趙 月，王湘如，彭 忠，崔潞晴，馮家偉，郭凱旋，曹征征，張 凡，戴夢紅

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢 430070)

喹諾酮類藥物是一類人工合成的抗菌藥物，隨著藥物的過量使用，細菌耐藥性問題日益嚴(yán)重。五肽重復(fù)蛋白(pentapeptide repeat protein,Qnr)是質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因(plasmid-mediated quinolone resistance,PMQR)家族之一，攜帶qnr決定子的微生物更容易對喹諾酮類藥物產(chǎn)生抗性。從許多不同種屬的微生物中發(fā)現(xiàn)這種qnr決定子和qnr變異體，主要為弧菌科、腸桿菌科、氣單胞菌科和假單胞菌科。沙門氏菌和大腸埃希氏菌均屬于腸桿菌科，大腸埃希氏菌是人和動物腸道中最重要且數(shù)量最多的一種細菌，可作為耐藥基因的儲存庫。qnrS是最廣泛的PMQR基因。國內(nèi)外有很多關(guān)于qnrS基因在沙門氏菌中流行的報道。qnrS也是家禽糞便中耐喹諾酮類大腸埃希氏菌的優(yōu)勢基因。由qnrS基因引起的喹諾酮類耐藥水平與其表達水平直接相關(guān)，當(dāng)qnrS基因存在于高表達環(huán)境中時，可能一步產(chǎn)生遺傳穩(wěn)定的臨床耐藥性[1]。qnrS基因在沙門氏菌和大腸埃希氏菌中高度流行并在對喹諾酮類耐藥中扮演重要角色。本文就qnrS基因的發(fā)現(xiàn)、表達調(diào)控及在沙門氏菌和大腸埃希氏菌中的研究進展進行綜述，為控制qnrS基因介導(dǎo)的耐藥性提供參考。

1 qnrS基因及其變異體的發(fā)現(xiàn)

最早的Qnr 蛋白在1998 年發(fā)現(xiàn)于美國阿拉巴馬州分離的一株肺炎克雷伯菌[2]，其pMG252質(zhì)粒中存在一個可轉(zhuǎn)移喹諾酮類耐藥機制(transferable mechanisms of quinolone resistance,TMQR)蛋白，命名為Qnr蛋白。qnrS于2005年在從日本用左氧氟沙星治療的病人中分離的一株福氏志賀氏菌2b中被發(fā)現(xiàn)[3]，該基因位于47 kb的接合性質(zhì)粒pAH0376中。通過質(zhì)粒圖譜和抗藥性編碼基因的克隆，在pAH0376上發(fā)現(xiàn)了一個657 bp編碼218個氨基酸多肽的開放閱讀框(open reading frame,ORF)，該ORF編碼的蛋白與Qnr蛋白高度相似，并且可以認(rèn)為該新基因的產(chǎn)物是Qnr的同系物，因此把該基因及其產(chǎn)物命名為qnrS和QnrS。盡管qnr基因被命名為“質(zhì)粒介導(dǎo)的”，但也存在于一些細菌的染色體上。2007年，在燦爛弧菌[3]中觀察到染色體qnr，與當(dāng)時描述的qnrS1和qnrS2蛋白的同源性均達到了83%以上。此后，在其他弧菌中也檢測到與qnrS具有較高同源性的序列。如與Mytil弧菌(GenBank登錄號KIN11186.1)和副溶血性弧菌(GenBank登錄號WP-1和WP-1)的染色體qnr序列相比，分別具有97%和95.5%～96%的氨基酸同源性。迄今為止，在NCBI基因存儲庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene-family:(qnrS))中記錄了多達14個qnrS等位基因(qnrS1，qnrS2，qnrS4～qnrS15)。根據(jù)當(dāng)前報道，qnrS基因及其變異體更多的是在質(zhì)粒上被發(fā)現(xiàn)，在來源于S.flexneri的IncN和ColRNAI質(zhì)粒[5]上發(fā)現(xiàn)了qnrS1；在來源于E.coli的IncX1質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)了qnrS1[6]和qnrS2[7]；并且有研究證明qnrS2基因所處的遺傳環(huán)境有IS26元件[8]，在來源于E.coli的IncI1質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)了qnrS13[9]。由不同的質(zhì)粒攜帶的qnrS基因在質(zhì)粒DNA結(jié)構(gòu)上具有相似或不同的遺傳環(huán)境，qnrS基因被插入序列(insertion sequence,IS)元件包圍或者位于高度移動性質(zhì)粒上時有助于其轉(zhuǎn)移。然而，qnrS基因是如何產(chǎn)生及其產(chǎn)生的機制還未見報道。

