●李人亮 胡子毅 張 平

高血壓是一種以體循環(huán)動(dòng)脈壓力升高為主要特征的心血管綜合征，是臨床常見的慢性疾病，是心腦血管疾病最常見但可逆的危險(xiǎn)因素之一。大多數(shù)高血壓患者沒有明顯的癥狀，少數(shù)可出現(xiàn)頭暈、頭痛和其它輕微癥狀，正是由于高血壓病缺乏典型的癥狀，使得其在人群中具有潛伏性，難以及時(shí)發(fā)現(xiàn)[1]。長(zhǎng)期的高血壓可致使動(dòng)脈粥樣硬化，而動(dòng)脈粥樣硬化也會(huì)促使血壓進(jìn)一步升高，兩者互相關(guān)聯(lián)、相互促進(jìn)，最終導(dǎo)致心、腦、腎等重要靶器官功能障礙，其常見的合并癥有冠心病、腦卒中、急性主動(dòng)脈綜合征、外周動(dòng)脈疾病[2]。根據(jù)2010年全球疾病負(fù)擔(dān)研究，中國(guó)每年由于血壓升高而導(dǎo)致的過早死亡人數(shù)高達(dá)200萬，每年直接醫(yī)療費(fèi)用達(dá)366億元人民幣[3]。根據(jù)2010年第六次全國(guó)人口普查數(shù)據(jù)測(cè)算，我國(guó)高血壓患病人數(shù)約為2.45億[4]。高血壓對(duì)我國(guó)造成了巨大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)壓力和公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)，因此積極防治高血壓具有重大意義。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展，盡管在血壓的控制方面取得了顯著的進(jìn)步，但在緩解癥狀、改善血管內(nèi)皮功能、保護(hù)靶器官等方面，中醫(yī)藥治療更具優(yōu)勢(shì)。

高血壓病在中醫(yī)學(xué)理論中歸屬于“眩暈”“頭痛”等范疇，本病以陰虛為本，陽亢為標(biāo)，瘀血貫穿疾病始終，其中火、飲、虛是病機(jī)關(guān)鍵，三者往往合并存在，交互為病[5]。肝陽上亢，肝火上炎，陽升風(fēng)動(dòng)，上沖腦竅；脾胃虛弱，痰飲內(nèi)生，肝風(fēng)、肝陽夾痰濁之邪上沖清竅；大病久病及腎，腎陰虧虛，水不涵木，腦竅失養(yǎng)。武玉琳等人[6]對(duì)2001年至2017年已發(fā)表的關(guān)于中醫(yī)藥治療原發(fā)性高血壓的文獻(xiàn)進(jìn)行收集整理，篩選出有效處方1042個(gè)，通過復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析，得出了6個(gè)最為常見的中醫(yī)證型，即肝陽上亢證、陰虛陽亢證、痰濕壅盛證、肝腎陰虛證、陰陽兩虛證、肝火亢盛證。近年來的研究顯示痰濕證候在高血壓病中頗為常見[7]。溫膽湯出自《三因極一病證方論·驚悸證治》，其組成包括半夏、陳皮、竹茹、枳實(shí)、茯苓、甘草六味藥物，具有理氣化痰，利膽和胃之功，臨床常應(yīng)用于治療痰濕壅盛、痰濁中阻型高血壓。有研究表明[8]，溫膽湯對(duì)心臟間質(zhì)成纖維細(xì)胞的過度增殖有一定的抑制作用，對(duì)高血壓的心肌纖維化有預(yù)防與逆轉(zhuǎn)作用，但具體機(jī)制尚不清楚，因此本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探尋溫膽湯治療高血壓的關(guān)鍵活性成分和主要靶點(diǎn)通路。

