張峻淞， 曾令杰， 何綺莉, 黃嘉玲， 張曉元

(1.廣東藥科大學中藥學院， 廣州 510006；2.國家中醫(yī)藥管理局嶺南中藥材生產與開發(fā)重點研究室， 廣東 廣州 510006；3.韶關市華工高新技術產業(yè)研究院, 廣東 韶關 512027)

穿心蓮(Andrographispaniculata(Burm.f.)Nees)為爵床科一年生草本植物，為《中華人民共和國藥典》(2015年版)收錄的品種[1]，在我國主要栽培于福建、廣東、海南、廣西、云南等地，以種子繁殖。種子質量直接影響穿心蓮的栽種及其栽培管理，以及穿心蓮藥材的產量和質量。但在大部分產區(qū)，穿心蓮種子只作為藥材采收的副產品，尚沒有相應的種子質量標準或等級劃分的國家標準或行業(yè)標準可以參考。研究制定穿心蓮種子質量標準及合理劃分其質量等級對穿心蓮規(guī)范化栽培非常重要。

一般將穿心蓮種子的凈度、含水量、千粒重、發(fā)芽率作為評判穿心蓮種子等級的指標，以最低定級原則確定其質量等級[2-3]。然而，由于產地生態(tài)環(huán)境的差異、栽培管理及采收初加工措施的不同，不同來源的穿心蓮種子的凈度、含水量、千粒重、發(fā)芽率等指標間差異較大，若以最低定級原則確定穿心蓮種子的等級，難免會造成有些優(yōu)質的種子被劃分到較低的等級之中，因此，按最低定級原則確定的等級難以體現種子質量的整體情況，達不到精準指導及規(guī)范穿心蓮藥材生產之目的。為了更全面地表征穿心蓮種子的質量情況，應用系統(tǒng)聚類分析及偏最小二乘回歸分析等方法[4-7]，綜合考慮各指標對穿心蓮種子質量分級的影響，探討并建立了穿心蓮種子等級評價模型，應用于穿心蓮種子的等級判定，為種子的等級評價及穿心蓮的規(guī)范化栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試的穿心蓮種子共有38個批次，采自廣東乳源、英德10批(C 1～C 4、C 33～C 38)、廣西貴港9批(C 5～C 8、C 23～C 27)、湖南臨武2批(C 9～C 10)、四川會理2批(C 11～C 12)、云南西疇2批(C 13～C 14)、海南南寶2批(C 15～C 16)、貴州貞豐2批(C 17～C 18)、福建漳浦9批(C 19～C 22、C 28～C 32)。

1.2 方 法

1.2.1凈 度

從每批穿心蓮種子樣品中分別取1.000 0 g，平行3份，將樣品分為：凈種子、其他植物種子、雜質，分別稱重。計算凈種子質量分數，即為凈度。

1.2.2含水量

從每一批凈種子樣品中，取樣1.000 0 g種子(取樣誤差不超過1%)，重復3次。稱后的試樣放入130 ℃的烘箱中烘150 min，使其達到恒重，然后立即放入干燥器中冷卻30 min，再稱其重量，并計算種子的含水量。

種子含水量(%)=[(樣品烘前重量-樣品烘后重量)/樣品烘前重量]×100%。

1.2.3千粒重

從每批凈種子樣品中，分別隨機數取1 000粒種子，稱定重量，并以含水量13%進行折算，重復3次，取平均值作為該批次的千粒重。

1.2.4發(fā)芽率

選擇紙床作為發(fā)芽床，用帶蓋的透明培養(yǎng)皿進行培養(yǎng)[8]，隨機選取100粒穿心蓮凈種子，重復4次，在25～30 ℃的條件下培養(yǎng)7 d，定期加水，定時統(tǒng)計發(fā)芽數目，除去發(fā)霉腐爛的種子并統(tǒng)計其數目。置床后第2天為首次計數時間，置床后第7天為末次計數時間。

1.2.5生活力

采用TTC法測定穿心蓮種子生活力。分別隨機抽取穿心蓮凈種子50粒，重復4次，將種子預濕4 h后，沿種脊方向縱切1/2，使種子外形呈U型。然后，將種子浸泡在0.1%紅四氮唑溶液中，置于40 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中染色17 h后進行觀察并計算染紅種子粒數。

1.2.6數據處理與分析

采用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計描述；采用SIMCA-P 13.0軟件進行系統(tǒng)聚類分析、偏最小二乘法判別分析和偏最小二乘回歸分析。

2 結果與分析

2.1 穿心蓮種子各項指標測定結果

通過對38批穿心蓮種子各指標進行測定(見表1、表2)，結果表明，各批次穿心蓮種子的含水量為9.95%～16.43%，發(fā)芽率為70.00%～98.25%，千粒重為0.883 2～1.325 9 g，生活力為57.50%～97.50%，其中的相對標準偏差(RSD)變化最大的是千粒重，為12.53%，最小的是發(fā)芽率，為8.45%，這四項指標都可作為穿心蓮種子分級的重要指標。