2 qnrS基因的表達及其調(diào)控

qnrS基因的表達依賴于喹諾酮類藥物的應(yīng)激，且受σ-D調(diào)控因子(regulator of sigma D,Rsd)的調(diào)控。將氣單胞菌中攜帶qnrS2 基因的IncU型質(zhì)粒pAC3導(dǎo)入大腸埃希氏菌中，從而研究qnrS2 基因在大腸埃希氏菌中的表達以及調(diào)控qnrS2 基因表達的機制[10]。當(dāng)攜帶pAC3質(zhì)粒的大腸埃希氏菌受到喹諾酮類藥物壓力時，qnrS2的表達增加，σ-D調(diào)控因子(regulator of sigma D,Rsd)的表達也有所上調(diào)，這提示Rsd可能與qnrS2基因的表達有關(guān)。敲除Rsd基因的大腸埃希氏菌在喹諾酮類藥物作用下，qnrS2基因的表達明顯降低，這些結(jié)果表明了Rsd通過調(diào)節(jié)qnrS2的表達在抗性中發(fā)揮作用。qnrS基因的表達受喹諾酮類藥物濃度的影響[11-12]。在亞MIC濃度的環(huán)丙沙星作用下，qnrS基因的保護作用不依賴于質(zhì)粒的拷貝數(shù)，而是受基因表達水平的影響，這個表達水平由環(huán)丙沙星的濃度所決定，在0.4 μg/mL環(huán)丙沙星作用下相對qnrS基因表達顯著升高。另外，當(dāng)環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的濃度在0.4×MIC時，qnrS的轉(zhuǎn)錄量最大。

3 qnrS基因在沙門氏菌中的研究

3.1 qnrS基因在沙門氏菌中的流行

qnrS基因在沙門氏菌中高度流行。據(jù)報道，從中國26個省、自治區(qū)、直轄市腹瀉豬[13]、肉雞供應(yīng)鏈[14]，韓國雞源[15]和南非醫(yī)院病房[16]中分離的質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類耐藥沙門氏菌中，qnrS的分離率分別為47.1%、41.1%、33.3%和19.4%。有研究報道了從腹瀉患者、動物性食品和寵物中分離的多重耐藥沙門氏菌中發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的分離株都攜帶qnrS基因[17]。除了以上在人食用動物、寵物、動物性食品以及環(huán)境等樣品中檢測到攜帶qnrS基因的沙門氏菌的報道外，2010年-2012年從陜西省12個地區(qū)(包括西安、寶雞、楊凌、咸陽等)的51家超市和32家零售店隨機收集干奶粉相關(guān)的嬰兒食品中，也分離出攜帶喹諾酮類耐藥基因qnrS的沙門氏菌，且陽性率高達47.5%[17]?？梢?，攜帶qnrS基因的沙門氏菌無處不在，對公共衛(wèi)生和食品安全造成很大的威脅。

3.2 沙門氏菌中qnrS基因的轉(zhuǎn)移

攜帶耐藥基因的質(zhì)粒能夠在菌群中進行轉(zhuǎn)移，引起耐藥基因在菌群中的廣泛傳播，從而導(dǎo)致耐藥情況加重。在英國的一項研究中[19]，不僅在沙門氏菌中檢測到qnrS基因，而且還發(fā)現(xiàn)在4種不同血清型沙門氏菌(S.stanley,S.typhimurium,S.virchowandS.virginia)的不同質(zhì)粒骨架上均存在qnrS1。根據(jù)質(zhì)粒RFLP圖譜顯示，qnrS1位于不同的遺傳環(huán)境中，但是其存在于擁有共同祖先的質(zhì)粒上，這表明質(zhì)?；騫nrS1在沙門氏菌菌種間的成功傳播。研究發(fā)現(xiàn)，將沙門氏菌中攜帶qnrS1基因的 IncH1/IncF型質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至大腸埃希氏菌J53，導(dǎo)致環(huán)丙沙星對大腸埃希氏菌的MIC降低2倍(1 μg/mL降至0.5 μg/mL)，但是，當(dāng)該質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至對環(huán)丙沙星敏感的鼠傷寒沙門氏菌(MIC為0.015 μg/mL)時，環(huán)丙沙星對沙門氏菌的MIC提高了66.67倍(1 μg/mL)，使沙門氏菌達到臨床耐藥水平[20]。qnrS基因在菌株之間進行傳播的機制，取決于其所存在的質(zhì)粒類型。qnrS基因位于接合性質(zhì)粒上時，在菌株間可直接發(fā)生接合轉(zhuǎn)移；qnrS基因位于非接合性質(zhì)粒上時，需要一個新的Incl1型接合性輔助質(zhì)粒的參與，接合性輔助質(zhì)粒通過復(fù)制轉(zhuǎn)錄靶向位于非接合性環(huán)丙沙星耐藥編碼質(zhì)粒中的插入序列(insertion sequence,IS)元件，最終形成可在腸桿菌科成員間傳播的雜交接合質(zhì)粒，從而使qnrS基因在菌株之間進行傳播。此外，研究還發(fā)現(xiàn)只有在37℃和42℃的溫度下，才會形成融合質(zhì)粒，導(dǎo)致其隨后傳播至其他細菌，這表明這些質(zhì)粒融合和傳播事件可能發(fā)生在人和動物身上。因此，應(yīng)充分了解影響qnrS基因表達上調(diào)和促進qnrS基因在菌群中轉(zhuǎn)移的因素，從而為防止qnrS基因介導(dǎo)的耐藥性的產(chǎn)生和傳播提供參考。

