曹井賀 董業(yè)浩 孫寶剛 房 姣 梁魯南 劉貞輝

濟寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院（山東濟寧 272029）

人類Y染色體是由大部分是異染色質(zhì)組成的小的近端著絲粒染色體,容易發(fā)生形態(tài)學(xué)即長度的變化,諸如46，XY，Y≥18、46，XY，Y≤21；46，X，Yq-；46，X，Yp+，對于這是Y染色體的正常形態(tài)表現(xiàn)，還是異常染色體類型？目前仍然存在很多爭議。而Y染色體多態(tài)性對精子功能的影響未見有相似報道，Y染色體長度對IVF/ICSI-ET妊娠結(jié)局以及出生后代的影響也鮮有報道且存在爭議[1-3]?；谝陨涎芯勘尘巴ㄟ^分析Y染色體多態(tài)性患者精液質(zhì)量及其精子功能、IVF/ICSI-ET妊娠結(jié)局以及后代情況，探討Y染色體多態(tài)性對精液質(zhì)量、精子功能、輔助生殖妊娠結(jié)局以及出生后代的影響，為臨床上對此類患者進行生育能力評價、治療措施的選擇、遺傳咨詢、妊娠結(jié)局的預(yù)測、對子代的影響等提供依據(jù)。

資料與方法

一、研究對象

回顧分析濟寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心2016年6月至2019年12月因男方因素行IVF-ET/ICSI-ET的207例Y染色體多態(tài)性患者（包括50例46,XY，Y≥18;51例46,XY，Y≤21；36例46，X，Yqs；30例46，X，Yq-;40例，46，X，Yp+），為實驗組（A組），染色體正常135例男性納入對照組（B組）。所有周期均為第一次治療周期，所有患者進行助孕治療前均經(jīng)過詳細(xì)的一般情況檢查、體格檢查、內(nèi)分泌檢查、遺傳學(xué)檢查和至少兩次精液分析。具有嚴(yán)重生殖系統(tǒng)異常的患者，如重度精索靜脈曲張、隱睪癥等均被排除在研究之外。重度少精子癥（精子計數(shù)＜5×106/ml）和無精癥患者均要進行Y染色微缺失的檢查，具有Y染色微缺失的男性也被排除在研究之外，對Y染色體多態(tài)性患者進行必要的遺傳咨詢。

女方篩選標(biāo)準(zhǔn)：染色體核型46，XX，未發(fā)現(xiàn)已知的影響IVF-ET或ICSI-ET妊娠結(jié)局的疾?。ㄆ渫ㄟ^HSG或者宮腔鏡、腹腔鏡手術(shù)以及超聲檢查證實）。本項研究得到了濟寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。所有的研究對象均在自愿的前提下簽署了科研知情同意書。

二、方法

（一）實驗方法

1.細(xì)胞遺傳學(xué)檢查方法

取外周血進行淋巴細(xì)胞培養(yǎng)后,常規(guī)制備染色體標(biāo)本,G顯帶分析計數(shù)30個中期分裂相,分3～5個核型,異常者加倍分析、計數(shù),結(jié)果分析按人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN,1985)進行。

2.精液常規(guī)分析

（1）計算機輔助精子分析(CASA):采用計算機輔助精子分析儀(西班牙，SCA)檢測精子密度、總數(shù)、各級運動精子百分率和數(shù)量等。

（2）精子形態(tài)學(xué)分析(Diff-Quik法):檢測精子形態(tài)正常率=畸形精子數(shù)/計數(shù)精子總數(shù)×100%

3.精子功能檢查

依照WHO技術(shù)規(guī)范采集、處理和檢測精液標(biāo)本，檢測實驗組與對照組相關(guān)精子指標(biāo)水平以及精子-透明質(zhì)酸結(jié)合率；精子核蛋白不成熟率；精子DNA碎片率。

（1）精子頂體酶活性檢測：使用精子頂體染色試劑盒（PSA-FITC，深圳華康生物）檢測精子頂體酶活性，簡要步驟如下：測定精液常規(guī)參數(shù)后，測定和對照Ep管中加入7.5×106個精子，離心去除精漿，按照試劑盒使用說明操作，依次加入相關(guān)試劑，水浴后離心，紫外分光光度計讀取各管405 nm的OD值，計算頂體酶活性。

