吳文強(qiáng)， 楊 箐， 陳天青， 王 偉， 隋建樞， 羅永露， 何慶才

(1.貴州省旱糧研究所， 貴陽 550006； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)， 貴陽 550025；3.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 貴陽 550006)

藜麥屬于莧科，藜屬，是一年生常異花授粉的異源四倍體植物(2 n=4 x=36)[1-2]，單倍染色體數(shù)目為9[2]，原產(chǎn)于南美洲安第斯山脈地區(qū)，在當(dāng)?shù)匾延屑s7 000年的種植歷史，屬于當(dāng)?shù)刈钪匾募Z食作物之一，被當(dāng)?shù)赜〖尤朔Q為“糧食之母”。藜麥具有耐旱、耐寒、耐鹽堿、耐瘠薄等特性，是喜高海拔和冷涼的作物，從海拔0～4 000 m都有分布，食用的品種主要種植在安第斯山海拔3 000 m以上、降雨量300 mm以上的山區(qū)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，藜麥的礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、纖維素、氨基酸、微量元素含量高，特別是蛋白質(zhì)含量最高(達(dá)22.1%)，遠(yuǎn)高于其他谷物[1]，并富含一般谷物缺少的賴氨酸[5]。藜麥由于自身的營養(yǎng)價(jià)值及其所含的特殊化學(xué)成分——皂苷(一類具有抗炎癥、抗真菌和增強(qiáng)免疫等多種生理活性的化學(xué)成分[6-7])、類黃酮(一類具有抗氧化性和抗炎癥特性的化學(xué)成分[8])，并且，因其低糖、低熱量，對(duì)于肥胖人群、“三高”人群以及糖尿病患者來說，是一種首選食物。因此，藜麥被FAO正式推薦為最適宜人類的完美“全營養(yǎng)食品”，并列為全球十大健康營養(yǎng)食品之一[3-4]。

近年來，藜麥的需求量大幅度上升，我國開展了藜麥的引種和試種[9-10]。但如何利用現(xiàn)有的種質(zhì)資源，提高藜麥的產(chǎn)量和農(nóng)藝性狀改良方面存在制約瓶頸。而藜麥種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析是解決問題的關(guān)鍵因素之一，目前關(guān)于此方面的研究鮮見報(bào)道。

SSR技術(shù)被認(rèn)為是研究群體遺傳變異的最好標(biāo)記，在遺傳多樣性分析研究中已廣泛應(yīng)用[11-14]。

本研究以從國內(nèi)外引進(jìn)的96份藜麥種質(zhì)資源為研究對(duì)象，在貴州進(jìn)行種植，并基于SSR標(biāo)記的遺傳多樣性分析，確定藜麥種質(zhì)間的親緣關(guān)系、評(píng)定其遺傳多樣性水平，為今后藜麥育種中的雜交組配提供理論依據(jù)，從而篩選適宜貴州種植的藜麥品種。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1供試藜麥種質(zhì)材料

本研究采用的96份藜麥種質(zhì)材料主要引自甘肅農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜草與綠色農(nóng)業(yè)研究所和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院品種資源研究所等。

在2018年6—10月，于貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱糧研究所(貴陽)試驗(yàn)基地選擇水肥條件一致，肥力均勻的地塊作為實(shí)驗(yàn)用地，用于種植，該地海拔為1 100 m；6月2日在大棚用育苗缽育苗，6月7日出苗，7葉時(shí)移栽于大田，每份種質(zhì)種植1個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積15 m2，小區(qū)長5 m、寬3 m，行距1 m，株距50 cm，每小區(qū)27株，密度為18 000株·hm-2。9月上旬至10月上旬不同種質(zhì)成熟時(shí)進(jìn)行收獲。

1.1.2SSR引物信息

根據(jù)前人的相關(guān)研究合成了26對(duì)引物，并在不同藜麥材料中進(jìn)行擴(kuò)增，選出其中擴(kuò)增較好、多樣性較高、條帶清晰的18對(duì)引物進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)和多樣性分析。其中，所有引物是根據(jù)Jarvis[17]等獲得的多態(tài)性SSR標(biāo)記中篩選。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1藜麥基因組DNA提取

苗期于田間采集96份幼嫩藜麥葉片，用液氮研磨后，采用CTAB法提取DNA。

1.2.2PCR擴(kuò)增

采用擴(kuò)增較好、多樣性較高、條帶清晰的18對(duì)引物和PCR擴(kuò)增程序?qū)┰嚨?6份材料進(jìn)行基因型鑒定。

1.2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及處理

根據(jù)SSR標(biāo)記顯示的帶型，記錄易于辨認(rèn)的多態(tài)性位點(diǎn)，有帶記為1，無帶記為0，建立1，0型二元矩陣。將0，1矩陣在NTSYSpc(2.10版)軟件中進(jìn)行處理，根據(jù)相似系數(shù)(Similarity coefficient)構(gòu)建聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)部分引物電泳圖(120 V、5 h)