1 材料與方法

1.1 溫膽湯活性成分的獲取及靶點(diǎn)的篩選利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP，http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php），以陳皮、半夏、茯苓、甘草、枳實(shí)、竹茹為關(guān)鍵詞，對(duì)溫膽湯中6味中藥的全部化學(xué)成分進(jìn)行收集。若在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中無法獲取數(shù)據(jù)，則通過TCMID 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//bidd.nus.edu.sg/group/TCMsite/Default.aspx）和化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)（Chemsitry Database，http：//www.organchem.csdb.cn/scdb/default.asp），以及檢索國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)獲取相關(guān)信息。通過限制口服吸收利用度(OB)≥30%、藥物相似性(DL）≥0.18對(duì)溫膽湯的活性成分篩選[9]。然后將篩選好的候選活性成分在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)和SwissTarget Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//swisstargetprediction.ch/）中收集蛋白靶點(diǎn)。最后通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/）進(jìn)一步將收集到的蛋白靶點(diǎn)轉(zhuǎn)化為對(duì)應(yīng)的基因名稱，獲取與活性成分作用的相關(guān)蛋白靶點(diǎn)（人源）。

1.2 高血壓靶點(diǎn)篩選在疾病基因數(shù)據(jù)庫(kù)（Genecard數(shù)據(jù)庫(kù)，https：//www.genecards.org/；OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)，https：//omim.org/；Drugbank 數(shù)據(jù)庫(kù)，https：//www.drugbank.ca/）中 以“hypertension”“hypertensive”“essential hypertension”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，收集高血壓疾病的相關(guān)基因。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析將獲取到的溫膽湯活性成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與高血壓疾病相關(guān)靶點(diǎn)取交集，藥物-疾病的交集基因。利用Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建溫膽湯的“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，探究溫膽湯活性成分和相關(guān)靶點(diǎn)的相互作用。然后在Tools 工具欄中的NetworkAnalyzer 模塊中選擇Analyze Network 功能對(duì)藥物進(jìn)行拓?fù)浞治?。在String 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//stringdb.org/），通過交集得到的靶點(diǎn)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。物種設(shè)為“Homo sapiens”(人類)，最低相互作用閥值設(shè)為最高置信度0.9“highest confidence”，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置。然后借助Cytoscape 3.6.0軟件中CytoHubba 插件，依據(jù)MCC 得分進(jìn)行核心（Hub）基因的篩選，選出得分排名前10位的基因。

1.4 基因本體論（GO）分類富集分析及京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析利用R軟件中的BiocManager 軟件包對(duì)上述交集基因進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析。

1.5 溫膽湯治療高血壓的成分及機(jī)制的文獻(xiàn)驗(yàn)證通過檢索國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，分析溫膽湯治療高血壓的相關(guān)成分與機(jī)制，為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)所預(yù)測(cè)的結(jié)果提供文獻(xiàn)驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 活性成分篩選及靶點(diǎn)篩選本研究中半夏、陳皮、茯苓、甘草、枳實(shí)五味藥物的化學(xué)成分通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，竹茹化合物的基本信息通過化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，通過限定OB≥30%和DL≥0.18進(jìn)行篩選，剔除未找到靶點(diǎn)的化學(xué)成分，共得到236個(gè)活性成分，預(yù)測(cè)靶標(biāo)2179個(gè)，見表1。將預(yù)測(cè)靶標(biāo)去除重復(fù)值后，得到312個(gè)靶點(diǎn)。表2中列舉出了溫膽湯中靶點(diǎn)數(shù)排前10位的成分信息。

表1 溫膽湯“中藥-活性成分-預(yù)測(cè)靶標(biāo)”信息

表2 溫膽湯靶點(diǎn)數(shù)前10位成分信息

2.2 疾病靶點(diǎn)篩選結(jié)果通過Genecard數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出高血壓疾病相關(guān)基因735個(gè)，OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得97個(gè)基因，Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得16個(gè)基因，去除重復(fù)基因后，最后獲得816個(gè)高血壓疾病基因。