（2）精子核蛋白組型檢測（苯胺藍染色法，深圳華康生物)利用洗滌液稀釋精子濃度至40×106/ml，對于小于該濃度的樣本進行離心濃縮）。取上述調(diào)整后的精液1 ml加Eppendorf管內(nèi)，1000×g離心10 min，去除精漿。加1ml洗滌液，充分混勻。1000×g離心3 min去上清液，如此共洗滌3次。最后一次離心棄上清液后，加1ml粘合液。取5μl調(diào)整后的精液涂片，空氣干燥。加固定液固定90s，甩去固定液。玻片以自來水輕輕沖洗7次，甩去玻片表面積水，加染液覆蓋膜片區(qū)，染色5 min。以自來水緩緩沖洗，然后將膜片浸泡至洗脫液中準(zhǔn)確脫色18～20 min，或至膜片無明顯藍色為止。立即甩去脫色液，以自來水快速洗滌7次。迅速吹干或晾干后加封固液1滴，以蓋玻片封片。油鏡計數(shù)200個精子，不成熟核蛋白組型轉(zhuǎn)換的異常精子頭部呈藍色，計算頭部著色精子百分率。

（3）精子DNA碎片檢測[精子染色質(zhì)擴散實驗(SCD)法，深圳博銳德生物科技有限公司]。檢驗方法：（1）試劑及室溫準(zhǔn)備：將易熔凝膠管置于80℃孵育20 min，待完全融化后，將易熔凝膠管置于37℃待用。檢測前將室溫調(diào)整至20-28℃。(2)標(biāo)本制備：將液化的新鮮精子濃度用生理鹽水調(diào)整至(5-10)×106/ml (3)檢測方法：嚴(yán)格按照試劑盒使用說明給出的檢測方法進行檢測。(4)精子DNA碎片判定標(biāo)準(zhǔn)：精子頭部僅產(chǎn)生較小的光暈或無光暈，單側(cè)光暈的厚度不超過精子頭部最小直徑的1/3。SDF(%)=存在DNA碎片精子數(shù)/ 被觀察精子總數(shù)×100%。

（四）精子-透明質(zhì)酸結(jié)合率檢測（深圳博銳德生物科技有限公司）：將10μl液化的精液加入透明質(zhì)酸包被的載玻片（測定孔）“T”孔中，待精液白然擴散到（對照孔）“C”孔，蓋上蓋玻片；室溫放置10min后，在400倍顯微鏡下觀察精了與玻片上的透明質(zhì)酸結(jié)合情況，計數(shù)500個活動精了，精了-透明質(zhì)酸結(jié)合率(%)=(“T”孔被結(jié)合精了數(shù)/“T”孔計數(shù)活動精了總數(shù)-“C”孔被結(jié)合精了數(shù)/“C”孔計數(shù)活動精了總數(shù))×100%。

（二）臨床操作

1.控制性超促排卵：實驗組與對照組女方均選擇長方案超促排卵：于啟動周期前次月經(jīng)黃體中期肌注GnRH。達菲林1.33mg，月經(jīng)第3天開始使用Gn促排卵，月經(jīng)第6天起，行陰道B超檢查卵泡和子宮內(nèi)膜發(fā)育情況，并以此及時調(diào)整用藥。直至有2～3個主導(dǎo)卵泡直徑在18mm以上時，結(jié)合激素檢測結(jié)果提示卵泡發(fā)育成熟，停用促排卵藥物，于當(dāng)晚8點注射hCG5000-10000u。注射hCG后34～36小時在陰道B超引導(dǎo)下穿刺取卵，記錄取卵數(shù)。

2.對Y染色體多態(tài)性患者進行必要的遺傳咨詢。

（三）胚胎實驗室操作。

1.精子處理：為了減少或者去除精漿的抗精子抗體、細(xì)菌、免疫活性細(xì)胞、雜質(zhì)，達到符合要求的精子濃度，促進精子獲能，改善精子受精能力等，將實驗組與對照組在授精前需對精子進行必要的處理。采用密度梯度分離法分離：其具體步驟為：取精子密度梯度分離培養(yǎng)基，吸取1ml下層(高密度)分離培養(yǎng)基置于離心管中，再吸取1ml上層分離培養(yǎng)基(低密度)緩慢地注于下層分離培養(yǎng)基的上面。兩層培養(yǎng)基的中間形成一個清晰的界面，37℃培養(yǎng)箱復(fù)溫。小心吸取1ml培養(yǎng)基化的精液覆蓋于上層分離培養(yǎng)基的液面。以(300～600)×g的速度離心20min。移去所有的分層溶液，只剩底部的沉淀。加2～3ml洗精培養(yǎng)基，將沉淀混勻。200×g離心5min。移去上清，再加入洗精培養(yǎng)基，重復(fù)離心洗滌步驟。用0.5mlIVF受精培養(yǎng)基沉淀。進行精于計數(shù)和精子質(zhì)量評估。將處理獲得的精子調(diào)整密度(50～300)×103／ml為宜，后置5%CO2、37℃、95%濕度培養(yǎng)箱待用。