利用篩選的18對(duì)SSR引物對(duì)96份藜麥資源進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示條帶清晰、多態(tài)性好、擴(kuò)增較好。部分引物電泳圖見圖1、圖2。

2.2 PCR反應(yīng)結(jié)果分析

本研究中，用26對(duì)SSR引物對(duì)96個(gè)供試藜麥種質(zhì)材料(系)進(jìn)行多態(tài)性分析。結(jié)果表明，用26對(duì)SSR引物對(duì)96個(gè)供試藜麥種質(zhì)材料(系)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，篩選出18對(duì)引物具有多態(tài)性，多態(tài)位點(diǎn)百分率(P)為69.3%。18對(duì)多態(tài)性引物共檢測(cè)出192個(gè)等位位點(diǎn)，引物等位點(diǎn)數(shù)在3～21個(gè)之間(表1)，平均每個(gè)引物等位位點(diǎn)數(shù)為10.7個(gè)，由于等位位點(diǎn)數(shù)與遺傳多樣性呈正相關(guān)，等位位點(diǎn)數(shù)越多，遺傳多樣性越豐富，故該96個(gè)供試藜麥種質(zhì)材料的遺傳多樣性相對(duì)豐富。從圖3得到，引物KAAT 019的等位位點(diǎn)數(shù)最多，為21個(gè)，其次KAAT 021和KAAT 027，均為16個(gè)，KCAA 033和KGA 038的等位位點(diǎn)數(shù)最少，均為3個(gè)。引物KAAT 019對(duì)91個(gè)藜麥種質(zhì)資源(系)擴(kuò)增結(jié)果見圖4，其片段大小為140～250 bp，共21種等位位點(diǎn)。

2.3 藜麥種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)分析比較

將記錄條帶的0，1矩陣在NTSYSpc(2.10版)軟件中進(jìn)行處理，根據(jù)SSR標(biāo)記計(jì)算藜麥種質(zhì)資源間遺傳相似系數(shù)，得到96份藜麥材料遺傳相似系數(shù)范圍為0.559～0.980，平均值為0.789 5。其中，LM 13-2與LM 14-3遺傳相似系數(shù)最高，為0.980，表明兩者親緣關(guān)系最近。而LM 03-3-2與LM 12 a間的遺傳相似系數(shù)最低，為0.599，表明兩者親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.4 聚類分析結(jié)果

利用18對(duì)具有多態(tài)性的SSR引物對(duì)96份藜麥材料的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。采用類平均法(UPGMA)聚類分析，得到96個(gè)藜麥種質(zhì)資源聚類分析結(jié)果詳見圖7。在遺傳相似系數(shù)為0.752處可將96個(gè)藜麥品種分為五類。第一類聚集了來自不同地區(qū)的63份藜麥材料，表明這些藜麥材料遺傳親緣關(guān)系比較近，其中LM 01-2-2與LQ 31-1的親緣關(guān)系非常接近。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.78時(shí)，第一類又可劃分為七大亞類，第一大亞類包括40份藜麥材料，其中亞類群里的材料包括15種選系及3種不詳選系，以ZL 00026選系為主，其次為ZL 00040選系和ZL 00022選系，表明這一亞群里的其他選系可能與ZL 00026、ZL 00040和ZL 00022這3個(gè)選系的親緣關(guān)系較近，因此該類亞群的藜麥材料遺傳親緣關(guān)系比較近；第二大亞類包括2份藜麥材料，分別為LM 11-3和LM 11 a，均屬于ZL 00029選系，表明LM 11-3和LM 11 a的親緣關(guān)系非常接近；第三大亞類包括2份藜麥材料，為LM 10-3-1和LM 04 a，分別屬于ZL 00118選系和ZL 00041選系，表明LM 10-3-1和LM 04 a的親緣關(guān)系比較接近；第四大亞類包括2份藜麥材料，為LM 01-2-2和LQ 31-1，分別屬于ZL 00114選系和LQ 31選系，表明LM 01-2-2和LQ 31-1的親緣關(guān)系比較接近；第五大亞類包括4份藜麥材料，屬于ZL 00117選系和ZL 00118選系；第六大亞類包括6份藜麥材料，屬于5種選系，以隴藜1號(hào)選系為主；第七大亞類包括7份藜麥材料，屬于6種選系，以HJL 10-1選系為主。第二類包括來自不同地區(qū)的16份藜麥材料，主要屬于5種選系，以ZL 00114選系為主，其次為ZL 00117選系和觀賞藜選系，表明這一亞群里的材料的選系可能與ZL 00114選系、觀賞藜選系和ZL 00117選系的親緣關(guān)系較近，故該類材料的親緣關(guān)系比較近，其中觀賞藜HJL-1和觀賞藜HJL-2的親緣關(guān)系非常接近，極有可能是同一品種，而甘肅引藜-2與其他15份材料又分為不同的小亞類，表明甘肅引藜-2與其他15份材料間的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。第三類包括來自不同地區(qū)的5份藜麥材料，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.78時(shí)，又可劃分為兩大亞類，第一大亞類包括3份藜麥材料，以ZL 00038選系為主；第二大亞類包括2份藜麥材料(GoldenRoyal三色與ML 01)均產(chǎn)自秘魯。第四類包括來自中國農(nóng)科院的6份材料，表明這些藜麥材料遺傳親緣關(guān)系比較近，包括2種選系，ZL 00019選系、ZL 00024選系各3份。第五類包括來自中國農(nóng)科院的6份藜麥材料，分別為LM 01-2-1、ZL 00026-1-1、LM 12-2、LM 12-3、LM 12 a和LM 11-2，其中以ZL 00028選系材料為主，同時(shí)ZL 00029、ZL 00026、ZL 00114選系材料各1份，同為ZL 00028選系的LM 12-2和LM 12-3的親緣關(guān)系非常接近。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.71時(shí)，前面所分五類中，第五類與其他四類又分為不同的兩大類別，表明第五類與其他四類之間存在明顯的遺傳差異，這類中的6份藜麥品種與其他類別的親緣關(guān)系差距大。