2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與結(jié)果分析將所得到的溫膽湯的藥物靶點(diǎn)與高血壓相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，得到94個(gè)共有靶點(diǎn)，對(duì)應(yīng)溫膽湯活性成分142個(gè)。利用Cytoscape軟件構(gòu)建藥物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見圖1。對(duì)藥物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩赃M(jìn)行分析，先篩選出度值（Degree）與介數(shù)（Betweenness）均大于平均值的化合物，然后依照度值大小排序篩選出前10的化合物，見表3。利用String數(shù)據(jù)庫(kù)將映射所得的94個(gè)靶點(diǎn)制作成PPI 網(wǎng)絡(luò)，限定其置信度為0.9，其產(chǎn)生相互作用的網(wǎng)絡(luò)有94個(gè)節(jié)點(diǎn)，229條邊，平均節(jié)點(diǎn)度：4.87，平均局部聚類系數(shù)：0.474，見圖2。利用Cytoscape 軟件進(jìn)行Hub 基因的篩選，根據(jù)MCC算法篩選出10個(gè)得分最高的基因，即STAT3、JUN、IL6、MAPK3、VEGFA、IL1B、AKT1、TIMP1、IL4、IL2，說明這10個(gè)基因是溫膽湯治療高血壓的關(guān)鍵靶標(biāo)，見圖3。

圖1 藥物-疾病交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.4 基因本體論（GO）分類富集分析及京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析利用R 軟件的BiocManager 軟件包對(duì)溫膽湯治療高血壓的交集基因進(jìn)行GO分類富集和KEGG 通路富集分析。依據(jù)P＜0.05進(jìn)行GO 和KEGG 通路富集分析，其中富集靶標(biāo)越多、P值越小的通路，與溫膽湯治療高血壓的關(guān)系越為密切，分別篩選出前10條GO 條目和前20條KEGG 通路。GO 分類富集分析包括細(xì)胞組分（cellular component，CC）、生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）3個(gè)部分。通過GO分類富集分析確定了1837個(gè)條目，其中涉及生物過程的有1686條，涉及細(xì)胞組成的有61條，涉及分子功能的有90條，見圖4。通過KEGG 通路富集分析，找到了126條信號(hào)通路，主要包括糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路、流體剪應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化通路、TNF信號(hào)通路、松弛素信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等，見圖5。

表3 度值前十的化合物

圖2 溫膽湯治療高血壓疾病PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 溫膽湯治療高血壓疾病的Hub基因

圖4 GO富集分析

圖5 KEGG通路富集分析

2.5 文獻(xiàn)驗(yàn)證溫膽湯的臨床應(yīng)用范圍較為廣泛，主要用于治療“痰”“氣”(郁)“熱”(火)為病機(jī)的多種疾病，包括精神神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等方面疾病。方中以法半夏燥濕化痰為主藥；痰因氣滯，陳皮利氣祛痰；茯苓健脾滲濕，使?jié)袢ザ迪?；炙甘草補(bǔ)土和中；竹茹清脾胃郁熱，枳實(shí)破滯助法半夏消痰；全方具有清痰利氣調(diào)達(dá)氣機(jī)之功。研究表明，槲皮素具有降壓、降低血中低密度脂蛋白濃度的作用[10-11]；柚皮素具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[12]；川皮苷對(duì)NO 有雙向調(diào)節(jié)作用，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用[13]。溫膽湯可以減輕內(nèi)皮細(xì)胞中由同型半胱氨酸引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，通過下調(diào)TNF-α/p38、MAPK／NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)，緩解內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷，進(jìn)而對(duì)內(nèi)皮產(chǎn)生一定的保護(hù)作用，最終達(dá)到降血壓、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗血栓等作用[14]。

3 討論

中藥現(xiàn)代化、科學(xué)化的難點(diǎn)和問題關(guān)鍵在于中藥復(fù)方成分較為復(fù)雜，多成分間存在協(xié)同作用，存在著復(fù)雜化學(xué)體系的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理[15]。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論，對(duì)生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)分析，選取特定信號(hào)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行多靶點(diǎn)藥物分子設(shè)計(jì)的新學(xué)科。中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的主要目的是尋找適合中醫(yī)藥體系研究的模式和方法。中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-疾病”復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，從整體和系統(tǒng)出發(fā)，闡釋和分析研究對(duì)象的藥理學(xué)機(jī)制，與中藥多成分-多靶點(diǎn)的作用模式不謀而合，為研究中藥成分復(fù)雜作用機(jī)制提供新的思路[16]。

