李紅俠，吳長昊，王 晴，王 靜

(宿州學院 生物與食品工程學院，安徽 宿州 234000)

白楊素，又叫白楊黃素，是一種黃酮類化合物，化學名為5,7-二羥黃酮. 白楊素具有廣泛的生物活性，如抗衰老[1]、抗氧化[2]、抗焦慮[3]、抗菌[4]、抗腫瘤[5]等. 其中抗腫瘤活性引起了科研人員的關注[6-9]. 到目前為止癌癥是最難以攻克的疑難雜癥之一，在世界范圍內每年有800萬人死于癌癥,且每年死于癌癥的人數仍在增加. 對于抗癌藥物的研究很自然就成為了藥物研究的熱點和重點. 白楊素能誘導人肝癌細胞系、胃癌以及乳腺癌等癌細胞的增殖效果[10]. 研究表明，它主要通過拮抗雌激素受體，抑制MCF-7細胞的DNA合成. 天然的白楊素脂溶性和水溶性都較差，表現為胃腸道對其的吸收降低，而且5、7位的羥基容易在體內被糖基化，從而導致代謝活性降低，限制了臨床的應用[11]. 為了彌補這些不足，目前科研工作者用白楊素作為主要原材料，通過改變白楊素衍生物的結構來獲得生物利用度可觀的、選擇性好的、沒有毒副作用的白楊素化合物. 目前對白楊素母體的改造，主要是在白楊素的 4、5 和 7 位進行結構修飾，一般通過藥效團拼合、親水性胺基側鏈、酯化、金屬配合物和生物電子等排等，形成小分子的定向化學修飾，得到白楊素的衍生物，并對其生物活性進行研究[12-15]. 現代藥理學研究表明,影響藥物吸收的一個重要因素是膜通透性,它與脂溶性有關. 藥物脂溶性的高低與細胞吸收的效率成正比. 哌嗪具有抗腫瘤譜廣、毒性低(LD50mg/kg)、易溶于水等優(yōu)點[16-17]. 為了增加藥物的脂溶性,將哌嗪引入到白楊素中[18],對白楊素的C7位進行結構修飾，獲得白楊素衍生物，以期獲得細胞吸收較好的抗癌先導物.

1 材料與方法

1.1 材料

細胞株：HeLa細胞，MCF-7細胞，A549細胞，293T(上海通派生物科技有限公司).

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器：倒置熒光顯微鏡(Olympus IX71,日本Olympus)； Heracel CO2培養(yǎng)箱(美國Kendro)，流式細胞儀(BD)； 掃描酶標儀(Sunrise，奧地利TECAN).

主要試劑：C7-白楊素衍生物(本院藥物實驗室合成)； 新生胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)； 溴化四甲基偶氮唑藍(阿拉丁)； DMEM培養(yǎng)基、雙抗(南京化學試劑有限公司)； Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(北京索萊寶). 其他試劑均為分析純，均購于上海國藥集團.

1.3 方法

1.3.1 細胞毒性實驗

采用的細胞株是人源胚胎腎上皮細胞，即293T. 取剛長至完整單層的一瓶細胞，胰蛋白酶消化，吹打均勻. 再將生長至對數期的293T細胞接種到細胞培養(yǎng)板中，將細胞稀釋至大約105個/毫升. 200微升/孔，置于培養(yǎng)箱(5%的二氧化碳，溫度37 ℃)中培養(yǎng). 正常組、陽性對照組和藥物組，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后加藥，每組重復處理3次.

加藥24 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT 15 μL，搖勻，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h. 吸出培養(yǎng)液，每孔加入二甲亞砜150 μL，于搖床搖動8～10 min，使細胞內結晶充分溶解. 于酶標儀(波長490 nm)檢測各孔的吸光值(OD)，根據吸光值計算CC50值.