4 qnrS基因在大腸埃希氏菌中的研究

4.1 qnrS基因在大腸埃希氏菌中的流行

大腸埃希氏菌是一種廣泛存在于食物、環(huán)境和腸道中的微生物。據(jù)報道，從熟食品、環(huán)境、動物腸道分離的大腸埃希氏菌中均有qnrS基因的檢出。qnrS基因是豬場環(huán)境中大腸埃希氏菌對喹諾酮類耐藥基因中最常見的耐藥基因之一。從我國3個豬場[21]采集不同樣本，調(diào)查耐藥大腸埃希氏菌中qnrS基因流行情況的結(jié)果顯示，qnrS基因的分離率達40.00%～43.48%。在散養(yǎng)豬[22]中，qnrS基因具有17.9%的檢出率。qnrS基因也是家禽糞便中耐喹諾酮類大腸埃希氏菌的優(yōu)勢基因。含qnrS基因的耐喹諾酮類藥物的大腸埃希氏菌在肉雞中非常普遍，印度尼西亞蘇卡布米[23]禽大腸桿菌病臨床病例中，質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因qnrS的陽性率為23%。此外，qnrS基因還在山羊、水貂、牛等動物分離的大腸埃希氏菌中被檢出。在分離出攜帶qnrS基因的大腸埃希氏菌的動物中，有的為健康動物[24]，這是由于其所處的圈舍衛(wèi)生狀況較差而獲得qnrS基因。綜上所述，健康的動物可以充當(dāng)耐藥大腸埃希氏菌的儲存庫，大腸埃希氏菌可作為傳播qnrS基因的載體，進而使病原菌獲得耐藥基因產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致臨床治療失敗。

4.2 大腸埃希氏菌中qnrS基因的轉(zhuǎn)移

qnrS基因在家禽養(yǎng)殖場及其環(huán)境中的傳播與水平基因轉(zhuǎn)移和克隆傳播有關(guān)，但以水平傳播為主。在實驗室條件下證明qnrS基因可以在不同菌種之間進行轉(zhuǎn)移，即大腸埃希氏菌中的qnrS基因能夠向鼠傷寒沙門氏菌進行轉(zhuǎn)移[25]。qnrS基因也可以在相同菌種[26]之間進行轉(zhuǎn)移，研究表明在高于耐藥折點的環(huán)丙沙星(5 μg/mL)選擇壓力下，耐環(huán)丙沙星的大腸埃希氏菌中qnrS基因向敏感的大腸埃希氏菌中轉(zhuǎn)移的同時，導(dǎo)致了轉(zhuǎn)移接合子中g(shù)yrA喹諾酮類耐藥決定區(qū)(quinolone resistance determining region,QRDR)獲得性突變Ser83Leu和Asp87Asn，從而使接合子獲得對喹諾酮類藥物更高的耐藥水平。因此，慎用抗生素是減少突變，降低耐藥基因傳播風(fēng)險的途徑。目前，在體外條件下，qnrS基因在菌種間的轉(zhuǎn)移已有報道，但還未見其在動物體內(nèi)環(huán)境下轉(zhuǎn)移的報道。然而，在未暴露于環(huán)丙沙星的大腸埃希氏菌中，仍然可以檢測到qnrS基因。研究發(fā)現(xiàn)，從加拿大新不倫瑞克省8個農(nóng)場的荷斯坦奶牛犢牛中分離的100株頭孢類耐藥大腸埃希氏菌中有9株對萘啶酸耐藥，同時對環(huán)丙沙星中介敏感。其中有7株檢測出質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥(2株檢出qnrS)。經(jīng)調(diào)查這些奶牛場主要是采用頭孢噻呋治療牛疾病，并未使用過環(huán)丙沙星[27]。這可能是因為qnrS基因與β-內(nèi)酰胺類抗性基因位于同一個質(zhì)粒上。近年來，已經(jīng)有很多關(guān)于大腸埃希氏菌攜帶的qnrS與β-內(nèi)酰胺類抗性基因發(fā)生共轉(zhuǎn)移的報道。由此可見，大腸埃希氏菌中qnrS基因的傳播會促進多重耐藥性的發(fā)展。

5 展望

qnrS基因被IS元件包圍的遺傳環(huán)境有助于其通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)移在菌株間進行傳播，處于亞抑制濃度喹諾酮類藥物的環(huán)境下，能夠上調(diào)qnrS基因的表達，進一步降低菌株對藥物的敏感性。qnrS基因在自然條件和喹諾酮類藥物的選擇性壓力下都能夠在細菌屬內(nèi)和屬間進行轉(zhuǎn)移。因此，qnrS基因引起的耐藥性問題不容忽視，喹諾酮類藥物的不合理使用和耐藥基因qnrS的可轉(zhuǎn)移性對耐藥性的產(chǎn)生和傳播帶來的風(fēng)險，也需要引起重視?？紤]到人畜傳播的可能性以及攜帶qnrS基因的質(zhì)粒常常攜帶其他耐藥基因，所以，要加強對臨床來源菌株qnrS基因的監(jiān)測，警惕該基因的傳播和多重耐藥性的發(fā)展。