馬 婧 鄧佩佩 張展羽 張文昊 宋瀟瀟 劉 杰 張香改 韓瑞鈺

河北省計劃生育科學(xué)技術(shù)研究院，國家衛(wèi)生健康委員會計劃生育與優(yōu)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北省生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（石家莊，050071）

男性不育是一個嚴(yán)重的健康問題，全球大約有2000多萬男性被困擾，它是由多種因素引起的，包括遺傳異常、免疫或內(nèi)分泌疾病、精索靜脈曲張等等，其中有60%～75%找不到病因，主要表現(xiàn)為無精子癥或少弱精子癥。其中無精子癥除少部分是由于染色體或者Y染色體異常導(dǎo)致，大多數(shù)仍無法明確病因。男性不育是一種具有遺傳基礎(chǔ)的復(fù)雜疾病，精子發(fā)生過程中受許多基因調(diào)控，基因變異均可導(dǎo)致精子發(fā)生過程中斷，影響精子的生成，目前敲除基因鼠模型的研究表明許多基因與無精子癥有關(guān)，也有臨床報道顯示很多基因變異會導(dǎo)致男性不育[1-2]。本研究對9例無精子癥患者進(jìn)行男性不育相關(guān)基因檢測，了解無精子癥患者基因變異情況，為無精子癥患者的診斷與治療提供指導(dǎo)。

資料與方法

一、研究對象

選取9例在河北省生殖醫(yī)學(xué)中心就診的男性無精子癥患者，排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）梗阻性無精子癥；（2）染色體及Y染色體微缺失（Azoospermia factor,AZF）結(jié)果異常；（3）由勃起功能障礙、性欲喪失、無性高潮、逆行射精、無射精、先天性輸精管缺失、輸精管切除術(shù)、外傷或感染引起的機(jī)械性梗阻等原因?qū)е碌臒o精子癥；（4）由化療或放療、創(chuàng)傷性或感染性睪丸炎、精索靜脈曲張、雙側(cè)隱睪等原因?qū)е碌臒o精子癥。

二、激素檢查

空腹8～12h，抽取清晨靜脈血3mL，置于促凝管,室溫靜置1h后離心取血清備用。采用化學(xué)發(fā)光免疫分析方法測定血清促卵泡生成素(Follicle Stimulating Hormone,FSH)、促黃體生成素(Luteinizing Hormone,LH)、睪酮(Testosterone，T)、雌二醇(Estradio E2)、泌乳素(Prolaction,PRL)、孕酮（Progesterone,P）水平。

三、男性不育基因檢測

提取研究對象外周血DNA，經(jīng)片段化，使用男性不育基因篩查Panel進(jìn)行文庫的構(gòu)建以及目標(biāo)區(qū)域捕獲（億康基因），在Illumina測序儀Nextseq 550平臺進(jìn)行測序，并對目標(biāo)區(qū)域的覆蓋度及測序質(zhì)量進(jìn)行評估，將測序數(shù)據(jù)與人類基因組hg19參考序列進(jìn)行比對，篩選出罕見變異，并與臨床數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫（clinval,OMIM等）進(jìn)行比對，運(yùn)用PolyPhen2、SIFT、Mutation Taster軟件預(yù)測蛋白功能。根據(jù)ACMG指南對變異位點(diǎn)進(jìn)行評估，進(jìn)行臨床意義注釋。

結(jié)果

一、研究對象一般資料

9例研究對象均為無精子癥患者，年齡在25～37歲，研究對象均進(jìn)行了染色體核型分析和AZF檢測，未發(fā)現(xiàn)異常，9例患者激素水平均出現(xiàn)異常，其中8例樣本的E2水平均升高，4號樣本的促性腺激素水平及睪酮水平均降低，研究對象詳細(xì)信息見表1。

