李智軍， 譚銘喜， 曾 晶， 盧文佳

(1.廣東金作農(nóng)業(yè)科技有限公司， 廣州 510640； 2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所， 廣州 510640)

冬瓜(BenincasahispidaCogn.)是我國傳統(tǒng)重要的菜藥兼用型蔬菜之一，已有近2 000年的栽培歷史，主要分布于華南、西南和長江流域等地，年種植面積超過20萬hm2[1-2]。近年，有關(guān)冬瓜資源創(chuàng)新及雜種優(yōu)勢利用研究取得了很大進步，已培育出一批以黑皮冬瓜為主的雜交一代品種，滿足了生產(chǎn)者和消費者的需求[3-5]。

當今，單倍體技術(shù)已成為多種作物育種的核心技術(shù)之一，其優(yōu)勢在于顯著縮短育種年限，提高效率，降低成本，并且在遺傳群體構(gòu)建、基因功能鑒定、轉(zhuǎn)基因研究和細胞學(xué)研究等方面具有重要應(yīng)用價值，其中利用小孢子(花粉或花藥)離體培養(yǎng)獲得單倍體植株已在十字花科、茄科、葫蘆科和禾本科等250多種植物上獲得成功，推動了作物育種進程[6-8]。然而，迄今為止冬瓜育種仍然多采用傳統(tǒng)常規(guī)育種技術(shù)，尚未見有關(guān)單倍體技術(shù)方面的研究報道。

研究表明，小孢子發(fā)育時期是成功誘導(dǎo)胚狀體和獲得單倍體植株的關(guān)鍵因子，多數(shù)物種以單核靠邊期的小孢子為最佳[7-11]；另外，小孢子發(fā)育與花器外部形態(tài)相關(guān)，可以依據(jù)花器形態(tài)特征以及花蕾大小判斷小孢子發(fā)育時期[12-16]。為了開展和建立冬瓜小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系，本研究對4個黑皮冬瓜品種的小孢子發(fā)育進行細胞學(xué)觀察，同時觀測小孢子各發(fā)育時期對應(yīng)的花蕾形態(tài)特征及外觀指標，研究黑皮冬瓜小孢子發(fā)育時期與花蕾形態(tài)建成的相關(guān)性，以期通過花蕾形態(tài)特征或外觀指標快速判定小孢子發(fā)育時期。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為4個黑皮冬瓜品種：黑老粗(F1，廣東金作農(nóng)業(yè)科技有限公司)，黑優(yōu)大、鐵柱168、鐵心333(F1，廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所)。2018年2月24日播種，3月29日定植于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院白云試驗基地，畦面寬80 cm，單行種植，株距60 cm，每品種種植25～30株，按常規(guī)方法管理。

1.2 花蕾觀測

在主蔓生長到25～30節(jié)時，于09：30—11：30時從每個品種主蔓采摘雄花蕾。由于黑皮冬瓜為雌雄異花植物，主蔓上每連續(xù)著生3～6朵雄花后著生1～2朵雌花，其著生節(jié)位因不同植株及生育環(huán)境而改變。因此，以當天開放的花朵(無論雌雄)作為起始點(開花節(jié))，分別從開花節(jié)之上按順序每節(jié)摘取4～6朵雄花蕾放入自封口塑料袋內(nèi)，采樣后立刻帶回實驗室置于4 ℃冰箱，當天用游標卡尺測量雄花蕾的蕾長、蕾徑、萼長、瓣長，然后用鑷子剝開花瓣，測量雄蕊直徑，并記錄花藥顏色。

1.3 小孢子發(fā)育觀察

用鑷子撥開不同節(jié)位雄花蕾的花瓣，夾取少許花藥置于載玻片上，滴加DAPI熒光染色液8～10 μL，輕輕擠壓花藥，散出花粉，取出雜物，涂抹5～10 s使花粉與染色液混合均勻，然后蓋上蓋玻片，染色0.5～1 h，用Olympus BX 51熒光顯微鏡在40倍或100倍物鏡下觀察拍照(MicroPublisher 5.0 RTV)。小孢子發(fā)育時期的確定：每個花蕾隨機觀察5～7個視野，以所有視野平均70%以上的小孢子處于同一時期判定為該時期，之后從每個節(jié)位花蕾的小孢子照片隨機選取10個用Image-Pro Plus 7.0軟件測量其直徑。DAPI熒光染色液配制：先將DAPI熒光染料和蔗糖溶于磷酸鹽緩沖液PBS，配成DAPI濃度30 μg·L-1、蔗糖濃度10%(w/v)的溶液A，然后配制含乙醇70%(v/v)、甘油30%(v/v)的溶液B，將溶液A和溶液B按體積等比混合搖勻。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗觀測數(shù)據(jù)采用Excel及SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，品種間的差異顯著性采用Duncan法進行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑皮冬瓜小孢子發(fā)育過程

