1-FOXC2后，細(xì)胞OD值升高，遷移、侵襲數(shù)目增加，E-cadherin蛋白表達(dá)減少，vimentin蛋白表達(dá)增多(圖4和表3)。pcDNA3.1-FOXC2逆轉(zhuǎn)上調(diào)miR-760對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和EMT影響。

圖3 Western印跡檢測miR-760 mimics轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞中FOXC2蛋白表達(dá)

圖4 Western印跡檢測miR-760 mimics和pcDNA3.1-FOXC2轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞中FOXC2、E-cadherin、vimentin蛋白表達(dá)變化

表3 miR-760 mimics轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞OD值、遷移數(shù)目、侵襲數(shù)目及FOXC2、E-cadherin、vimentin蛋白水平

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-760在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平低于正常肝細(xì)胞，并且上調(diào)miR-760可以降低肝癌細(xì)胞增殖和侵襲遷移能力，提示miR-760在肝癌惡性進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮抑制作用。miRNA是在人體組織中廣泛存在的非編碼RNA，其沒有編碼蛋白質(zhì)的功能，可以通過與靶基因結(jié)合影響蛋白表達(dá)，從而發(fā)揮多種生物學(xué)作用〔8〕。miRNA不僅參與能量代謝、細(xì)胞生長、組織修復(fù)等生理過程，還與人類的多種疾病如動(dòng)脈粥樣硬化、腦損傷有關(guān)〔9，10〕。研究顯示，miRNA與腫瘤關(guān)系密切，miRNA異常表達(dá)和調(diào)控功能可能是腫瘤轉(zhuǎn)移和惡性進(jìn)展的基礎(chǔ)〔11〕。miR-760是一個(gè)腫瘤調(diào)控因子，其表達(dá)水平的高低與腫瘤的預(yù)后、轉(zhuǎn)移等有關(guān)〔12〕。在結(jié)直腸癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤中的研究顯示，miR-760發(fā)揮類似抑癌基因的作用，其可以抑制腫瘤細(xì)胞惡性生長和侵襲〔6，13，14〕。報(bào)道顯示，miR-760在肝癌中表達(dá)下調(diào)，miR-760可以促進(jìn)阿霉素誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡〔7〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究相一致，證明miR-760在腫瘤中可能發(fā)揮抑癌基因的作用，并進(jìn)一步證實(shí)miR-760具有體外抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的作用。

腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移及惡性增殖是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要原因，而腫瘤細(xì)胞EMT是腫瘤轉(zhuǎn)移的早期標(biāo)志〔15〕。EMT是上皮特征逐漸消失并逐漸表現(xiàn)出間質(zhì)特征的過程，其在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用〔16〕。E-cadherin是上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白，vimentin是間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白，E-cadherin、vimentin表達(dá)改變是細(xì)胞EMT發(fā)生的標(biāo)志〔17〕。本研究表明，上調(diào)miR-760后的肝癌細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)水平升高而vimentin表達(dá)水平降低，提示上調(diào)miR-760可以抑制肝癌細(xì)胞EMT，這與細(xì)胞侵襲和遷移檢測結(jié)果一致，說明上調(diào)miR-760可以抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，miR-760靶向負(fù)調(diào)控肝癌細(xì)胞中FOXC2表達(dá)，miR-760作用機(jī)制可能與FOXC2有關(guān)。FOXC2又名MHF1，其是在人體組織中廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)OXC2與脂肪代謝、胰島素抵抗有關(guān)，參與肥胖、糖尿病等疾病發(fā)生〔18，19〕。FOXC2還是一個(gè)與腫瘤有關(guān)的重要調(diào)控因子，參與腫瘤血管形成、惡性生長和轉(zhuǎn)移〔20〕。過表達(dá)FOXC2誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞EMT和侵襲，靶向下調(diào)FOXC2抑制腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為〔21，22〕。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)FOXC2可以逆轉(zhuǎn)miR-760對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和EMT的抑制作用，這充分證實(shí)miR-760參與肝癌進(jìn)展與靶向調(diào)控FOXC2有關(guān)。

綜上，miR-760在肝癌轉(zhuǎn)移和惡性進(jìn)程中發(fā)揮類似抑癌基因的作用，miR-760在肝癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，miR-760具有抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和EMT的作用，作用機(jī)制與靶向負(fù)調(diào)控FOXC2有關(guān)。在以后的實(shí)驗(yàn)中會(huì)繼續(xù)在多株肝癌細(xì)胞和體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為闡明miR-760在腫瘤進(jìn)展中的作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)，為尋找有效的腫瘤分子標(biāo)記物提供了新方向。