2.受精及胚胎培養(yǎng)：實驗組、對照組采用常規(guī)的體外受精。受精后18h觀察原核，出現(xiàn)2個原核和2個極體為正常受精卵，未出現(xiàn)2PN為受精完全失敗。取卵后培養(yǎng)72h觀察胚胎形態(tài)，將優(yōu)質(zhì)胚胎移植到宮腔內(nèi)。胚胎移植后14天檢測尿或血HCG陽性，移植后4～5周超聲檢查見胎心搏動為臨床妊娠。移植時先選擇常規(guī)受精來源的胚胎，若無常規(guī)受精來源胚胎則移植ICSI受精胚胎。

3.胚胎按以下評分標(biāo)準(zhǔn)分級

形態(tài)學(xué)指標(biāo)：4’-卵裂球大小均勻，碎片為≤5%；3’-卵裂球大小均勻或不等，碎片6%～20%；2’-卵裂球體積相等或不等，碎片21%～50%；1’-卵裂球少，碎片＞50%。1、2級胚胎在發(fā)育過程中出現(xiàn)下列情況，胚胎評級時在形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上降一級：①授精20h內(nèi)未見到原核，48h證實為延遲受精的胚胎。②取卵后48h超過8細(xì)胞或72h未超過5細(xì)胞。正常受精4、3級胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎。

（四）計算公式：受精率=正常受精卵數(shù)/ 卵-冠-丘復(fù)合體數(shù)×l00%；優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/ 正常受精卵數(shù)×l00%；著床率=B超觀察到的妊娠囊數(shù)/ 移植胚胎數(shù)×100% ；臨床妊娠率=臨床妊娠例數(shù)/ 移植周期數(shù)×l00%；生化妊娠率=生化妊娠周期數(shù)/ 妊娠周期數(shù)；流產(chǎn)率=孕28周前流產(chǎn)周期數(shù)/ 臨床妊娠周期數(shù)。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料用表示，比較采用單項方差分析；計數(shù)資料用率（比值）表示，比較應(yīng)用卡方檢驗。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

收集在濟寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科就診的207例Y染色體多態(tài)性患者（包括50例46，XY，Y≥18;51例46，XY，Y≤21;36例46，X，Yqs;30例46，X，Yq-;40例，46，X，Yp+），為實驗組。并將Y染色體正常組135例男性納入對照組。

（一）Y染色體多態(tài)性組與Y染色體正常組一般資料比較

比較實驗組與對照組患者：男、女方年齡、不孕年限、竇卵泡數(shù)、女方基礎(chǔ)FSH、LH、HCG日E2日子宮內(nèi)膜厚度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 Y染色體多態(tài)性組與Y染色體正常組一般資料比較

（二）比較實驗組與對照組患者

實驗組與對照組相比，精液參數(shù)中，精液量、差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。精子濃度、前向運動精子率(PR)、正常形態(tài)率、精子存活率、對照組組高于實驗組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表2 實驗組與對照組患者基本情況比較

（三）Y染色體多態(tài)性組與染色體正常組精子功能的比較

Y染色體多態(tài)性組有10例、Y染色體正常組有1例精子濃度過低，由于無法繼續(xù)進行精子功能試驗，故將此11例患者剔除出去。其中對比Y染色體多態(tài)性組與Y染色體正常組精子功能指標(biāo)發(fā)現(xiàn)：Y染色體多態(tài)性組的頂體酶活性、精子-透明質(zhì)酸結(jié)合率小于Y染色體正常組，Y染色體多態(tài)性組的DNA碎片、核蛋白組異常率，型大于Y染色體正常組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

表3 Y染色體多態(tài)性組與Y染色體正常組患者精子功能比較

（四）Y染色體多態(tài)性組與Y染色體正常組IVF-ET和ICSI-ET妊娠結(jié)局的比較

IVF-ET組當(dāng)中Y染色體多態(tài)性組的受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、著床率、臨床妊娠率小于對照組，生化妊娠率大于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而卵裂率兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1。ICSI-ET組染色體多態(tài)性組與對照組的受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、著床率、生化妊娠率、臨床妊娠率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2。