對4個黑皮冬瓜品種的小孢子發(fā)育過程進行了細胞學(xué)觀察，盡管對應(yīng)相同發(fā)育時期的小孢子大小在品種間具有顯著性差異，但變化幅度并不大。供試4個品種的小孢子發(fā)育過程相同，可分為5個時期(圖1，表1)。 1) 四分體時期：花粉母細胞經(jīng)過減數(shù)分裂形成四分孢子，包裹于胼胝質(zhì)壁中，四面體排列，核占比較大，直徑25.8～31.8 μm(圖1 A)。 2) 單核居中期：包圍四分體的胼胝質(zhì)消溶后，小孢子膨大成為單核花粉粒，核居細胞中央，并開始逐步縮小，直徑31.5～34.7 μm(圖1 B)。 3) 單核靠邊期：花粉粒繼續(xù)膨大，細胞內(nèi)形成液泡，核凝聚移至細胞壁邊緣，偶爾可見2核仁花粉粒，直徑32.6～42.9 μm(圖1 C，D)。 4) 單核有絲分裂期：花粉壁加厚，細胞核擴展、變長，進行有絲分裂，但仍處于花粉壁邊緣，液泡消失，花粉粒直徑38.6～45.2 μm(圖1 E)。 5) 雙核期：在雙核早期細胞核分裂成1個生殖核與1個營養(yǎng)核，隨后營養(yǎng)核向細胞質(zhì)內(nèi)擴散，至雙核中期又聚集，期間生殖核逐漸濃縮，到了雙核后期多數(shù)情況下營養(yǎng)核和生殖核均向花粉粒中央遷移，生殖核變長，呈短棒狀，但未見分裂(圖1 F～H)，處于此期的花粉粒平均直徑44.5～54.5 μm。在成熟花粉散出幾小時后，可觀察到少數(shù)花粉粒的生殖核分裂成2個精核，形成三核花粉(圖1 I)，成熟花粉粒的生殖核一旦進入花粉管很快就分離成2個精核(圖1 J)。

2.2 小孢子發(fā)育時期與花蕾著生節(jié)位的關(guān)系

從表2可知，黑皮冬瓜小孢子的發(fā)育時期與花蕾所處的節(jié)位密切相關(guān)，節(jié)位越高小孢子發(fā)育時期越早。對應(yīng)不同小孢子發(fā)育時期的節(jié)位因品種有所差異，其中黑優(yōu)大、鐵柱168和鐵心333三個品種相同，其小孢子處于四分體時期、單核居中期、單核有絲分裂期以及單核靠邊期的雄花蕾分別著生于開花節(jié)之上的第9、8、7、6節(jié)，而雙核期的雄花蕾位于第1～5節(jié)。黑老粗的這種對應(yīng)關(guān)系較其它3個品種各高1個節(jié)位。