表1 9例無精子癥患者信息

二、基因變異位點(diǎn)篩選結(jié)果

共檢測出9個基因27個變異位點(diǎn)與精子發(fā)生障礙相關(guān)；共9例標(biāo)本，每個標(biāo)本均發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)；除1號樣本，其余8例樣本中均發(fā)現(xiàn)與生精障礙相關(guān)的基因變異位點(diǎn)2個及以上，其中2、3、4、6、7、8號樣本中含有≥2個與精子發(fā)生障礙相關(guān)基因突變。3例樣本檢測出可能導(dǎo)致疾病的突變，4號樣本KAL1基因的c.409C＞T（p.P137S）半合子變異，7號樣本USP9Y基因c.1385C＞G（p.S462C）半合子變異，8號樣本SOHLH1基因c.529C＞A（p.P177T）雜合變異及TEX15基因c.629A＞G（p.Y210C）和c.5263G＞T（p.A1755S）復(fù)合雜合變異。兩例樣本檢測出DNAH1基因復(fù)合雜合變異，5號樣本 DNAH1基因 c.10080G＞C（p.Q3360H）、c.11230C＞T（p.R3744C）、c.1321G＞C（p.V441L）、c.3853C＞T（p.R1285W）復(fù)合雜合變異，9號樣本DNAH1基因c.8266G＞A（p.V2756M）、c.2744A＞G（p.N915S）、c.569T＞C（p.I190T）、c.1244A＞G（p.K415R）、c.1981A＞G（p.M661V）復(fù)合雜合變異，詳細(xì)信息見表2。

討論

男性不育是一個復(fù)雜的病理變化，涉及很多基因，目前已知的人類睪丸富集基因有2300個，這些基因中任何一個基因的變異都會影響到男性生育，本研究對9例無精子癥患者進(jìn)行精子發(fā)生障礙相關(guān)基因檢測，發(fā)現(xiàn)9例患者均攜帶有基因變異位點(diǎn)，除1號樣本，其余8例樣本中均發(fā)現(xiàn)與生精障礙相關(guān)的基因變異位點(diǎn)2個及以上，其中2、3、4、6、7、8號樣本中含有≥2個與精子發(fā)生障礙相關(guān)基因突變。無精子癥患者基因變異可能不是單純一個基因變異引起，為多個基因協(xié)同作用引起。本研究中2、3、6號樣本檢出是多個基因的雜合變異，這些基因均是隱性遺傳，單獨(dú)基因雜合變異不引起疾病，但多個基因的雜合變異是否有累計效應(yīng)，導(dǎo)致患者出現(xiàn)無精子癥，還需要進(jìn)一步研究證明。

USP9Y基因是AZFa區(qū)最早被發(fā)現(xiàn)的與男性不育有關(guān)的候選基因，是泛素特異性蛋白酶[3]，通過水解精子變態(tài)過程的泛素蛋白質(zhì)，促進(jìn)精子細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒炀?，保證正常的精子發(fā)生。Sun等[4]發(fā)現(xiàn)USP9Y基因一個4 bp堿基的缺失可產(chǎn)生一個截短蛋白，影響精子發(fā)生。Luddi等[5]人在一名正常精子男性及其兄弟和父親身上發(fā)現(xiàn)了AZFa區(qū)域包含USP9Y基因的缺失,認(rèn)為USP9Y對人類正常的精子產(chǎn)生和生育能力并不是必不可少的。本研究中7號樣本發(fā)現(xiàn)USP9Y基因c.1385C＞G（p.S462C）半合子變異，該變異在HGMD數(shù)據(jù)庫未見收錄，也未有相關(guān)文獻(xiàn)報道，且在東亞人群中的頻率較低，通過計算機(jī)軟件預(yù)測為有害變異，但其致病性需要進(jìn)一步驗(yàn)證。同時在7號樣本也有其他4個基因的變異，是否有累計效應(yīng)，需進(jìn)一步驗(yàn)證。SOHLH1基因在未分化精原細(xì)胞的早期睪丸發(fā)育中表達(dá)，是精子發(fā)生的重要調(diào)節(jié)因子[6]。Nakamura等[2]和Choi等人[7]均在非阻塞性無精子癥患者中發(fā)現(xiàn)SOHLH1基因c.346-1G-A剪接位點(diǎn)突變。TEX15基因表達(dá)于精原細(xì)胞和早期精母細(xì)胞，TEX15基因的改變或缺失會引起小鼠精子生成障礙[8]，且多數(shù)文章中報道了在無精子癥患者中發(fā)現(xiàn)TEX15基因的變異[9-10]。本研究中發(fā)現(xiàn)8號樣本SOHLH1基因c.529C＞A（p.P177T）雜合變異及TEX15基因c.629A＞G和c.5263G＞T復(fù)合雜合變異，變異在HGMD數(shù)據(jù)庫未見收錄，也未有相關(guān)文獻(xiàn)報道，根據(jù)現(xiàn)有的證據(jù)，定義該變異為臨床意義不明變異。KAL1基因編碼anosmin-1，這是一種神經(jīng)細(xì)胞粘附分子，基因致病變異可導(dǎo)致低促性腺激素性性腺功能減退癥，主要特征在男性中會出現(xiàn)單側(cè)或雙側(cè)隱睪，小睪丸，精子缺乏，小陰莖，促性腺激素及睪酮水平較低等。本研究中4號樣本發(fā)現(xiàn)KAL1基因的c.409C＞T（p.P137S）半合子變異，且該患者的FSH、LH、T水平均較低，該變異在HGMD數(shù)據(jù)庫未見收錄，也未有相關(guān)文獻(xiàn)報道，通過計算機(jī)軟件（Mutation Taster）預(yù)測為有害變異，可能為該基因突變導(dǎo)致患者無精子癥。

