汪 鋒， 王 超， 趙懿琛

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院， 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)茶學(xué)院， 貴陽 550025； 3.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 貴陽 550006)

杜仲(Eucommiaulmoides)是我國(guó)特有的單科、單屬、單種的古老孑遺植物，素有植物“活化石”之稱[1-2]。杜仲也是我國(guó)一種名貴的中藥材，通常以皮入藥[3]，藥用成分主要包括苯丙素類(phenylpropanoids)、環(huán)烯醚萜類(iridoids)、木脂素類(lignans)等化合物[4-5]，其中，木脂素及其衍生物因具有較強(qiáng)的生理活性。研究表明，木脂素及其衍生物的高活性與植物細(xì)胞內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferase,GT,EC 2.4.x.y)介導(dǎo)的木脂素糖基化密不可分[6-7]，而GT是一類催化受體分子進(jìn)行糖基化修飾的酶[8]。該酶通常可以核苷酸活化的糖為糖基供體，特異性識(shí)別糖基受體，并在特定位點(diǎn)上催化糖苷鍵的形成，是植物次生代謝過程中一類重要的結(jié)構(gòu)修飾酶[9]，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的多種生理功能[10-11]。因此，研究植物中糖基轉(zhuǎn)移酶基因的功能對(duì)進(jìn)一步了解GT蛋白在植物代謝及對(duì)植物細(xì)胞響應(yīng)胞內(nèi)外適應(yīng)性的調(diào)節(jié)等具有十分重要的意義。本研究以杜仲為材料，利用同源克隆從杜仲cDNA中克隆EuGT2基因，利用生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)杜仲GT蛋白功能，同時(shí)對(duì)該基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析，為深入研究和探討杜仲糖基轉(zhuǎn)移酶在杜仲生長(zhǎng)發(fā)育過程及應(yīng)答外界環(huán)境中的功能和作用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

杜仲來源于貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院的杜仲種植園，E.coliDH 5α菌株保存于貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院實(shí)驗(yàn)室。植物總RNA提取試劑盒Fruit-mateTMfor RNA purification、RNAiso Plus、限制性核酸內(nèi)切酶KpnⅠ、限制性核酸內(nèi)切酶XbaⅠ、IPTG、pMD 20-T Vector、TaqDNA Polymerase、感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒均購(gòu)于Takara公司；High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit購(gòu)自ABI公司；PlatinumTagDNA Ploymerase High Fidelity購(gòu)自Invitrogen公司；膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；氯仿、無水乙醇、異丙醇均購(gòu)買于上海生工生物工程有限公司；胰蛋白棟、酵母提取物、蔗糖、瓊脂粉購(gòu)于Sigma公司；NaCl購(gòu)自成都金山化學(xué)試劑有限公司；卡那霉素、氨芐西林均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；引物合成于華大基因。

1.2 EuGT2基因的克隆、鑒定及測(cè)序

采用Fruit-mateTMfor RNA purification提取試劑盒并按照說明書提取杜仲總RNA，參照ABI公司High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit說明書合成cDNA。根據(jù)前期構(gòu)建的杜仲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)同源克隆引物：F：5′-TCTAGAATGGCCTTTCTCGATGCGA-3′；R：5′-GGTACCCTACGTGGTGATGATGAAGTCCATCG-3′。根據(jù)合成的引物以及反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA對(duì)EuGT2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，62 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，35 cycles；68 ℃ 5 min，4 ℃ forever。將PCR產(chǎn)物置于1.2%瓊脂糖凝膠中分離，用OMEGA公司膠回收試劑盒進(jìn)行回收，并將膠回后的目的片段與載體pMD 20-T Vector按照說明書進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到E.coliDH 5 α感受態(tài)細(xì)胞中，然后用涂布棒均勻涂布在終濃度為100 mg·L-1的氨芐青霉素LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取從藍(lán)白斑板上選擇白色菌落進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)和雙酶切驗(yàn)證，將鑒定后的陽性重組子送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，將測(cè)序所得的結(jié)果與杜仲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。