表1 黑皮冬瓜處于不同發(fā)育期的小孢子大小

2.3 小孢子發(fā)育時期與花蕾形態(tài)的關(guān)系

4個黑皮冬瓜品種間，對應(yīng)不同小孢子發(fā)育時期的雄花蕾形態(tài)指標存在顯著性差異，但其形態(tài)建成過程和特征基本類似(圖2，表2)。各時期的雄花蕾特征和形態(tài)指標如下： 1) 四分體時期：花萼開張，花萼和花瓣均呈綠色，花藥黃綠色。蕾長0.33～0.39 cm，蕾徑0.34～0.48 cm，萼長0.49～0.64 cm，瓣長0.26～0.35 cm，雄蕊直徑0.24～0.33 cm，蕾長/蕾徑0.82～1.06，萼長/瓣長1.72～2.19。 2) 單核居中期：花萼開張度增大，花萼和花瓣仍為綠色，花藥淺綠或黃綠色。蕾長0.41～0.58 cm，蕾徑0.48～0.53 cm，萼長0.69～0.88 cm，瓣長0.38～0.43 cm，雄蕊直徑0.38～0.44 cm，蕾長/蕾徑0.87～1.09，萼長/瓣長1.73～2.13。 3) 單核靠邊期：花萼平展，花瓣開始顯現(xiàn)黃色，花藥淺黃色。蕾長0.54～0.76 cm，蕾徑0.53～0.73 cm，萼長0.78～1.18 cm，瓣長0.49～0.60 cm，雄蕊直徑0.39～0.53 cm，蕾長/蕾徑0.99～1.06，萼長/瓣長1.68～1.97。 4) 單核有絲分裂期：此期的雄花蕾形態(tài)特征與單核靠邊期的類似，只是花蕾稍大，蕾長0.86～1.00 cm，蕾徑0.71～0.89 cm，萼長1.05～1.33 cm，瓣長0.68～0.86 cm，雄蕊直徑0.53～0.64 cm，蕾長/蕾徑1.09～1.30，萼長/瓣長1.53～1.79。 5) 雙核期：花萼開展，多數(shù)外卷，花瓣黃色增多，花藥淺黃色，平均蕾長1.25～3.55 cm，蕾徑0.92～2.16 cm，萼長1.24～1.50 cm，瓣長0.99～3.17 cm，雄蕊直徑0.62～1.19 cm，蕾長/蕾徑1.32～1.73，萼長/瓣長0.48～1.31。

表2 黑皮冬瓜小孢子不同發(fā)育時期的花蕾形態(tài)

2.4 小孢子大小與雄花蕾形態(tài)指標的相關(guān)性分析

從圖3可知，黑皮冬瓜雄花蕾的蕾長、蕾徑、萼長、瓣長、雄蕊直徑、蕾長/蕾徑以及其小孢子直徑與節(jié)位均為負相關(guān)關(guān)系，而萼長/瓣長與節(jié)位呈正相關(guān)關(guān)系。其中，蕾長、蕾徑、瓣長、雄蕊直徑與節(jié)位的關(guān)系為負指數(shù)式，表明花蕾形態(tài)建成越臨近開花越快；而小孢子直徑、萼長與節(jié)位的關(guān)系為二次多項式，說明小孢子膨大和萼片生長在早期較快，越到后期越慢。蕾長/蕾徑、萼長/瓣長與節(jié)位的關(guān)系均為直線式，很顯然黑皮冬瓜雄花蕾的花瓣縱向生長遠快于蕾徑的增長和萼片的生長。

從黑皮冬瓜雄花蕾形態(tài)指標與小孢子大小的關(guān)系分析，除萼長/瓣長與小孢子直徑呈負直線相關(guān)關(guān)系外，其它花蕾形態(tài)指標與小孢子直徑均為正相關(guān)關(guān)系(圖4)。其中，雄花蕾的蕾長、蕾徑、萼長、瓣長及雄蕊直徑與小孢子直徑的關(guān)系均為對數(shù)式，而蕾長/蕾徑與小孢子直徑的關(guān)系為直線式。這些結(jié)果同樣揭示了黑皮冬瓜小孢子膨大與花蕾外觀形態(tài)建成的關(guān)聯(lián)性，而且在它們發(fā)育早期和后期的速度有所不同，前者是由快轉(zhuǎn)慢，而后者則相反。

3 討論與結(jié)論

經(jīng)細胞學(xué)觀察，4個黑皮冬瓜品種的小孢子發(fā)育過程完全相同。在花粉母細胞兩次分裂之后，可將其劃分為5個時期，即四分體時期、單核居中期、單核靠邊期、單核有絲分裂期和雙核期，這與至今對其它葫蘆科植物，如葫蘆[12]、甜瓜[14]、黃瓜[15]、南瓜[17]、西葫蘆[18]等的研究結(jié)果一致。本試驗對DAPI熒光染色法進行了改進，通過使用乙醇、甘油及蔗糖等增加花粉壁的透明度，不僅簡化了操作步驟，而且染色效果得到了顯著提高。利用該簡化法染色黑皮冬瓜小孢子可清晰觀察到每個時期的核分裂過程。與成熟花粉粒含有三核的十字花科植物等明顯不同，黑皮冬瓜小孢子自單核有絲分裂之后直至花粉成熟散出之前均只能觀察到2個核，但是根據(jù)對成熟花粉粒中的生殖核細微結(jié)構(gòu)的觀察以及生殖核進入花粉管后很快就可分離出2個精核這一現(xiàn)象，認為黑皮冬瓜成熟花粉粒中的生殖核已經(jīng)分裂形成2個精核，但二者緊密粘合在一起，尚未分開。另外還觀察到，黑皮冬瓜小孢子在單核靠邊期出現(xiàn)2核仁的情況，這種特異現(xiàn)象在黃瓜[19]、苦瓜[20]、南瓜[21]、甜瓜[22]上均被觀察到，可見這種小孢子多核仁情況是在葫蘆科植物中普遍存在的現(xiàn)象。目前多數(shù)研究者認為，引起多核仁的原因與其花粉母細胞分裂期核仁融合不徹底有關(guān)，但具體形成機制至今仍然不清楚[19,21]。