圖1 Y染色體多態(tài)性組與染色體正常組IVF-ET妊娠結(jié)局的比較

圖2 Y染色體多態(tài)性組與染色體正常組ICSI-ET妊娠結(jié)局的比較

（五）Y染色體多態(tài)性組與Y染色體正常組對子代影響

Y染色體多態(tài)性組流產(chǎn)率高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而兩組早產(chǎn)率、后代出生體重（3.12kg±0.79 vs 3.20kg±0.56）、雙胎妊娠率、男嬰比例、出生缺陷率兩兩比較后顯示無統(tǒng)計學(xué)差異，見圖3。

圖3 Y染色體多態(tài)性組與Y染色體正常組對子代影響

討論

Y染色體是最小的近端著絲粒染色體，其上有睪丸決定因子及系列與精子發(fā)生相關(guān)的基因，在人群中Y染色體的長度具有很大的變異性，主要是因為Y染色體長臂長度的差異引起。人類Y染色體很大部份是異染色質(zhì)，極易發(fā)生形態(tài)學(xué)的變化。Y染色體異常包括46，XY，Y ≥18；46，XY，Y ≤21;46，X，Yqs;46，X，Yq-及46，X，Yp+等，這些基因的突變、缺失可導(dǎo)致男性不育，也可導(dǎo)致妻子復(fù)發(fā)性流產(chǎn)或胎兒畸形等的發(fā)生[4-6]。然而有關(guān)Y染色體異常對男性生育的影響也一直存在分歧[7-9]。Y染色體異常以往多認(rèn)為無臨床意義，最近學(xué)者研究表明Y染色體異常對男性不育以及胚胎繼續(xù)妊娠有重要影響[9]。

以往有關(guān)Y染色體異常的研究多集中在Y染色體結(jié)構(gòu)多態(tài)與臨床效應(yīng)關(guān)系的探討，對精子功能的影響未見有相似報道。同時為了更好地衡量Y染色體多態(tài)性對男性生育能力以及預(yù)測生殖結(jié)局，我們對Y染色體多態(tài)性的男性不育患者進行精子功能檢測，其中精子頂體酶是存在于精子頂體內(nèi)的一種與精子頂體膜相連的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，以酶原形式合成并儲存在頂體內(nèi)，是受精過程中的關(guān)鍵酶，當(dāng)精卵結(jié)合發(fā)生頂體反應(yīng)時，頂體酶原釋放，為精卵結(jié)合提供條件。頂體酶的作用是使精子穿過透明帶，同時能降低宮頸粘液的粘度，提高精子穿過宮頸粘液的能力。頂體酶活性低下會影響卵細(xì)胞卵丘的分解及精子對卵細(xì)胞透明帶的穿透，從而導(dǎo)致男性不育。具有一定數(shù)量和運動能力的精子是受精的前提，而具有正常的精子形態(tài)和頂體酶活性是必要條件。因此頂體酶活性是判斷精子生育力很有價值的一項指標(biāo)，可以有效彌補精液常規(guī)分析僅能了解男性的一般生育力。精子染色質(zhì)及DNA完整性是保證遺傳信息準(zhǔn)確傳遞的物質(zhì)基礎(chǔ)。精子核成熟過程中，經(jīng)歷了組蛋白-過渡蛋白-魚精蛋白的核蛋白組型轉(zhuǎn)換，在此過程中85%的組蛋白被魚精蛋白取代，核蛋白組型轉(zhuǎn)換異常可阻礙魚精蛋白與DNA的正常結(jié)合，使精子DNA穩(wěn)定性降低。精子-透明質(zhì)酸結(jié)合試驗(hyaluronan binding assay,HBA)作為一種簡便易行的精子功能檢測方法,可用于評估活動精子的成熟度,精子DNA損傷是影響男性生育能力，導(dǎo)致男性不育的重要原因。因此，精子DNA損傷程度的檢測在不育患者的治療、生育力和輔助生殖預(yù)后的評估中占有極其重要的地位。關(guān)于精子DNA損傷的機制尚無統(tǒng)一的定論，精子核蛋白組型異常是其可能機制之一。精子與透明質(zhì)酸(hyaluronicacid,HA)的結(jié)合能力,可以客觀反映精子的成熟度。王金香等[10]研究顯示,精子-透明質(zhì)酸結(jié)合率＜65%時,總受精率和正常受精率均顯著降低(P＜0.01),建議即使精液常規(guī)參數(shù)正常,也應(yīng)謹(jǐn)慎選擇IVF。本研究發(fā)現(xiàn)在少弱精子癥患者當(dāng)中，Y染色體多態(tài)性比例要明顯高于Y染色體患者，并且Y染色體多態(tài)性組的頂體酶活性、精子-透明質(zhì)酸結(jié)合率小于Y染色體正常組，Y染色體多態(tài)性組的DNA碎片、不成熟核蛋白組型大于Y染色體正常組，提示：Y染色體多態(tài)性可能會導(dǎo)致精子發(fā)生障礙，從而對精子質(zhì)量產(chǎn)生一定影響。同時對精子受精能力會產(chǎn)生一定影響。