凈度客觀地反映了種子樣品本身的純凈度，在種子的質量標準中，要求凈度應不低于90%，生產上可以通過過篩等簡單的操作達到這個要求。本實驗收集的38批穿心蓮種子中，除4批穿心蓮種子的凈度較低之外，其余批次穿心蓮種子凈度均在90%以上；由于在測量含水量、發(fā)芽率、千粒重、生活力時，取的是各批次純凈種子進行實驗，因而，不同批次穿心蓮種子中，這些指標的變化與種子的凈度大小無相關性，因此在之后的等級劃分時，沒有考慮將凈度作為穿心蓮種子等級劃分的考察指標，凈度僅作為穿心蓮種子質量標準的一個最基本要求。

表2 穿心蓮種子統(tǒng)計描述Table 2 Statistical description of A. paniculata seeds

2.2 不同來源的穿心蓮種子的系統(tǒng)聚類分析

以能區(qū)分穿心蓮種子質量差異的千粒重、含水量、發(fā)芽率及生活力指標為依據，通過SIMCA-P 13.0對38批穿心蓮種子樣品進行系統(tǒng)聚類分析，將穿心蓮種子分為3組(圖1)，C 25、C 23、C 26為一個類型；C 34、C 35、C 36、C 37、C 38、C 24、C 29、C 30、C 32、C 33、C 27、C 28、C 31為一個類型；C 1、C 7、C 20、C 16、C 2、C 10、C 15、C 19、C 21、C 13、C 14、C 22、C 8、C 12、C 5、C 18、C 3、C 9、C 4、C 11、C 6、C 17為一個類型。

2.3 偏最小二乘法判別分析與穿心蓮種子等級的劃分

偏最小二乘法判別分析主要反映X變量和分組變量之間的線性關系，可對不同等級劃分的合理性加以判定。為了判斷系統(tǒng)聚類分析對不同批次穿心蓮種子分組的合理性，利用SIMCA-P 13.0進行偏最小二乘法判別分析。由圖2可知，穿心蓮種子樣品同樣可以分為三類，和系統(tǒng)聚類分析結果一致，說明系統(tǒng)聚類分析等級劃分的結果是合理的，從PLS-DA得分圖(圖2)可以看出，各組之間有較明顯的界限。

2.4 穿心蓮種子分級模型建立及等級評判

將穿心蓮種子發(fā)芽率、千粒重、生活力、含水量作為自變量(X)，等級作為因變量(Y)，利用SIMCA-P 13.0進行偏最小二乘回歸分析(PLS)，建立回歸模型。其回歸方程為：

Y(種子等級)=8.044-2.048X1-0.003X2-0.227X3-0.012X4,其中X1代表千粒重，X2代表發(fā)芽率，X3代表含水量，X4代表生活力。若輸出值在0.3～1.3之間，則判別為一級種子；輸出值在1.3～2.3之間，則判別為二級種子；輸出值在2.3～3.3之間，則判別為三級種子。

為了考察建立的回歸模型的預測精確度，將原始數據代入上述回歸方程計算預測值，并與實際觀測值進行比較，結果如圖3所示，模型的預測值與實際值基本在對角線的兩側，擬合度良好，表明模型有較好的預測能力，可以用于穿心蓮種子的等級判定。

3 討 論

本研究從穿心蓮各主產地采集了38批穿心蓮種子，測定了其凈度、千粒重、含水量、發(fā)芽率及其生活力等指標，并以這些指標為依據，采用數理統(tǒng)計學的方法，開展了穿心蓮種子的分級研究。通過系統(tǒng)聚類分析，將這38批穿心蓮種子分為三個不同的質量等級，PLS-DA分析的結果與系統(tǒng)聚類分析的結果一致，表明等級的劃分合理。

為了便于判定某批穿心蓮種子的等級類型，探討并建立了穿心蓮種子等級的預測模型，該模型為：Y(種子等級)=8.044-2.048X1(千粒重)-0.003X2(發(fā)芽率)-0.227X3(含水量)-0.012X4(生活力)。若Y在0.3～1.3之間，則為一級種子；Y在1.3～2.3之間，則為二級種子；Y在2.3～3.3之間，則為三級種子。該模型能夠反映影響穿心蓮種子質量的各項指標所占的權重，為綜合判斷穿心蓮種子等級的模型，可避免單獨以某項指標來確定穿心蓮種子等級的缺陷。

由于自然環(huán)境與人工栽培管理條件的差異，不同來源的穿心蓮種子，各自所具備的優(yōu)勢不同，其胚的完整性、營養(yǎng)物質的儲備量等內在因素存在差異，最終反映在各指標上的數值大小也不同，若單獨以某個指標來判定其種子的質量等級有失偏頗；而種子等級判定的回歸模型綜合考慮了影響穿心蓮種子質量的各因素，故其評判分級相對比較全面而客觀，有利于穿心蓮優(yōu)質種子的篩選和穿心蓮的規(guī)范化栽培，為大規(guī)模生產過程中穿心蓮藥材的產量和質量保障奠定了基礎；同時，該類模型分析方法也為其他中藥材種子質量的綜合分級評價提供了參考。