1.3 EuGT2基因的生物信息學(xué)分析

通過NCBI Conserve Domain Search工具對(duì)EuGT2基因的氨基酸序列進(jìn)行分析，通過在線分析工具ProtParam對(duì)EuGT 2蛋白序列進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測(cè)，利用CBS在線分析工具SignalP和TMHMM Server v 2.0對(duì)EuGT 2蛋白序列的信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，通過在線分析軟件ProtScale對(duì)EuGT 2蛋白氨基酸序列的親疏水性進(jìn)行預(yù)測(cè)，分別用在線軟件PSIPRED和Swiss-Model對(duì)EuGT 2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析預(yù)測(cè)和同源建模。Mega 5.0軟件用于系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

1.4 EuGT2基因?qū)崟r(shí)熒光定量分析

為研究EuGT2基因在杜仲不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期、不同部位的表達(dá)情況，分別對(duì)杜仲成熟植株及杜仲幼苗的根、莖、葉進(jìn)行RNA提取，并通過熒光定量PCR對(duì)EuGT2基因表達(dá)量進(jìn)行分析，采用EuACTIN基因作為內(nèi)參，使用SYBR?Select Master Mix(ThermoFisher Scientific)試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，利用OriginPro 2018和SPSS軟件將所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和顯著性分析。反應(yīng)程序如下：預(yù)變性94 ℃，3.0 min；變性94 ℃，10 s；退火60 ℃，30 s；延伸72 ℃，20 s；共40 cycles；保存12 ℃，∞。

2 結(jié)果與分析

2.1 EuGT2基因的克隆

以總RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條特異性條帶，該片段大小在250～500 bp之間，膠回收目標(biāo)片段，利用測(cè)序和拼接，獲得EuGT2基因的全長(zhǎng)CDS序列，EuGT2基因長(zhǎng)285 bp，共編碼94個(gè)氨基酸。

2.2 EuGT 2蛋白的生物信息學(xué)分析

2.2.1EuGT 2蛋白的氨基酸序列分析和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用Translate(https://web.expasy.org/translate/)將EuGT2基因序列翻譯成氨基酸序列(圖2 A)，EuGT2基因共編碼94個(gè)氨基酸。通過在線軟件Predict Protein對(duì)EuGT 2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，EuGT 2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋(alpha helix)占18.08%，延伸鏈(extended strand)占17.02%，無規(guī)則卷曲(random coil)占64.90%。使用在線軟件Swiss-Model對(duì)EuGT 2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模(圖2 B)，EuGT 2蛋白與同源建模用到的模板分子(Xyloglucan 6-xylosyltransferase 1)的一致性為48.91%。

2.2.2EuGT 2蛋白信號(hào)肽和蛋白親/疏水性預(yù)測(cè)

通過SignalP和TMHMM Server v 2.0對(duì)EuGT 2蛋白序列進(jìn)行信號(hào)肽結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，EuGT 2蛋白無信號(hào)肽(圖3 A)。通過ProtScale對(duì)EuGT 2蛋白的親/疏水性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，EuGT 2蛋白屬于疏水性蛋白(圖3 B)。

2.2.3EuGT 2蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

利用MEGA 5.0軟件將EuGT 2蛋白的氨基酸序列與NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中Blastp的15條GT蛋白序列進(jìn)行多重比對(duì)(圖4)，發(fā)現(xiàn)杜仲EuGT 2蛋白在進(jìn)化過程中與黃燈籠辣椒(Capsicumchinense)半乳甘露聚糖半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的親緣關(guān)系較近。

2.3 EuGT2基因?qū)崟r(shí)定量分析

為了研究EuGT2基因在植株不同時(shí)期、不同部位中的表達(dá)水平，分別對(duì)杜仲初生幼苗期和小苗期的根、莖和葉中的EuGT2基因的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EuGT2基因在初生幼苗期的根、莖、葉中的表達(dá)量無差異顯著，EuGT2基因在杜仲小苗期的根、莖和葉中表達(dá)量均高于杜仲初生幼苗期，而在杜仲小苗期中莖的表達(dá)量最高，是根的2.8倍，是葉的5.5倍。