本研究篩選出溫膽湯與高血壓疾病的交集基因94個(gè)，構(gòu)建出藥物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步進(jìn)行拓?fù)浞治?，找出槲皮素、柚皮素、川皮苷、山奈酚、木犀草素?0種溫膽湯治療高血壓的關(guān)鍵活性成分。槲皮素、柚皮素、川皮苷、山奈酚、木犀草素、刺芒柄花素、7-甲氧基-2-甲基異黃酮均屬于黃酮類化合物，具有抗炎，降壓，降低血管的脆性，改善血管的通透性，降低血脂和膽固醇，擴(kuò)張血管，抗血凝等作用[13]。結(jié)合文獻(xiàn)驗(yàn)證，說明溫膽湯治療高血壓的分子機(jī)制具有科學(xué)性。

同時(shí)將94個(gè)交集基因構(gòu)建成PPI 網(wǎng)絡(luò)，再根據(jù)MCC算法篩選出得分排前10的溫膽湯治療高血壓的關(guān)鍵靶標(biāo)，即STAT3、JUN、IL6、MAPK3、VEGFA、IL1B、AKT1、TIMP1、IL4、IL2。其中STAT3信號(hào)通路可釋放白細(xì)胞介素（IL6）、腫瘤壞死因子（TNF）等炎癥因子，從而損傷心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞[17]。JUN 是激活蛋白-1（AP-1）家族中生物活性最強(qiáng)的一員，AP-1是高血壓心室肥厚發(fā)展過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控心鈉肽（ANP）、腦鈉肽（BNP）等心肌肥厚早期應(yīng)答基因[18]。IL6、IL4、IL2、IL1B均屬于白細(xì)胞介素（IL）家族成員，它們與高血壓的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)[19]。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者。ERK1（MAPK3）是在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)絲裂原活化蛋白激酶，ERK1通路的激活具有一定的抗氧化、抗炎，保護(hù)心肌細(xì)胞等作用[20]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)普遍存在于各組織器官中，主要生理功能是促進(jìn)血管新生，在高血壓導(dǎo)致的血管重建中具有調(diào)控作用[21]。AKT 是一種絲氨酸／蘇氨酸激酶，在心肌肥厚和重塑中起著重要作用，在高血壓心肌纖維化中，AKT1的表達(dá)及激活介導(dǎo)了炎癥細(xì)胞作用下的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化[22]。

本研究通過KEGG 通路富集分析，找到了126條信號(hào)通路，主要包括糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、流體剪應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化通路、TNF 信號(hào)通路、松弛素信號(hào)通路等通路。表明上述信號(hào)通路在溫膽湯治療高血壓疾病中發(fā)揮重要的作用，值得進(jìn)一步研究。晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）是通過蛋白質(zhì)、脂類和核酸的非酶糖基化和氧化而產(chǎn)生的，通過蛋白質(zhì)交聯(lián)或與細(xì)胞表面受體結(jié)合從而促進(jìn)心臟功能障礙的發(fā)生[23-24]。有研究顯示[25]，糖尿病患者體內(nèi)產(chǎn)生的AGEs 通過激活A(yù)GE-RAGE信號(hào)通路，然后激活FSTL1的表達(dá)，從而促使IL-1β、TNF-α等炎性因子的表達(dá)，進(jìn)一步導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化通路是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的重要機(jī)制。TNF信號(hào)通路與炎癥反應(yīng)有關(guān)，參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展過程[26]。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)溫膽湯治療高血壓進(jìn)行了分析，初步揭示了溫膽湯治療高血壓的潛在活性成分、作用網(wǎng)絡(luò)和潛在作用機(jī)制，為進(jìn)一步探討其發(fā)揮作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究提供方向，其后續(xù)尚需系統(tǒng)的靶點(diǎn)驗(yàn)證和體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其功效網(wǎng)絡(luò)的內(nèi)在關(guān)聯(lián)和作用靶點(diǎn)集合。