1.3.2 抗增殖活性測試

在培養(yǎng)好的單層細胞中加入胰蛋白酶進行消化，用槍小心吹打，收集細胞. 取兩滴細胞懸液經臺盼藍(Trypan Blue)染色后置于倒置顯微鏡下，計下活細胞數目(死的細胞數量應小于或等于5%). 將細胞數目調至1×105個/毫升細胞，接種到細胞培養(yǎng)板(96孔)中，200微升/孔，置于培養(yǎng)箱(5%的二氧化碳，溫度37 ℃)中培養(yǎng)12 h之后取出培養(yǎng)板，取出培養(yǎng)板后于每孔中加100μL含不同濃度被測樣品的溶液，使得藥物最終濃度分別為0、10、50、100、150 μM/L. 對照組不加藥品，重復3次. 加完藥后于搖床上輕輕混勻，然后置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h. 取出培養(yǎng)板，每孔加入二甲亞砜150 μL，于搖床均勻晃動10 min左右，用酶標儀測定每孔的吸光度值. 根據各孔的吸光度值，算出藥物對細胞增殖的IC50值.

1.3.3 Annexin V-FITC/PI 雙染色流式細胞術檢測細胞凋亡

將HeLa細胞培養(yǎng)至生長對數期，調細胞濃度，以105個/毫升細胞濃度，將HeLa細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加細胞懸液2 mL，12 h后加藥，最終濃度分別為0、10、15、20 μM/L. 對照組加細胞培養(yǎng)基2 mL. 培養(yǎng)24 h后將細胞處理，胰酶消化，3500 r/min離心5 min后棄去上清，用冷的PBS洗滌兩次后，加Binding Buffer 300 μL 輕輕混勻，再加入5 μL Annexin V-FITC/PI和5 μL PI，輕輕混勻，再加入200 μL Binding Buffer混勻，室溫避光反應10～15 min，于流式細胞儀檢測細胞凋亡，每組樣品收集細胞1萬個. 使用 FlowJo 7.6.1(FACSCA2BUR, Becton Dickinson，USA)軟件進行數據分析及出圖.

2 結果與分析

2.1 藥物對293T的毒性分析

通過MTT法測試該化合物對人腎上皮細胞293T的毒性，結果藥物對人腎上腺上皮細胞株-293T細胞的CC50值為(113.56±0.43)μM/L，陽性對照藥厄洛替尼的CC50值為(89.52±0.43)μM/L，說明該藥物的毒性很低，處于毒性安全區(qū).

2.2 藥物對腫瘤細胞的抗增殖活性

由表1可知，白楊素C7位結構經修飾后，對3種腫瘤細胞的抗增殖性明顯高于白楊素本身，尤其對HeLa細胞的效果較好，IC50值為(20.62±0.35)μmol/L. 但與對照藥厄洛替尼相比，沒有對照藥的效果好.

表1 白楊素衍生物對HeLa、MCF-7、A549細胞的抗增殖活性(IC50， μmol/L)

2.3 藥物對細胞凋亡的結果分析

為了檢測藥物對腫瘤細胞凋亡的影響，選用抑制增殖效果最好的宮頸癌細胞(HeLa)，設置了不同藥物濃度梯度的流式細胞凋亡實驗，結果如圖1所示. 當藥物濃度分別為10、15、20 μM/L時，細胞凋亡率分別為11.02%、14.39%、22.32%，沒經藥物處理的對照的細胞凋亡率為1.39%. 可以看出，隨藥物濃度的增加，細胞凋亡率也增加，與藥物濃度呈劑量依賴性.

3 討論

本研究的藥物是在白楊素的7-位羥基上進行修飾，將得到的藥物進行體外腫瘤細胞的一系列實驗. 根據對HeLa、MCF-7、A549細胞的體外測試結果，藥物的生物活性(抗腫瘤細胞)明顯增強，尤其對HeLa細胞，IC50值為20.62 μmol/L； 在細胞凋亡實驗中，引起細胞凋亡率與藥物劑量呈依賴關系. 這些結果為今后進一步研究白楊素衍生物的其他生物活性提供一定的參考依據.

圖1 藥物對HeLa細胞24 h后的細胞凋亡