3 討 論

糖基轉(zhuǎn)移酶能夠通過催化縮合反應(yīng)形成糖苷鍵的形式，將供體的糖基連接到受體分子上，形成多糖分子和糖基化衍生物，在植物的各項(xiàng)生理功能中起重要調(diào)節(jié)作用。在植物體內(nèi)，糖基轉(zhuǎn)移酶的作用底物相當(dāng)廣泛[12]，如細(xì)胞內(nèi)的重要代謝產(chǎn)物糖蛋白、糖脂等的糖基必須在糖基轉(zhuǎn)移酶作用下才能合成[13]；纖維素、木質(zhì)素和果膠等植物細(xì)胞壁組成成分的形成也離不開糖基轉(zhuǎn)移酶的催化。Lim等[14]從擬南芥中成功克隆得到了糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT72E2和UGT72E3，研究后發(fā)現(xiàn)UGT72E2和UGT72E3是糖基化木質(zhì)素合成途徑的重要前體物質(zhì)，參與植物細(xì)胞壁的合成。Zhao等[15]從荔枝果實(shí)中也克隆得到了糖基轉(zhuǎn)移酶基因UFGT3，并發(fā)現(xiàn)該基因參與了荔枝果實(shí)中花青素苷合成，且花青素苷的含量與UFGT3表達(dá)量呈正相關(guān)[15]。由此可見，糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)植物體的生長(zhǎng)發(fā)育起到了至關(guān)重要的作用，所以研究杜仲糖基轉(zhuǎn)移酶基因，不僅可以進(jìn)一步揭示糖基轉(zhuǎn)移酶的功能，還可以為后續(xù)研究糖基轉(zhuǎn)移酶在杜仲生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮的作用提供一定科學(xué)依據(jù)與實(shí)驗(yàn)支持。

利用生物信息學(xué)的方法可從基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中分離得到目的基因，并對(duì)其功能進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析[16]。本研究成功從杜仲中克隆得到了EuGT2基因，利用生物信息學(xué)對(duì)EuGT 2蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，EuGT 2蛋白質(zhì)序列中存在1個(gè)GT家族所特有g(shù)lyco tranf GTA結(jié)構(gòu)域[17]，由此可推斷EuGT 2蛋白屬于GT家族蛋白。信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，EuGT 2蛋白屬于細(xì)胞質(zhì)蛋白，與糖基轉(zhuǎn)移酶催化糖基化反應(yīng)的位置是一致的[18]。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)杜仲初生幼苗期和小苗期的根、莖、葉中EuGT2基因的表達(dá)量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，EuGT2基因在幼苗根、莖、葉中表達(dá)量均較低，且差異不明顯；在成熟植株中，EuGT2基因的表達(dá)量與幼苗中的表達(dá)量相比存在顯著性差異，而且EuGT2基因在杜仲成熟植株莖中的表達(dá)量最高，葉中的表達(dá)量最低。這一結(jié)果與陸軍等[19]從巨桉中克隆得到糖基轉(zhuǎn)移酶EgrGATL1的表達(dá)分析結(jié)果相近。推測(cè)原因可能為EuGT2和EgrGATL1作為GT家族的成員，可能參與了細(xì)胞壁中木質(zhì)素的合成，由于杜仲幼苗的木質(zhì)化程度較低，所以EuGT2基因在杜仲幼苗的不同部位的表達(dá)量均較低且差異不明顯。成熟植株木質(zhì)化程度較幼苗的高，因而EuGT2基因在成熟植株中的表達(dá)量較幼苗相比有顯著性差異；在成熟植株中莖的木質(zhì)化程度最高，其次是根，而葉的木質(zhì)化程度最低，這也與EuGT2基因在莖、根、葉中的表達(dá)趨勢(shì)相符合。由于現(xiàn)有的研究結(jié)果有限，關(guān)于EuGT2基因是否真正參與了杜仲植物細(xì)胞壁中木質(zhì)素的合成，仍然需要進(jìn)行大量的后續(xù)試驗(yàn)來證明，可以在本研究結(jié)果的基礎(chǔ)上對(duì)杜仲幼苗和成熟組織的根莖葉進(jìn)行木質(zhì)素含量測(cè)定，從而進(jìn)一步確定EuGT2基因的功能。