在利用小孢子(花粉或花藥)離體培養(yǎng)進行單倍體育種中，選擇處于單核靠邊期的小孢子是成功誘導(dǎo)胚狀體進而獲得單倍體植株或DH系的關(guān)鍵[6-7]。由于小孢子處于花藥之中，而花藥是花蕾的一個花器，本質(zhì)上兩者具有內(nèi)在的聯(lián)系。因此，一些研究者對小孢子的發(fā)育與花蕾的形態(tài)特征的相關(guān)性進行了研究，證實從花蕾的形態(tài)特征或外觀指標可以判定小孢子的發(fā)育階段，只是不同作物判定小孢子發(fā)育時期的花蕾形態(tài)指標各不同[12-16]。王朝陽等[18]報道，西葫蘆小孢子發(fā)育時期與花蕾縱、橫徑長度的關(guān)系在不同位次間存在一致性，在開花后的前7個位次上，任何一朵雄花都可以花蕾縱徑長度或橫徑長度為標準判斷小孢子的發(fā)育時期。王震[23]同樣在西葫蘆上也得出類似的結(jié)果。本研究表明，黑皮冬瓜小孢子大小與開花節(jié)之上的節(jié)次、花蕾形態(tài)指標存在密切的相關(guān)性，其相關(guān)性因花蕾指標不同表現(xiàn)形式有所差異，其中小孢子大小與雄花蕾的蕾長、蕾徑、萼長、瓣長以及雄蕊直徑呈對數(shù)式的正相關(guān)關(guān)系，與蕾長/蕾徑為直線式正相關(guān)，而與萼長/瓣為直線式負相關(guān)。事實上，黑皮冬瓜植株在5—6月生長季節(jié)生長較為勻速，每1～2 d就可開放一朵花，而且隨著開花在其之上的花蕾大小及形態(tài)特征保持相對穩(wěn)定，而且同一節(jié)位雄花蕾中的小孢子也處于相同的發(fā)育時期，即著生于開花節(jié)之上相同節(jié)次的雄花蕾存在一致性。因此，黑皮冬瓜在這段植株生長相對穩(wěn)定時期可以依據(jù)開花節(jié)之上的節(jié)次、雄花蕾的特征以及外觀各項指標來綜合判定小孢子的發(fā)育時期。經(jīng)對黑皮冬瓜4個品種的觀測，黑皮冬瓜小孢子處于單核靠邊期的雄花蕾特征為：花萼平展，花瓣開始顯現(xiàn)黃色，花藥淺黃色，蕾長與蕾徑大致相等(蕾長0.54～0.76 cm，蕾徑0.53～0.73 cm)，萼長約為瓣長的1.8倍(萼長0.78～1.18 cm，瓣長0.58～0.60 cm)，雄蕊直徑0.39～0.49 cm，著生于主蔓開花節(jié)之上的第7～8節(jié)。

然而，與多數(shù)植物一樣，黑皮冬瓜的生長發(fā)育容易受到氣溫、光照以及土壤肥力條件等因子的影響，而且一旦主蔓結(jié)的瓜開始快速膨大，植株生長會明顯受到抑制而減慢，表現(xiàn)為節(jié)間短縮，相鄰節(jié)位花蕾的大小差異增大，處于開花節(jié)之上同等節(jié)位的花蕾越來越小，這可能會使小孢子發(fā)育時期與花蕾形態(tài)指標以及著生節(jié)位的上述關(guān)系發(fā)生偏差。因此，有必要進一步在不同季節(jié)或生育條件下研究黑皮冬瓜小孢子發(fā)育時期與節(jié)位、花蕾形態(tài)指標的相關(guān)性變化，以便獲得更多的數(shù)據(jù)來精確判定小孢子發(fā)育時期。