DNAH1基因是其中一個動力蛋白基因，它編碼了一個內(nèi)部動力蛋白臂重鏈，有證據(jù)表明DNAH1基因的純合或復(fù)合雜合突變引起一種由精子鞭毛的多種形態(tài)異常引起的男性不育癥。多數(shù)研究顯示該基因變異可導(dǎo)致精子鞭毛形態(tài)異常，Benkhelifa等[11]在18名鞭毛形態(tài)異?；颊咧邪l(fā)現(xiàn)有5名受試者（占28%）在DNAH1中攜帶純合變異體。Wang等[12]對9名鞭毛形態(tài)異常的中國不育男性進(jìn)行了全外顯子組測序，在4名男性中發(fā)現(xiàn)DNAH1基因2-bp缺失的純合變異。也有報道顯示無精子癥和動力蛋白基因變異之間可能存在聯(lián)系，Yang等[13]調(diào)查200例非梗阻性無精子癥病例DNAH1變異的患病率，2.09%的患者被發(fā)現(xiàn)攜帶DNAH1變異，3例無精子癥患者檢測到4種致病變異。本研究中發(fā)現(xiàn)5號及9號樣本DNAH1基因多個突變位點(diǎn)，5號樣本c.10080G＞C、c.11230C＞T、c.1321G＞C、c.3853C＞T復(fù)合雜合變異，9號樣本c.8266G＞A、c.2744A＞G、c.569T＞C、c.1244A＞G、c.1981A＞G復(fù)合雜合變異。變異在HGMD數(shù)據(jù)庫未見收錄，也未有相關(guān)文獻(xiàn)報道。通過計算機(jī)軟件預(yù)測預(yù)測為有害變異，根據(jù)現(xiàn)有的證據(jù)，定義該變異為臨床意義不明變異。這兩例標(biāo)本是否因?yàn)镈NAH1基因變異引起的無精子癥需要進(jìn)一步研究證明。

綜上所述，本研究中發(fā)現(xiàn)USP9Y、SOHLH1、TEX15、KAL1基因的新發(fā)突變，但其致病性還需要進(jìn)一步研究證實(shí)，由基因突變導(dǎo)致的男性精子發(fā)生障礙，可能不是單一基因突變導(dǎo)致，可能是由多個基因變異的累計效應(yīng)引起，多個基因變異的累計效應(yīng)在男性精子發(fā)生障礙中的作用應(yīng)引起重視，同時DNAH1基因變異可能與無精子癥密切相關(guān)，DNAH1基因變異在無精子癥患者中的作用需要進(jìn)一步研究證明。