而隨著體外受精胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transplantation，IVF-ET）以及卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI）在男性不育患者中的應(yīng)用，對于一些由Y染色體異常導(dǎo)致無精子癥和嚴(yán)重少精子癥的男性患者可以此獲得生育。但是這類技術(shù)的應(yīng)用繞過了自然受精過程中對精子的自然選擇過程是否對輔助生殖妊娠結(jié)局以及對出生后代會產(chǎn)生不良的影響目前仍不明朗。不同于以往的研究[11]，為了更準(zhǔn)確反映Y染色體多態(tài)性對IVF/ICSI-ET結(jié)局的影響，我們將研究對象分為IVF診療組以及ICSI治療組，來分析Y染色體多態(tài)性對IVF/ICSI-ET結(jié)局的影響。

本研究中,在實行IVF診療組當(dāng)中Y染色體多態(tài)性患者的受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率、著床率低于Y染色體正?；颊?，而卵裂率無明顯差異。在實行ICSI治療組，Y染色體多態(tài)性患者的受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率、著床率與Y染色體正?；颊呦啾?，無明顯差異。這與Hong的研究[12]相似，提示部分Y染色體多態(tài)性患者雖然精液常規(guī)參數(shù)正常，但其潛在的受精能力可能降低，所以導(dǎo)致IVF診療組Y染色體多態(tài)性患者的妊娠結(jié)局不良，提示Y染色體多態(tài)性對男性不育患者的IVF-ET或ICSI-ET妊娠結(jié)局有不良，影響其機制尚不能完全明了。有研究顯示[13]：Y染色體異染色質(zhì)的變化可以導(dǎo)致臨近相關(guān)基因的不表達或者引起細(xì)胞分裂過程錯誤，影響細(xì)胞分化和基因調(diào)節(jié)，導(dǎo)致精子生成障礙并影響精子的受精能力。

有研究顯示[14]：Y染色體異染色質(zhì)的變化可以導(dǎo)致不育、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、胚胎丟失和胎兒發(fā)育異常，陳詠健[15]對1例46，XY，Yqh+患者受精后第3d胚胎進行熒光原位雜交分析(FISH)，認(rèn)為大Y患者胚胎非整倍體發(fā)生率增高可能是導(dǎo)致其不良孕產(chǎn)史的原因。同時本研究發(fā)現(xiàn)Y染色體多態(tài)性患者的流產(chǎn)率高于Y染色體正?；颊撸町愑薪y(tǒng)計學(xué)意義。提示Y染色體多態(tài)性患者流產(chǎn)率的增加可能是非整倍增加等原因。這與Halliday J[16]研究相似。但本研究也發(fā)現(xiàn)Y染色體多態(tài)性患者的早產(chǎn)率、出生體重、雙胎妊娠率、男嬰比例、出生缺陷率與Y染色體正?；颊呦啾?，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，這與Nagvenkar P[17]的研究相似，這提示Y染色體多態(tài)性可能對后代軀體發(fā)育以及性別比例等無明顯不良影響，要得到具有更具有臨床參考價值的結(jié)論還需要更大樣本的進一步研究。

綜上所述，Y染色體多態(tài)性患者可能對男性生育能力有一定的影響。對于IVF治療結(jié)局不良的Y染色體多態(tài)性患者，實行ICSI受精可能會改善其助孕治療結(jié)局，由于本研究中染色體多態(tài)性的樣木量不夠充足，因此，需要更大的樣本量和更敏感的研究方法進行進一步的研究。