表1 SSR引物及等位位點(diǎn)數(shù)

3 討 論

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，藜麥的營養(yǎng)價(jià)值遠(yuǎn)高于其他糧食作物，其富含賴氨酸及所具有的特殊成分皂苷與類黃酮凸顯出其在糧食作物中的地位優(yōu)勢(shì)，不但被FAO正式推薦為最適宜人類的完美“全營養(yǎng)食品”，在未來也將會(huì)是最具有潛力的農(nóng)作物之一。但是，因?yàn)檗见溤a(chǎn)地的氣候與海拔等因素的影響，很多地區(qū)對(duì)藜麥的推廣、引種、栽培和育種存在一定的困難，與藜麥原產(chǎn)地環(huán)境條件相近的貴州也不例外。因此亟需通過對(duì)藜麥種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析，從而篩選和選育適合貴州地區(qū)生長的藜麥品種，為貴州廣泛種植藜麥打下基礎(chǔ)。

本研究通過SSR分子標(biāo)記技術(shù)分析了藜麥種質(zhì)資源的遺傳多樣性，并從26對(duì)多態(tài)性的SSR引物中檢測(cè)出18對(duì)SSR引物能明顯擴(kuò)增出穩(wěn)定的多態(tài)性條帶，占比為69.3%。與陸敏佳等[18]用45對(duì)SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增且只篩選出16對(duì)具有多態(tài)性的SSR引物(占29.7%)的結(jié)果相比，本研究藜麥種質(zhì)資源間的SSR分子標(biāo)記多態(tài)性相對(duì)較好。18對(duì)多態(tài)性SSR引物共檢測(cè)出192個(gè)等位基因，引物等位基因在3～21個(gè)之間，平均每對(duì)引物等位基因?yàn)?0.7個(gè)，這結(jié)果遠(yuǎn)高于陸敏佳等檢測(cè)41份藜麥材料得出平均每對(duì)引物檢測(cè)到8.7個(gè)等位基因的結(jié)果，一方面表明該96個(gè)藜麥品種的遺傳多樣性相對(duì)豐富，另一方面表明不同的SSR引物多態(tài)性具有一定差距。通過聚類結(jié)果圖，在相關(guān)系數(shù)為0.752處可將96個(gè)藜麥品種分為五類，聚集成一大類的藜麥種質(zhì)資源的親緣關(guān)系比較近，其中最大的一類包括63份藜麥材料。通過SSR標(biāo)記計(jì)算藜麥種質(zhì)資源間遺傳相似系數(shù)，實(shí)驗(yàn)得到96份藜麥材料遺傳相似系數(shù)范圍為0.559～0.980，平均值為0.789 5。其中，LM 13-2與LM 14-3遺傳相似系數(shù)最高，為0.980，表明兩者親緣關(guān)系最近。而LM 03-3-2與LM 12 a間的遺傳相似系數(shù)最低，為0.599，表明兩者親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

本研究通過對(duì)96份藜麥材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，計(jì)算不同藜麥種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)，并加以聚類，一方面為篩選適合貴州地區(qū)種植的藜麥材料和藜麥在貴州有效推廣、種植、應(yīng)用提供直接的參考，另一方面也為下一步雜交創(chuàng)制藜麥遺傳材料時(shí)親本的選擇提供理論依據(jù)。